一種雙效腫瘤細胞疫苗及其製備方法
2023-05-22 05:27:11
專利名稱：一種雙效腫瘤細胞疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞疫苗的製備方法，具體的講，它是一種由腫瘤抗原和血管內皮細胞共同組成的聯合疫苗，同時兼具刺激機體抗腫瘤免疫反應和抗腫瘤血管生成的雙重效應。
背景技術：
到目前為止，人類還沒有攻克癌症。但生物醫學領域裡，治療性腫瘤疫苗和抗血管生成治療給治療腫瘤帶來了新的希望。治療性腫瘤疫苗的理論基礎在於腫瘤組織含有與正常組織不同的腫瘤相關抗原(TAA)，這些抗原作為免疫原能夠激起機體的抗腫瘤免疫反應，包括體液免疫(生成抗體)和細胞免疫(產生腫瘤特異的細胞毒性T殺傷細胞——CTL)，從而殺傷腫瘤細胞。抗血管生成治療是通過破壞腫瘤組織的血管系統，或抑制腫瘤新生血管，從而使腫瘤在不斷增長的過程中，因得不到足夠的營養物質和氧而死亡。
治療性的腫瘤疫苗可以採用多種形式，包括自體、異體的腫瘤細胞、發現的腫瘤相關抗原的蛋白、多肽、DNA、RNA等，或它們的組合形式，這些方式都在動物試驗或臨床試驗中可以誘導抗腫瘤的免疫反應(Current Developments in Cancer Vaccines and CellularImmunotherapy.Ribas A，Butterfield L H.，Glaspy J A，et al.Economou J Clin Oncol，2003；21(12)2415-2432)。
腫瘤細胞或腫瘤相關抗原，雖然能夠激發機體的抗腫瘤免疫反應，但由於腫瘤的抗原性很弱，在絕大多數情況下，其誘導的免疫反應不足以清除體內的腫瘤細胞，於是，人們通過各種辦法來提高腫瘤的抗原性，主要包括1)增加一種或幾種免疫佐劑(如BCG、細菌細胞壁等)；2)加入增強免疫的細胞因子或導入能夠表達細胞因子(如GM-CSF、IL-18、IL-12等)的基因；3)導入與抗原呈遞有關的細胞表面分子(如B7、MHC II、等)的基因；4)與抗原呈遞細胞(APC)聯合使用，如以細胞裂解物、RNA、多肽、DNA、基因載體攜帶等多種形式體外刺激APC，或將腫瘤細胞與APC融合，此外，還可以將前述增強免疫的細胞因子、細胞表面抗原的基因導入APC。以上這些方法都在一定程度上提高了腫瘤的抗原性，但仍然未能顯著的提高療效。
在正常成年人體內，血管生成(angiogenesis)的過程只存在於妊娠、炎症、損傷修復、和腫瘤這幾種情況，新生的血管內皮細胞表面會表達不同於成熟血管內皮細胞的抗原，或過量表達促進新生血管的表面抗原，如VEGFR等。大量實驗和臨床資料證實，針對新生血管抗原的抗血管內皮細胞抗體和一些靶向性小分子化合物可以抑制腫瘤新生血管的生成，而對於正常的成熟血管內皮細胞則沒有明顯的副作用(Sandler AB，Johnson DH，Herbst RS.Anti-vascular endothelial growth factor monoclonals in non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res.200415；10(12 Pt 2)4258s-4262s.)，因此抗血管生成的治療策略在腫瘤治療中是安全和有效的(Benouchan M，Colombo BM.Anti-angiogenic strategies for cancer therapy.Iht J Oncol.2005；27(2)563-71)。除了抗體和小分子外，微血管內皮細胞也可以作為免疫原，通過激起機體的抗血管內皮細胞免疫反應來抑制腫瘤血管生成，同樣達到治療腫瘤的目的(Okaji Y，Tsuno N H，Kitayama J，et al.Vaccination with autologous endothelium inhibits angiogenesis and metastasis ofcolon cancer through autoimmunity.Cancer Sci 2004 95(1)85-90；Wei YQ，Wang QR，Zhao X，et al.Immunotherapy of tumors with xenogeneic endothelial cells as a vaccine.Nature Med 20006(10)1160-1166；血管內皮細胞異種免疫疫苗及其製備方法(中國)公開(公告)號1276245申請(專利)號99114912.2)。
實驗發現，在治療腫瘤的過程中，腫瘤抗原誘導的免疫反應與抗血管生成治療之間具有協同效應，兩者同時使用，可以明顯增強療效。這可能是由於血管內皮細胞除了形成血管的功能外，還具有重要的免疫功能，它能夠呈遞抗原(Cook-Mills JM，Deem TL.Activeparticipation of endothelial cells in inflammation.J Leukoc Biol.2005；77(4)487-95.Epub 2005Jan 3.Review.)，誘導免疫反應，因此與腫瘤抗原混合後，可以進一步提高腫瘤抗原的抗原性。
腫瘤疫苗中，常常使用自體腫瘤細胞作為腫瘤抗原，因為，腫瘤是一種異質性疾病，每個患者的腫瘤都不同，即使臨床診斷相同，其含有的腫瘤抗原也不完全相同，自體腫瘤細胞的特點在於提供患者的全部腫瘤抗原，因此最大限度的誘導針對患者腫瘤的免疫反應，自體腫瘤細胞的缺點在於數量有限，不可以大量傳代培養，不可以進行穩定的基因修飾，更重要的是為了增強疫苗的療效，往往需要對細胞進行基因修飾等處理，而自體細胞的個體差異導致基因修飾等處理的效果相差很遠，例如，基因修飾後外源基因的表達量可以相差數百倍，甚至上千倍，這種差異導致疫苗的質量和療效極不穩定。為了解決這個問題，在修飾基因的表達產物為分泌型的情況下，往往可以使用一種bystander細胞株，例如K562、人成纖維細胞等，並可以對這些細胞進行基因修飾等複雜，而對於自體的原代腫瘤細胞則只需要分散成單細胞即可，然後將兩者混合，這樣做的好處在於既可以進行基因修飾等複雜的處理以提高療效，又可以最大限度的減少對自體腫瘤細胞的操作，從而保障疫苗質量的穩定性，進而保障療效的穩定(Emens LA，Armstrong D，Wolff A，et al.A phase I vaccine safety andchemotherapy dose-finding trial of an allogeneic GM-CSF-secreting breast cancer vaccine given ina specifically timed sequence with immunomodulatory doses of cyclophosphamide and doxorubicin.Hum Gene Ther.2004；15(3)313-37.)。
發明內容
本專利公開的發明在於一種將血管內皮細胞和腫瘤抗原混合後作為腫瘤疫苗的方法，其中腫瘤抗原的形式可以有多種，包括滅活的自體、異體腫瘤細胞、腫瘤相關抗原多肽、DNA、RNA、腫瘤細胞裂解物、抗原蛋白質等；本發明使用的血管內皮細胞為人或其他哺乳動物的血管內皮細胞(如人皮膚微血管內皮細胞，原代的或永生化的)，經過滅活後喪失繼續增殖能力，其在疫苗中具有三方面的作用，其一為誘導機體的抗血管內皮免疫反應，破壞腫瘤血管，或抑制腫瘤的新生血管生成；其二為與腫瘤抗原混合使用的過程中，呈遞腫瘤抗原，增強特異性抗腫瘤細胞的免疫反應。其三永生化的血管內皮細胞株，可以傳代擴增和規模化生產，因此可以作為Bystander細胞株，用於進行基因修飾等複雜處理，從而減少對腫瘤細胞的操作，保障疫苗質量和療效的穩定性。因此內皮細胞與腫瘤抗原之間具有協同作用。
為了進一步增強療效，在本發明所述的腫瘤疫苗中，還可以添加免疫佐劑、細胞因子，或導入增強免疫的細胞因子或免疫細胞表面分子的基因。這些基因或蛋白質可以先與腫瘤抗原結合或與血管內皮細胞結合，須根據基因的功能特點而決定。例如，GM-CSF是在疫苗設計中常用的細胞因子，它可以趨化注射部位附近的樹突細胞，並促使其分化成熟，從而增加抗原的呈遞，增強免疫反應；因此可以將分泌型GM-CSF基因導入血管內皮細胞或腫瘤細胞，或與腫瘤抗原肽結合成融合蛋白。
也可以將GM-CSF基因通過藥物加壓的方式壓入永生化的人微血管內皮細胞株，再與適量的原代腫瘤細胞分別滅活、混合後製成疫苗。這種疫苗的優勢在於1)聯合抗血管生成和抗腫瘤免疫反應的治療策略，獲得協同效應；2)血管內皮細胞在刺激抗血管生成的免疫反應的同時，呈遞腫瘤細胞抗原，增強免疫效果；3)血管內皮細胞分泌的GM-CSF，可以趨化注射部位附近的樹突細胞，並促使其分化成熟，進一步增強抗原呈遞功能；4)基因修飾的方法與直接應用蛋白質相比，可以有效延長GM-CSF的表達和作用時間，從而延長疫苗的作用時間；5)與自體的樹突細胞疫苗方案相比，導入基因的血管內皮細胞株可以工業化生產，有利於疫苗的質量控制和標準化。
本發明所述的新型腫瘤疫苗，不但能夠顯著的誘導CD4+和CD8T+細胞依賴的抗腫瘤免疫反應，以及大量的腫瘤抗原特異的CD8+T殺傷細胞，同時還能顯著抑制腫瘤新生血管的生成，抑制腫瘤的發生、發展。這種疫苗在治療現有腫瘤、預防腫瘤復發和轉移方面作用明顯，同時不會引起嚴重的不良反應。
本發明中使用的血管內皮細胞可以有多種來源，包括但不限於以下幾種患者自體的腫瘤組織內的血管內皮細胞、患者自體的皮膚微血管內皮細胞、同種異體的原代血管內皮細胞、同種異體的永生化的血管內皮細胞株(為腫瘤基因，如SV40大T抗原，或端粒酶永生化的人血管內皮細胞)、異種原代血管內皮細胞、異種血管內皮細胞株。
本發明對使用的腫瘤抗原沒有特別的限制包括從患者腫瘤組織中新鮮分離的自體原代腫瘤細胞、體外培養的腫瘤細胞株；經過基因或半抗原(如hapten)修飾的腫瘤細胞、腫瘤細胞裂解物、體外表達的腫瘤相關抗原、如CEA、PSA等，或這些抗原多肽片斷、融合蛋白(多種多肽、或與細胞因子融合)；包含腫瘤相關抗原基因或融合基因的質粒DNA，RNA.
本發明對疫苗使用的佐劑沒有特別的限制包括BCG、GM-CSF、細菌細胞壁成分、半抗原、痘病毒、新城疫雞瘟病毒。
本發明對導入血管內皮細胞或腫瘤細胞的免疫增強基因沒有特別的限制，包括但不限於IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，IFN.alpha.，IFN.beta.，IFN.gamma.，TNF，TGF，GM-CSF，B7.1，B7.2，CD40，Light，Ox40，4.1.BB，Icos L，SLAM，ICAM 1，LFA-3，B7.3，CD70，HSA，CD84，CD7，B7RP-1L，MAdCAM-1，VCAM-1，CS-1，CD82，CD30，CD120a，CD120b and TNFR-RP，CD40L.或它們的組合。
對血管內皮細胞和/或腫瘤細胞進行的基因修飾可以採用多種常規使用的方法，例如重組腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、非病毒載體、質粒DNA；其中質粒DNA通過脂質體、基因槍、電穿孔等方法導入細胞，並可以通過dhfr-MTX、neo-G418、HPH-潮黴素B、TK或ADA系統中的一種或幾種，進行藥物加壓，篩選得到穩定表達導入基因的細胞株。
血管內皮細胞或/和腫瘤細胞在經過修飾、處理後，在注射人體之前，通常需要經過滅活的步驟。在本發明中，常用的滅活方法均可以採用，包括化學滅活法，如絲裂黴素、福馬林；物理滅活法，如加熱法、射線照射法，射線的劑量一般在1000-100,000Rad，以10,000-50,000Rad最佳。
疫苗的效果可以通過檢測抗原四聚體(tetramer)的方法來評估疫苗誘導產生的抗原特異的T殺傷細胞的量。四聚體是由抗原肽、標記生物素的MHC-I分子、微球蛋白和辣根酶組成的。
經過上述一種或幾種處理的血管內皮細胞，一般保存在冷凍的環境(液氮或超低溫冰箱中)，使用前將其從冷凍環境取出，迅速在室溫～40℃的環境中融化，再與腫瘤抗原混合後注射人體，用於治療或預防腫瘤。
經過上述一種或幾種處理的腫瘤抗原，如為細胞、可溶性蛋白、多肽、DNA、RNA，一般也保存在冷凍環境，使用前將其從冷凍環境取出，迅速在室溫～40℃的環境中融化，再與內皮細胞混合。如果抗原的形態是凍幹製劑，在使用前需要用注射用水或其他溶劑溶解後使用。
血管內皮細胞也可以與腫瘤抗原在製備的過程中事先混合，然後冷凍保存(液氮或超低溫冰箱中)，使用前取出融化即可。
疫苗的有效劑量是指能夠產生治療、改善、預防腫瘤的效果的疫苗劑量，精確的劑量與患者的體重、健康狀況、疾病狀態、治療組合密切相關，因此無法實現統一規定，臨床醫生可以依據常規經驗和患者使用後的療效、反應來調整後續治療的劑量。
在本發明中，血管內皮細胞的劑量一般在每次注射105～108細胞，以106～107細胞為更佳，確定患者的血管內皮細胞用量後，再根據腫瘤抗原與血管內皮細胞的比例，確定腫瘤抗原的劑量。例如以患者自體的腫瘤細胞為腫瘤抗原，則腫瘤細胞與血管內皮細胞的比例應在10∶1～0.1∶1之間，其中以5∶1～1∶1之間為佳。
疫苗的製劑組成包括治療或預防劑量的血管內皮細胞、腫瘤抗原、基因表達載體、付型劑、佐劑、基因、蛋白質或多肽等輔助成分。
製劑的輔助成分包括1)載體成分，如基因修飾過程中使用的基因載體的殘餘成分；2)付型劑，如緩慢代謝的大分子蛋白質、多糖；3)溶液中的鹽、冷凍保護劑(如DMSO、甘油)、白蛋白、蔗糖、乳化劑成分。製劑的最終形式是可注射的含有細胞的液態形式。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中有有關哪些輔助成分可以用於臨床的詳細討論。
本發明所述的新型雙效腫瘤疫苗可以用於人體，或其他哺乳動物；不但可以用於治療多種腫瘤，也可以用於預防腫瘤的復發和轉移。
本發明所述的新型雙效腫瘤疫苗可以單獨使用，或與放療、化療、手術及其他生物治療聯合應用以取得最佳的療效。
使用方法疫苗一旦製成，既可以即刻注射，也可以冷凍保存，在需要使用的時候，融化後注射。由於疫苗中含有完整細胞成分，因此，注射器的針頭應大於20G，以防止注射的過程中損傷細胞。
注射的途徑沒有特殊的限制，包括但不限於以下幾種皮內、皮下、胸腔、腹腔、靜脈、淋巴管、肌肉、腫瘤內注射，其中以腋窩、腹股溝附近的皮內注射為佳，也可以直接口服。
本發明所述的新型雙效腫瘤疫苗可以直接使用，也可以在體外刺激細胞毒性T淋巴細胞，間接使用。
圖1、雙效疫苗預防Lewis肺癌肺轉移實驗中，各實驗組小鼠肺表面結節計數G1PBS對照組；G2雙效腫瘤疫苗治療組；G3單純內皮細胞+BCG治療組。
圖中縱坐標為肺表面結節數，與模型對照組(112±9，P＜0.01)相比，雙效疫苗治療組小鼠的肺表面幾乎沒有腫瘤結節形成(7±5，P＜0.01)，而單純血管內皮細胞+BCG組只能抑制80％的結節形成(25±11，P＜0.01)。
圖2、雙效疫苗預防Lewis肺癌肺轉移實驗中，各實驗組小鼠肺臟大體病理和顯微病理。
A為PBS對照組(G1)的肺臟大體標本，可見大量白色的腫瘤結節；B為雙效疫苗治療組(G2)的肺臟大體標本，幾乎沒有見到結節；C為單純血管內皮細胞+BCG治療組(G3)的肺臟大體標本，可見少量的腫瘤結節。D、E、F分別為上述各組(G1-3)小鼠肺臟的顯微病理，鏡下顯示各組小鼠肺內腫瘤結節的數量與大體標本相符，其中大圖為HE染色(100×)，小圖為吉爾森膠原纖維染色(200×)。
圖3、雙效疫苗預防Lewis肺癌肺轉移實驗中，各實驗組小鼠血清中的抗腫瘤細胞抗體、抗血管內皮細胞蛋白抗體、和抗OVA抗體。
G1PBS對照組；G2雙效腫瘤疫苗治療組；G3單純內皮細胞+BCG治療組。
圖A為各組血清中的抗血管內皮細胞蛋白抗體，可見雙效腫瘤疫苗治療組(G2)和單純血管內皮細胞+BCG治療組(G3)都產生了抗血管內皮細胞蛋白抗體。
圖B為各組血清中的抗B16F10細胞蛋白抗體，可見只有雙效腫瘤疫苗治療組(G2)產生了抗B16F10細胞蛋白抗體。
圖C為各組血清中的抗OVA抗體，同樣只有雙效腫瘤疫苗治療組(G2)產生了抗OVA蛋白抗體。
圖4、雙效疫苗預防B16腫瘤轉移實驗中，各實驗組小鼠肺表面結節計數G1PBS對照組；G2單純B16細胞裂解物治療組；G3雙效腫瘤疫苗治療組。
圖中縱坐標為小鼠肺表面結節數。可見雙效疫苗治療組，與模型對照組和單純B16細胞裂解物治療組進行比較，肺表面結節數僅為13±6，明顯少於模型對照組(136±32，P＜0.01)和單純B16細胞裂解物治療組(128±30，P＜0.01)，差異具有顯著性，而單純B16細胞裂解物則幾乎沒有治療作用(P＞0.05)。
圖5、雙效疫苗治療小鼠B16F10移植瘤模型中，各實驗組的平均腫瘤體積、腫瘤發生率。
▲——G1PBS對照組；●——G2單純血管內皮細胞治療組；◆——G3血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組；○——G4雙效疫苗治療組。
圖A為各實驗組平均瘤體積隨時間變化的曲線，橫坐標為腫瘤細胞接種後的天數，縱坐標為各組平均瘤體積(mm3)，比較可見PBS對照組(G1)＞單純血管內皮細胞治療組(G2)＞血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)＞雙效疫苗治療組(G4)。
圖B為各實驗組腫瘤發生率隨時間變化的曲線，橫坐標為腫瘤細胞接種後的天數，縱坐標為各組的腫瘤發生率(％)，比較可見PBS對照組(G1)＞單純血管內皮細胞治療組(G2)＞血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)＞雙效疫苗治療組(G4)。
圖6、雙效疫苗治療小鼠移植瘤模型中，各實驗組小鼠脾淋巴細胞的CTL檢測。
▲——G1PBS對照組；●——G2單純血管內皮細胞治療組；◆——G3血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組；○——G4雙效疫苗治療組。
圖中橫坐標為效應細胞和靶細胞的比例，縱坐標為採用51Cr釋放試驗檢測CTL的殺傷率(％)，可見PBS對照組(G1)和單純血管內皮細胞治療組(G2)都未能誘導針對B16F10的特異性CTL，而雙效疫苗治療組(G4)和血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)有效誘導了針對腫瘤細胞B16F10的特異性CTL反應，其中雙效疫苗治療組(G4)的作用明顯優於血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)。
圖7、雙效疫苗治療小鼠移植瘤模型中，各實驗組小鼠背部皮下埋植的海藻酸鈣膠囊照片。
圖A為PBS對照組(G1)，可見海藻酸鈣膠囊上大量的新生血管；圖B為單純血管內皮細胞治療組(G2)，可見海藻酸鈣膠囊上新生血管明顯減少；圖C血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)，可見海藻酸鈣膠囊上新生血管明顯減少；圖D為雙效疫苗治療組(G4)，可見海藻酸鈣膠囊上幾乎沒有新生血管。
圖8、雙效疫苗治療小鼠CT26移植瘤模型中，各實驗組的平均腫瘤體積、腫瘤發生率。
◆——G1PBS對照組；■——G2單純CT26腫瘤細胞治療組；▲——G3雙效疫苗治療組。
圖A為各實驗組腫瘤發生率隨時間變化的曲線，橫坐標為腫瘤細胞接種後的天數，縱坐標為各組的腫瘤發生率(％)，比較可見PBS對照組(G1)與單純腫瘤細胞治療組(G2)的發生率類似，而雙效疫苗治療組(G3)的發生率則明顯低於前兩組。
圖B為各實驗組平均瘤體積隨時間變化的曲線，橫坐標為腫瘤細胞接種後的天數，縱坐標為各組平均瘤體積(mm3)，比較可見PBS對照組(G1)與單純腫瘤細胞治療組(G2)的瘤體積類似，而雙效疫苗治療組(G3)的瘤體積則明顯低於前兩組。
圖9、雙效疫苗體外刺激淋巴細胞過繼治療A549移植瘤實驗中，各組的平均瘤體積。
◆——G1PBS對照組；■——G2單純A549細胞刺激的淋巴細胞治療組；▲——G3雙效疫苗刺激的淋巴細胞治療組。
圖中所示為各實驗組平均瘤體積隨時間變化的曲線，橫坐標為腫瘤細胞接種後的天數，縱坐標為各組平均瘤體積(mm3)，比較可見PBS對照組(G1)的瘤體積略大於單純A549細胞刺激的淋巴細胞治療組(G2)的瘤體積，而雙效疫苗刺激的淋巴細胞治療組(G3)的瘤體積則明顯小於前兩組。
具體實施例方式
以下實施例中將進一步具體說明這種雙效疫苗的製備和使用方法，本發明包括但不限於以下實施例中列舉的具體方法。
下面結合附圖對本發明作進一步的描述。
實施例1添加免疫佐劑的血管內皮細胞的製備體外培養(DMEM+10％FBS)的小鼠淋巴結微血管內皮細胞——SVEC4-10，擴增至1×108，以PBS清洗細胞2遍，收集細胞至離心管中，以DMEM重懸至1×107/ml，20000rad照射滅活。加入濃度為1×108/ml的BCG懸液，兩者比例為v∶v＝4∶1，混合後血管內皮細胞的濃度為8×106/ml，BCG的濃度為2×107/ml，然後置於冰上，逐滴加入等體積的凍存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分裝至0.1ml/支，-70℃保存。
實施例2細胞裂解物形態的腫瘤抗原的製備方法在C57小鼠腋下接種Lewis肺癌細胞1×106個，一周後，小鼠腋下形成1cm3瘤塊，切下瘤塊，以眼科剪剪成1mm3醬狀，機械擠壓通過200目細胞篩，或採用Peters等人發表的酶消化法(Cancer Research，391353-1360，1979)，獲得腫瘤單細胞懸液，以PBS清洗細胞2遍。計數，以生理鹽水重懸細胞至1×107/ml，至於-70℃無水乙醇域中20min，取出後，迅速置於37℃水域中10min，取出後振蕩1min，如此往復循環3-6次，至細胞完全破裂，4000rpm離心後取上清，即為腫瘤細胞裂解物。為了便於在實驗中檢測是否形成針對特異抗原的免疫反應，在細胞裂解物中混入OVA 0.1mg/ml，混勻後，分裝成0.1ml/支，凍存在-70℃保存。同樣方法也可以製備B16(黑色素瘤)細胞的裂解物。
實施例3新型雙效疫苗的製備之一每一支雙效疫苗是由一支凍存的內皮細胞(見實施例1)和一支凍存的腫瘤細胞裂解物(見實施例2)在37℃水域融化後混合，然後可以直接用於注射，或在體外刺激CTL。
實施例4新型雙效疫苗預防Lewis肺癌細胞的肺轉移6周齡雄性SPF級C57小鼠30隻，隨機分為3組(G1-3)，每組10隻，G1PBS對照組；G2雙效疫苗治療組；G3單純血管內皮細胞+BCG治療組；在小鼠右腋窩皮下注射疫苗，每周注射一次，每次一支，連續6周。然後尾靜脈注射Lewis肺癌細胞1×105/只，建立肺轉移腫瘤模型，12天後處死小鼠，取下小鼠肺臟，計數肺表面腫瘤結節，檢測肺臟病理。
實驗結果顯示，見圖1，與模型對照組(112±9，P＜0.01)相比，雙效疫苗治療組小鼠的肺表面幾乎沒有腫瘤結節形成(7±5，P＜0.01)，而單純血管內皮細胞+BCG組可以抑制80％的結節形成(25±11，P＜0.01)。圖2顯示各組小鼠的肺臟大體和顯微病理。
實施例5新型雙效疫苗刺激產生抗體ELISA法檢測實施例4中各組小鼠血清中抗SVEC4-10細胞和抗Lewis肺癌細胞可溶性蛋白的抗體、抗OVA抗體。提取SVEC4-10細胞和Lewis肺癌細胞的可溶性蛋白，分別加入ELISA板中，4℃包被過夜，以2.5％BSA室溫封閉30min，洗板三次，風乾，保存於4℃，使用時加入小鼠血清100ul，37℃孵育1小時，洗板三次，加入辣根酶標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育30min，洗板三次，加入底物，室溫避光反應10-30min，450nm檢測OD值。檢測OVA抗體的方法與之相同，只是在ELISA板中包被OVA蛋白。
單純內皮細胞疫苗和雙效疫苗注射後均可刺激機體產生抗血管內皮細胞可溶性蛋白的抗體、雙效疫苗同時還可以刺激產生抗腫瘤細胞可溶性蛋白抗體和抗OVA抗體(見圖3)。
實施例6新型雙效疫苗預防B16黑色素瘤細胞的肺轉移採用與實施例4同樣的方法建立B16細胞的肺轉移模型，然後以雙效疫苗預防肺轉移，與模型對照組和單純B16細胞裂解物治療組進行比較(見圖4)，雙效疫苗治療組的肺表面結節數為13±6，明顯少於模型對照組(136±32，P＜0.01)和單純B16細胞裂解物治療組(128±30，P＜0.01)，差異具有顯著性。
實施例7基因修飾的血管內皮細胞的製備體外培養經SV40大T抗原轉化的人皮膚微血管內皮細胞(HMEC-1)，培養條件是MCDB131(Gibco/BRL 10372)，添加10％FBS、10ng/ml EGF(表皮生長因子)、1ug/ml氫化可的松。
利用二氫葉酸還原酶(dhfr)基因擴增系統，可以建立穩定、高水平表達外源基因的細胞株。以質粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)為骨架，插入hGM-CSF(人粒單細胞集落刺激因子)基因，成為pSV2-GM。以脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen 11668-027)將pSV2-GM質粒轉染HMEC-1細胞，操作方法參見Invitrogen公司說明書。以含有MTX的選擇培養基篩選陽性克隆。使用ELISA試劑盒檢測各陽性克隆細胞的上清中hGM-CSF的表達量。逐步增加MTX的含量至800nM，獲得表達量為1.2ug/106cell/24hr的細胞株。
撤去MTX，該細胞株仍然穩定表達hGM-CSF。將該細胞株培養擴增至1×108，以PBS清洗細胞2遍，收集細胞至離心管中，以DMEM重懸至8×106/ml，20000rad照射滅活。然後將細胞置於冰上，逐滴加入等體積的凍存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分裝至0.1ml/支，-70℃保存。
實施例8腫瘤細胞形態的腫瘤抗原的製備方法在C57小鼠腋下接種B16F10(黑色素瘤)細胞1×106個，一周後，小鼠腋下形成1cm3瘤塊，切下瘤塊，以眼科剪剪成1mm3醬狀，通過200目細胞篩，以PBS清洗細胞2遍。計數，以DMEM重懸至2×107/ml，20000rad照射滅活。將細胞置於冰上，逐滴加入等體積的凍存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分裝至0.1ml/支，-70℃保存。同樣方法也可以製備CT26結腸癌細胞的細胞形態腫瘤抗原。
實施例9新型雙效疫苗的製備之二每一支雙效疫苗是由一支凍存的內皮細胞(見實施例7)和一支凍存的腫瘤細胞(見實施例8)在37℃水域融化後混合，然後可以直接用於注射，或在體外刺激CTL。
實施例10新型雙效疫苗治療B16F10細胞的移植瘤6周齡雄性SPF級C57小鼠40隻，左腋下注射B16F10細胞1×105/只，建立移植瘤模型。將小鼠隨機分為4組，每組10隻，G1PBS對照組；G2單純血管內皮細胞治療組；G3血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組；G4雙效疫苗治療組(見實施例9)。從左腋下注射B16F10細胞，建立移植瘤模型的第3天，在小鼠右腋窩皮下注射疫苗，每周注射一次，每次一支，連續5周，其中G3組小鼠在右腋窩和右側腹股溝皮下分別注射一支內皮細胞(見實施例7)和一支腫瘤細胞(見實施例8)。每隔三天測量各組小鼠腫瘤體積，記錄腫瘤發生率。
實驗結果顯示，雙效疫苗治療組的療效好於其他治療組(見圖5)，腫瘤不發生或生長非常緩慢，比較各組的瘤體積(圖A)G1＞G2＞G3＞G4；比較各組的腫瘤發生率可見(圖B)G1＞G2＞G3＞G4。
實施例11新型雙效疫苗刺激腫瘤特異的細胞毒T淋巴細胞殺傷功能細胞毒T淋巴細胞殺傷功能檢測(CTL試驗)，採用4h51Cr釋放試驗檢測，參照Asada H等人的方法(J Gen Virol，1988，692179-2188)實施例10中，各組小鼠完成疫苗治療後1周，每組隨機取2隻小鼠。無菌條件下解剖小鼠，取脾，剪碎後，加少量Hank′s液，於100目銅網上碾磨分散脾細胞，用淋巴細胞分離液分離製備脾淋巴細胞，用含2μg/ml的ConA、20U/ml IL-2的1640培養液(10％FBS)，37℃5％CO2培養1～2天。
將分離的1×107淋巴細胞與5×105經過照射滅活的B16F10細胞混合培養5天，37℃5％CO2用含20U/ml IL-2的1640培養液(10％FBS)，調節細胞濃度為1×107/ml。使淋巴細胞活化，此即為效應細胞。
收集體外培養的B16F10細胞，用DMEM調細胞濃度為4×106/ml，取0.5ml細胞，加入100uci Na251CrO4，37℃孵育2h進行標記，洗3次後調濃度為1×105cells/ml，此即為51Cr標記的靶細胞。
將靶細胞懸液加入園底96孔培養板中，每孔100μl，設3個復孔，以不同比例加入效應細胞(參照表1)表1
每孔加入100μl，最大釋放組加入100μl 1％ Triton X-100，自然釋放組加入100μl培養基。96孔板水平轉頭500r/min離心5min，37℃5％CO2培養4h～6h；1000r/min離心5min，每孔取100μl上清，Backmen550B型γ計數儀測cpm值。結果以CTL殺傷率表示，按如下公式計算殺傷率％＝(實驗組cpm-自然釋放cpm)×100/(最大釋放cpm-自然釋放cpm)。特異性CTL活性必須滿足如下條件自然釋放cpm值不能大於最大釋放cpm值的30％；對照組的殺傷率在20％以下。各組以每份標本平均值±SD進行統計學處理，以每組最終的平均值作為結果。
51Cr釋放試驗顯示，雙效疫苗能夠有效誘導針對腫瘤細胞的CTL反應，而且作用明顯優於血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(見圖6)。
實施例12新型雙效疫苗刺激細胞毒T淋巴細胞的細胞因子的表達實施例11中，各組小鼠脾淋巴細胞與B16F10細胞共孵育5天後，取細胞上清100μl，用ELISA法檢測上清中IFN-γ和TNF-α的表達量，操作方法參見試劑盒說明書。
ELISA檢測結果顯示雙效疫苗組的脾淋巴細胞經抗原刺激後，分泌的IFN-γ和TNF-α明顯高於其他各組(見表2)。
表2
G1PBS對照組；G2單純血管內皮細胞治療組；G3血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組；G4雙效疫苗治療組。
各組小鼠的脾淋巴細胞經腫瘤細胞B16F10抗原刺激後，分泌IFN-γ和TNF-α，比較各組的分泌量，可見雙效疫苗治療組(G4)＞血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)＞單純血管內皮細胞治療組(G2)和PBS對照組(G1)。
實施例13新型雙效疫苗抑制腫瘤新生血管的生產以1.5％的海藻酸鈉溶液重懸B16F10細胞至1×106/ml待用，250mM氯化鈣溶液加熱至37℃，並以磁力攪拌器攪拌，逐滴加入混有細胞的海藻酸鈉溶液，形成海藻酸鈣膠囊。實施例10中，疫苗注射後一周，每組取2隻小鼠，麻醉後，無菌條件下切開背部皮膚，皮下埋植海藻酸鈣膠囊後縫合。14天後，手術取出埋植的海藻酸鈣膠囊，可見單純血管內皮細胞治療組(G2)和血管內皮細胞與腫瘤細胞抗原分離治療組(G3)的膠囊表面新生血管與對照組(G1)相比明顯減少，而雙效疫苗治療組(G4)則幾乎沒有血管生成(見圖7)。
實施例14新型雙效疫苗治療CT26細胞的移植瘤採用同樣方法建立CT26結腸癌細胞的移植瘤模型，然後以雙效疫苗治療已經建立的移植瘤，與模型對照組和單純CT26結腸癌細胞治療組進行比較，腫瘤的發生率明顯降低，瘤體積也明顯減小(見圖8)。
實施例15新型雙效疫苗的製備之三體外培養的A549(人肺腺癌)細胞，收集至離心管中，計數，以DMEM重懸至2×107/ml，20000rad照射滅活。將細胞置於冰上，逐滴加入等體積的凍存液(20％DMEM+20％DMSO+60％血清)，分裝至0.1ml/支，-70℃保存。由一支凍存的內皮細胞(見實施例7)和一支凍存的A549細胞在37℃水域融化後混合而成一支雙效疫苗。
實施例16雙效疫苗體外刺激淋巴細胞按照常規的方法體外培養人外周血淋巴細胞，以含10％FBS的1640培養基調整細胞濃度為1×106/ml，37℃培養2天。
每100ml淋巴細胞懸液加入一支雙效疫苗(見實施例15)或單純A549細胞進行刺激，輕柔混勻，加入IL-220u/ml，37℃繼續培養10-14天。收集細胞，離心後重懸於生理鹽水，可以直接用於靜脈注射。
實施例17雙效疫苗體外刺激的淋巴細胞治療A549移植瘤4周齡雄性SPF級SCID小鼠30隻，左腋下注射A549細胞1×106/只，建立移植瘤模型。將小鼠隨機分為3組，每組10隻，G1PBS對照組；G2單純A549細胞刺激的淋巴細胞治療組；G3雙效疫苗刺激的淋巴細胞治療組。從左腋下注射A549細胞，建立移植瘤模型的第2天，經尾靜脈注射實施例16中的刺激後的淋巴細胞，每隻小鼠每天注射5×106細胞，連續3天。每隔三天測量各組小鼠腫瘤體積。
實驗結果顯示，雙效疫苗治療組的療效明顯好於其他治療組(見圖9)，腫瘤不發生或生長非常緩慢，比較各組的腫瘤體積可見G1＞G2＞G3。
權利要求
1.一種用於治療腫瘤和預防腫瘤轉移和復發的疫苗，該疫苗包含二個組分a)血管內皮細胞；b)腫瘤抗原。通過刺激機體產生針對腫瘤抗原的免疫反應和抗腫瘤血管生成兩個方面抑制腫瘤，並且兩者之間具有協同作用。
2.根據權利要求1的疫苗，其特徵在於，所述的血管內皮細胞是患者自體的腫瘤組織內的血管內皮細胞、患者自體的皮膚微血管內皮細胞、異體的原代血管內皮細胞、同種異體的永生化的血管內皮細胞、異種原代血管內皮細胞或異種血管內皮細胞株。
3.根據權利要求1的疫苗，其特徵在於，所述腫瘤抗原是來自患者腫瘤組織中新鮮分離的自體原代腫瘤細胞、體外培養的腫瘤細胞株、經過基因或抗原修飾的腫瘤細胞。
4.根據權利要求1的疫苗，其特徵在於，所述腫瘤抗原是腫瘤細胞裂解物、體外表達的腫瘤相關抗原、抗原多肽片斷、多種多肽片段的融合蛋白、多肽與細胞因子組成的融合蛋白，腫瘤抗原DNA、腫瘤組織中提取的RNA或體外轉錄的腫瘤抗原RNA。
5.根據權利要求2和權利要求3的疫苗，其特徵在於，對血管內皮細胞和/或腫瘤細胞進行基因修飾。
6.根據權利要求5的疫苗，所述的用於基因修飾的免疫增強基因為IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，IFN.alpha.，IFN.beta.，IFN.gamma.，TNF，TGF，GM-CSF，B7.1，B7.2，CD40，Light，Ox40，4.1.BB，Icos L，SLAM，ICAM 1，LFA-3，B7.3，CD70，HSA，CD84，CD7，B7RP-1L，MAdCAM-1，VCAM-1，CS-1，CD82，CD30，CD120a，CD120b，TNFR-RP，CD40L中的至少一種。
7.根據權利要求5的疫苗，所述基因修飾的方法是通過重組腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、仙臺病毒載體、非病毒載體、質粒DNA中的至少一種。
8.根據權利要求2和權利要求3的疫苗，其特徵在於，疫苗中血管內皮細胞的劑量為每次注射105～108細胞，腫瘤細胞與血管內皮細胞的比例在10∶1～0.1∶1之間。
9.根據權利要求1-8的疫苗，其特徵在於，所述的腫瘤疫苗用於治療人類或其他哺乳動物的腫瘤，或預防其腫瘤的復發和轉移。
10.根據權利要求1-8的疫苗，其特徵在於，所述的腫瘤疫苗直接使用，或在體外刺激淋巴細胞，間接使用，或與放療、化療、手術及其他生物治療聯合使用。
11.根據權利要求1-8的疫苗，其特徵在於，所述的腫瘤疫苗的給藥途徑包括皮內、皮下、胸腔、腹腔、顱腔、靜脈、淋巴管、肌肉、腫瘤內、腫瘤周圍注射或口服。
全文摘要
本發明公開了一種腫瘤細胞疫苗的製備方法，旨在提供一種治療腫瘤或預防腫瘤轉移和復發的腫瘤疫苗的製備方法，這種腫瘤疫苗不但能夠刺激機體產生抗腫瘤的免疫反應，同時抑制腫瘤的血管生成，從兩個方面協同抑制腫瘤的發生發展，因此稱為雙效腫瘤細胞疫苗。該疫苗由腫瘤抗原和血管內皮細胞兩個組分組成。本發明的主要用途是製備自體或異體腫瘤細胞疫苗；體外誘導製備特異性抗腫瘤CTL，間接刺激免疫反應。
文檔編號A61K45/00GK1899607SQ20051008408
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月18日 優先權日2005年7月18日
發明者康禹 申請人:康禹