花生維生素C合成相關基因AhPMM及其應用的製作方法
2023-05-21 14:53:16 4
花生維生素C合成相關基因AhPMM及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了花生維生素C合成相關基因 AhPMM 及其應用，將該基因在花生中超量表達後，得到總維生素C和還原態維生素C（AsA）含量顯著提高的轉基因植株。實驗證明，將本發明的 AhPMM 基因超量表達可顯著提高花生葉片的維生素C含量，且對花生的正常生長沒有明顯的影響。本發明的蛋白及其編碼基因對於植物維生素C合成機制的研究，以及提高植物的維生素C含量的改良和抗逆性具有重要的理論及實際意義，應用前景廣闊。
【專利說明】花生維生素C合成相關基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，尤其涉及花生維生素C合成相關基因AWW及其應用。
【背景技術】
[0002]維生素C即抗壞血酸，在生物體的氧化還原代謝反應中起調節作用，人類缺乏它可引起壞血病。除此之外，它還具有其他的作用。例如，缺乏維生素C膽固醇就不能羥基化變成膽酸排出體外；它的氧化酶會影響某些胺基酸(一般是芳香族)的代謝；還有解毒作用等。一般，在動物體內和植物體內，維生素C都可以自己合成，但是，在人體卻無法合成抗壞血酸。這是由於，在人體內缺乏古洛內酯氧化酶。植物體自身所合成的維生素C，不僅可以為人類所用，對植物體本身生理功能也具有重要作用。一般來說，抗壞血酸與植物的抗逆性是呈正相關的，隨著植物細胞內的抗壞血酸的含量增加，其本身及其代謝相關酶類在清除活性氧方面的作用也增強，使得抗壞血酸在植物耐炎熱、寒冷和鹽鹼環境等逆境的機制中起到了重要的作用。而且抗壞血酸還與植物細胞的分裂、伸長和植株生長有關。
[0003]迄今為止已經發現在植物中可能存在4種維生素C合成途徑:半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑以及肌醇途徑。其中在維生素C的主要的生物合成途徑當中，磷酸甘露糖變位酶(PMM)可以促進D-6-磷酸甘露糖轉化為D-1-磷酸甘露糖，從而進一步合成維生素C0
[0004]目前在擬南芥、菸草、大豆、水稻、番茄、小麥等已經被克隆了/W基因，但在花生中還沒有克隆的報導，該基因在花生中的功能性研究和轉基因調控的報導尚存空白。
【發明內容】
[0005]本發明提供了花生維生素C合成相關基因AWW及其應用，本發明通過將AWW基因轉入花生中，可以顯著提高花生轉基因植株的維生素C含量和花生種子的耐鹽性。
[0006]為實現上述發明目的，本發明採用下述技術方案予以實現:
花生維生素C合成相關基因AhPMM,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0007]所述基因AWW有11個外顯子。
[0008]所述11個外顯子對應的鹼基分別為第3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472 位。
[0009]克隆所述基因AWW的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3』)，
上述引物序列分別與基因AWW第1-22鹼基、第3482-3507鹼基對應。
[0010]本發明還提供了所述的花生維生素C合成相關基因AWW編碼產生的蛋白質，其胺基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0011]本發明還提供了所述的基因AWW在提高維生素C含量的應用。
[0012]轉AWW基因花生葉片總維生素C含量達8.64 umol g_S還原態維生素C含量達5.38 umol g、
[0013]本發明還提供了所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應用。
[0014]將花生AWW基因在花生中超量表達，花生轉基因種子在1% NaCl溶液中發芽率最高達到50%。
[0015]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
1、本發明從花生中克隆了/W基因(必/W)，測序結果表明該基因有11個外顯子，分別對應的鹼基為 3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472。
[0016]2、將所述必/W基因轉入花生植株中，轉必/W基因花生植株形態發育正常，轉基因花生葉片總維生素C含量可達到8.64 umol g—1 (FW)，為對照(5.31 umol 81的1.6倍；還原態維生素C含量可達到5.38 umol g—1 (FW)，為對照(2.83 umol g—1)的1.9倍。所以本發明將AWW基因在花生過量表達可顯著提高葉片維生素C含量。
[0017]3、本發明通過實驗證明AWW基因受鹽脅迫誘導表達，24 h時可達到對照的4.96倍。
[0018]4、轉AWW基因花生種子在1% NaCl的發芽率最高可達到50%，而非轉基因種子的發芽率只有20% ;本發明將AWW基因在花生過量表達可顯著提高種子的耐鹽性。
[0019]本發明以花生這一重要的油料作物為實驗材料，克隆了抗壞血酸生物合成途徑中的重要基因並對其進行分析。可以為以後通過基因工程調控花生的維生素C含量和提高花生植株的抗逆能力奠定基礎。
[0020]結合附圖閱讀本發明的【具體實施方式】後，本發明的其他特點和優點將變得更加清
λ.Μ
/E.ο
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1表明本發明中花生的遺傳轉化，a:在SM培養基上共培養3d的子葉外植體；b:在SM+cef培養基上培養2w的子葉外植體；c:添加100 mg /L卡那黴素的SEM+cef培養基上篩選的抗性芽(培養4w);d: 150 mg /L卡那黴素的SEM+cef培養基上篩選的抗性苗(培養6w) ；e:在SEM+cef恢復培養基上繼續培養兩周的抗性苗(培養8 w) ；f:抗性苗嫁接圖；g:嫁接苗移栽到大田後的收穫圖。
[0022]圖2是本發明中200 mM NaCl脅迫處理花生幼苗後必/W基因在不同時間段的相對表達量。
[0023]圖3是本發明中對照莒南小紅種和T2代轉基因花生種子在1%的NaCl溶液中的發芽情況；a:莒南小紅種；b-c: T2代轉基因花生種子。
[0024]圖4是本發明中用高效液相色譜測定對照莒南小紅種和T2代轉基因植株葉片的維生素C含量。a:維生素C含量的標準曲線；b:莒南小紅種葉片的維生素C含量的測定結果；c: T2代轉基因植株葉片的維生素C含量的測定結果。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明技術方案作進一步詳細的說明。
[0026]實施例1:花生維生素C合成相關基因AWW及其在提高維生素C含量和耐鹽性中的應用
一、實驗材料
1.基因、菌種與花生品種
本發明克隆了花生/W基因C^/邏/)，大腸桿菌DH5a、根癌農桿菌菌株EHA105由青島農業大學遺傳研究室實驗室保存，也可以採用生物公司商業化的工程菌株。轉基因的受體材料為花生品種「莒南小紅種」(青島農業大學遺傳研究室實驗室提供)。
[0027]所述克隆的花生AWW基因序列表如SEQ ID No:1所示，編碼產生的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0028]克隆所述花生AWW基因的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)(SEQ ID No:4)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3，) (SEQ ID No:5)。
[0029]SEQ ID No:1 序列如下: AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGG ACTCTTACAG CCCCAAG
GAAGGTACTTCTTTCTTCTTGAGCCAATGGCATTACTATAACAAAATAATATATTAATGGAGC AATTTGATGTGTTCTGAGTC AGATTTATTG TCTACAGGTA GTTTAAGGTT
ACTAATTAGGGTTTGGATTCGGTAGCCTCTCCAAAGAAAGCTACTAGTAGCCTCTTCAAATTCAATTATAAAATATACCCCATGCATATCTTTTAATATTTGAAAGTATTCCTTCTTTATTTTTATTTTATTTCTTTTTTAACACGCATCATCCCAAACTTGAGATACAACGCAGCTTCATTTCTGCCTTCACTATTGCAACTTCCATGAACATTCTTCAGTAGTTTCATTTGTTTGGCTTGGAATTGTGTGAATAATTTTTAGCTCCATGAGAAGTCCATAAAAGTAAGTTCTATATTCCAACTGTGCCCACTCTCAACCAAGAAAAAGAAAAACATTCTCACTTCCAACAGCCACAAATGCTGCATAAACTAATTAAAATGAGCTGAATGTGCTGTGGAATTGGGTCATCAATGTTGAATTTGACTGTGGCAATCTTTATGAAACTAGATAATCTTTAACAAATTAATGAGTTGATTGAATAACCTGGGTTATTCAAAATGTGAAGAGCATACTCATATGAATAAAGACACCAATAATTATCATATATTTCAATAATTAAAGAGCAACGAGAAGGAATAATAATGACAAAAGAGAAACAAGAGGAAGAGGAAGAAGTGAGCCCATGTTGCTCAATCAGCACTCCACAGATTGTTCACCAAGATCATCCATCAATCACCACCATTGTCAATGTTTATATTGGACATGATGGAGGTGGATCAAAATTTATTAATGGTGTTGCAGTTCTTAGAAAGGATAAGGCAGCAATGAGATGTGGCAGTACTTCCTTTTCCTCTTATTTGAACAGTGAATAGCTGAAAAGAAATAAAAAAACAAAGCATGAGTACTTTTTAAATATGAGAAAAAGTATGCATTGGGTTATTTTATAATTAAGTATGAAGAGGCTACCAATAGCCTCTCTTTGGAGAAGGCTACTGAATCCAAAGCCTACTAATTATAGCATGCTATAACATCATAATGCTGAAGAAAACTAGAAAATTTTGATTTATTATGATTGTTTAGTCTTGCATCACCTTTATTTATTGTTTCGTACTCGAATTCAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTAAATGAGCCAGATTTTATTTTTGGAAAAAAAAAAGTTTACATGCATTTGTTTTCTTAATCCATACCTGACAATTCATAGAACCTGCTTTAAAAGTCCTTTCCTTTTTCCTGGTACAGGTTGTAACAGTTGGAGTTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGGTTAGCTACAAGCATCTCTCTGATTTCTGATGCTATAATTTCGTTATGTGAAACCACTTGGAGAAAATTGATTGTAGTGTTCCGTCTCATTGCTTAATGCTAATTAATTCTATTATGTGGTTTCTTTTTCATGT TTGTTTTGTTTCTTCTTTGCTATTGGCTGA AGTTGGGAAT TATGTTTGCT GATATAAGCT GAGAATTCAATTTTTACTTTTCTCTACTTTTGTCAAATCA TGCATCTTTG ATAAGCTATT AGAATGAAATCAAAAGGATC TATCTTTTTGAATATACCCC TTATTTGTTG CAGTTACCAA TGACTATGGTTATGTATTTT CTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGGTACACCTCATAAACCTCAATCCTTGATAGAATCAAATTACAACGATCAGATGTAAGTTGAAAAAGTTGTGATGATCCTTTTGTTATCGAAAGAACAAAACTAGTACCATCATGGTGTCGCTTGTAAAACACCTCCCGGCGGGCCTTCTGTTAATGTAGCAATGTAAAATTTTGATCTAATAC
ACCATGA caagttgtaatttccctgtttacagagcttgaaatcattc cttggtgatgaaaagctcaa G
GTAAGCCCCGAATTTCCATTCGAGCCATATTGTTTGAGG CTGAGGCAACCATGCTGATT ACCTCCTAACTGCATTTAGA GATAATTTTG TTGTAGGAAT TTATTAATTTCACACTTCAT TACATTGCTG ACTTGGATATCCCTATTAAG AGGTCAGCCA TATTCAGAGGTTAATCATAT ACTGTTCATT TTTATTGCAG AAAACTTATAAATCCTGTTT TTGACATAATCTTTTCAGGG GAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTA GCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGGTGAGACATCTTGGTCATGTGAATATTAATTAGAATTTTCTG TCTCTATAAT TTGATAGGTC CTATATTTCTTTTAAAAGTT TGCAACACATGTTCTCAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTAAGT GATGATCTTCATCCCGATGTGGCGAATTTC TTGATGGCCA AGTTATAAGTGAGCATGTCT TAATTTGAATCTTCTCTTCA GGTTTTCCCCCAAGGTTGGG ATAAAACATACTGCCTTAGA TACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTC TTTGGTGACAAAACTTACAAGGTTAGTCCT TTAGAGTATC AAACAAATAT CTGTAACTCT GTACCATTATAGATTTTTGAATTCTATAAC GCCAGTTGCT ACCGGATCCT TTTGATTTAT CAATGTGACACATTTTTATGAAAAATCCTT AAAGTGAGTTGGGGCAAACAATTTCTGTAACAAGCAAATAATTGTCTGTTTTATGGAGACTGCATGAACCTTTTTTCTCCATTTTGAAACTTGTTTCAAA TATTCACCAAAATGATCATG CTTTTAGAAATGATATGTTG CAACAGTATA TCAGTCCCAA AATTGAAGCTATATGCCTAC TTTAGGTGTT ATCAAAGGATGAAGATTGAT TAATTTCCTA CAATAACTTTATTTTGTAAT TTTCTTTGAGCAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGGTTAGTTGCTTCCTAACTTTAAATCATAATATGTGAAAAAAATGACTCAGTTTTGGTTACAATGGCATGCTGAAACAATTCCATTTTAAATTAAGACCGAATTATCCAAGGTAAATAATTGTTGCTGCAGTGCTTATAATTTGTA TTCATTCCTT TTTCAGTTACAAGCCCTGM GATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCTCTTCCTTAAAAATTGAATTTGCTGAAGCAATGTT TCCATTGAGA ACCACCA。
[0030]SEQ ID No:2 序列如下: MAARKPGLIALFDVDGTLTAPRKVVTPEMLAFMQDLRKVVTVGVVGGSDL VKISEQLGST VTNDYGYVFS ENGLVAHKEG NLIGTQSLKS FLGDEKLKEF INFTLHYIAD LDIPIKRGTF IEFRSGMLNV SPIGRNCSQE ERDEFEKYDK IQNIRPKMVE VLREKFAHFN LTFSIGGQIS FDVFPQGffDKTYCLRYLEDF NEIHFFGDKT YKGGNDHEIY ESERTIGHTV TSPEDTMKQC TALFLKN。
[0031]2.植物培養基花生轉化中採用的培養基有:
基本培養基:為MS無機鹽+B5有機成分(簡稱MSB5)，添加3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH=5.8，在121°C、105Kpa條件下滅菌20min ；
SM 誘導培養基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2，4_D ；
SEM芽伸長培養基:MSB5+5 mg/L BAP ； cef:頭孢黴素。
[0032]二、實驗方法
本發明包括以下具體實驗步驟:
1、AhPMM基因植物表達載體的構建 (I)擴增AWW基因花生品種「莒南小紅種」由青島農業大學遺傳研究室實驗室提供，通過RT-PCR擴增了AWW基因的編碼區(其序列表如SEQ ID No:3所示)，引物如下:
P3 (5，-GGTACCAAATGGCTGCCCGGAAACCTGG-3，) (Kanl) ；(SEQ ID No:6)
P4 (5，- GAGCTCTCAATTTTTAAGGAAGAGAGC-3』)(Sacl) (SEQ ID No:7)。
[0033]上述引物序列除去酶切接頭(下劃線對應的鹼基)外分別與AWW基因的第1-22鹼基、第3452-3472鹼基對應。
[0034]SEQ ID No:3 序列如下: AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGGACTCTTACAG CCCCAAGGAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGTAACAGTTGGAG
TTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGTTACCAATGACTATGGTTATGTATTTTCTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGAGCTTGAAATCATTCCTTGGTGATGAAAAGCTCAAGGAATTTATTAATTTCACACTTCATTACATTGCTGACTTGGATATCCCTATTAAGAGGGGAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTAGCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTTTTCCCCCAAGGTTGGGATAAAACATACTGCCTTAGATACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTCTTTGGTGACAAAACTTACAAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGTTACAAGCCCTGAAGATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCT CTTCCTTAAAAATTGA。
[0035](2) AWW基因與克隆載體pUC18及植物表達載體pBI121的連接。
[0036]回收PCR產物，並在T4 DNA連接酶作用下與克隆載體pUC18 (購買於TaKaRa)進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci獲得了抗氨苄青黴素的菌落。提取重組質粒，用治ml和feci進行雙酶切，回收含AWW基因的酶切片段，並克隆到植物表達載體pBI121的對應酶切位點中，獲得該基因的植物表達載體pBI 121-AWW。
[0037]3、將表達載體轉化花生，包括以下步驟:
a、農桿菌重組菌株的製備、活化及菌液製備:將PBI121-AWW重組質粒利用液氮凍融法轉化農桿菌菌株EHA105感受態細胞，篩選出含有重組質粒的重組菌株。挑取重組菌株單菌落，接種到YEB (利福平50mg/L，卡那黴素50mg/L)液體培養基中，28°C、180rpm培養至OD600=0.5?0.8時，取2mL菌液轉移到50mL YEB (利福平50mg/L，卡那黴素50mg/L)培養基中，培養到OD6qq=0.6^0.8。將菌液於5000rpm離心15min後，用相同體積的液體MSB5懸浮備用。
[0038]b、花生子葉外植體的分離:選取飽滿的花生種子，在70%酒精中浸泡lmin，0.1%升汞浸泡20min，無菌水衝洗4-6次。去種皮和胚軸，將每片子葉縱向切成2半。
[0039]C、農桿菌介導的遺傳轉化:切好的外植體浸於已備好的農桿菌菌液中，28°C、90rpm溫和震蕩侵染lOmin，用無菌濾紙將殘留菌液吸乾，接入SM誘導培養基上在暗中共培養3d。轉移到添加250 mg/L頭孢黴素的SIM誘導培養基，將外植體切口端嵌入培養基，培養2w左右，誘導叢生芽，培養條件:光強為1500-20001x、光照12h、溫度為26°C ±1°C。
[0040]將形成叢生芽的外植體轉移外到250 mg/L頭孢黴素、100 mg/L卡那黴素的SEM培養基上篩選抗性芽，培養2w，培養條件:光強為1500-20001x、光照12h、溫度為26°C ±1°C。
[0041]培養2w後，切下不定芽部分轉移到250 mg/L頭孢黴素、150 mg/L卡那黴素的SEM培養基上，進行抗性芽的篩選及誘導芽伸長，培養4w左右，期間繼代培養2-3次。
[0042]以2w左右的「花育23」實生苗為砧木，切除距子葉節約2cm以上的主莖部分，用手術刀將砧木上端垂直劈開，切口深約0.5?lcm。當轉基因植株長到約2?3cm時，從芽叢基部切下再生小苗做接穗，下端切成長約0.5?lcm的V形傷口。將接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成層緊密接觸，然後用封口膜纏繞接口，鬆緊適度。將嫁接苗置於MS-B5培養基中無菌培養3?4天；然後移栽於滅菌的育苗基質中進行馴化3w，之後移栽到田間，直至轉基因植株結實(花生的遺傳轉化如圖1所示)。
[0043]4、轉基因植株的PCR檢測
提取再生植株的基因組DNA，利用上述載體序列和AWW基因序列設計引物進行PCR擴增。PCR反應程序為:95°C、5min ;95°C、30 s，56°C、35s，72°C、40 s，35個循環；72°C、lOmin。轉基因植株PCR陽性率達到42.3%。
[0044]將花生AhPMM基因在花生中過量表達，對花生轉基因植株進行PCR檢測的引物為:
P5 (5，-GCTCCTACAAATGCCATCA -3，)(SEQ ID No:8)；
P6 (5』_ GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3』) (SEQ ID No:9)。
[0045]5、螢光定量PCR，包括以下步驟:
a、用200 mM NaCl處理生長3w的『莒南小紅種』幼苗，在不同時間段取幼苗葉片，立即在液氮中冷凍處理後備用。分別取不同時間段脅迫處理的花生幼葉0.05 g，液氮速凍並研磨成粉末狀，用RNA提取試劑盒提取RNA。抽提後的總RNA用DNase I處理，並進行純化。
[0046]b、樣品在ABI 7500 FAST型螢光定量PCR儀上進行反應。20 PL反應體系包括:10 M-L 2 X SybrGreen qPCR Master Mix, 20 Mmol/L 正反向引物各 0.25 M-L, 20 ng 反轉錄產物。擴增程序為:先95°C預變性2 min ;接著進入40個循環反應，每個循環中95°C變性10 s，60°C延伸33 s ;循環結束後，緩慢升至95°C，製備熔解曲線。每個反應設2個復孔。
[0047]c、/W基因定量PCR 的正向引物序列為 5』 - CATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGT -3』 (SEQID No: 10);反向引物序列為 5』- GGAATGATTTCAAGCTCTGGGT -3』 (SEQ ID No: 11)。
[0048]以花生Jcii/?基因為內標，擴增正向引物序列為5』 - GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3』 (SEQ ID No: 12);反向引物序列為 5』- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3』 (SEQ ID No: 13)。
[0049]如圖2所示，200 mM NaCl脅迫處理後花生幼苗後，AWW基因表達量先略微下降，後迅速上升，在24 h時達到對照的4.96倍，48 h時又迅速降低，只有對照的1.22倍。
[0050]6、T2代轉基因種子的耐鹽性鑑定
以T2代種子轉基因花生種子和莒南小紅種種子(對照)為材料，挑選飽滿種子，力口l%NaCl充分浸泡4 h,倒掉多餘NaCl溶液至適量,於光照培養箱中進行培養，培養箱條件設置為25°C、暗培養24h，處理期間每I d更換一次NaCl溶液。5 d後統計發芽率，胚根長度>種子長度為發芽標準。每個處理設兩個重複。
[0051]如圖3所示，花生轉基因植株的花生種子在1% NaCl的發芽率最高可達到50%，而對照只有20%。
[0052]7、T2代轉基因植株維生素C含量的測定
AsA的測定:取T2代轉基因植株葉片0.5 g用液氮研磨，加0.1%草酸適量轉移至棕色容量瓶中，避光浸泡I h，混勻，超聲處理25 min，冷卻後定容10 mL。12,000 rmp離心10min,取上清,0.22 μ m濾膜過濾,進樣分析。
[0053]AsA+DHA (總維生素測定):取上述離心後上清液1ml，分別加入25 μ L DTT (25mmolI/1)和 25 μ L K2HPO4 (160 mmol Γ1)，室溫下避光靜置 15 min 將 DHA 完全還原成 AsA，12，000rpm離心15 min,取上清,經0.22 μ m濾膜過濾後進樣分析。
[0054]如圖4所示，用高效液相色譜測定對照莒南小紅種和T2代轉基因植株葉片的維生素C含量，轉基因花生葉片總維生素C含量最高可達到8.64 umol g—1 (FW)，為對照(5.31umol g4)的1.6倍；還原態維生素C含量最高可達到5.38 umol g—1 (FW)，為對照(2.83umol g—1)的 1.9 倍。
[0055]通過上述實驗數據說明，本發明通過將AWW基因轉入花生中，可以顯著提高花生轉基因植株的維生素C含量和花生種子的耐鹽性。
[0056]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和範圍。
【權利要求】
1.花生維生素C合成相關基因其序列表如SEQID No:1所示。
2.根據權利要求1所述的基因其特徵在於所述基因AWW有11個外顯子。
3.根據權利要求2所述的基因其特徵在於所述11個外顯子對應的鹼基分別為第 3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472 位。
4.根據權利要求1所述的基因其特徵在於克隆所述基因AWW的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3』)， 上述引物序列分別與基因AWW第1-22鹼基、第3482-3507鹼基對應。
5.權利要求1所述的花生維生素C合成相關基因AWW編碼產生的蛋白質，其胺基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
6.根據權利要求1所述的基因AWW在提高維生素C含量的應用。
7.根據權利要求6所述的基因AWW在提高維生素C含量的應用，其特徵在於轉AWW基因花生葉片總維生素C含量達8.64 umol g'還原態維生素C含量達5.38 umol g'
8.根據權利要求1所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應用。
9.根據權利要求8所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應用，其特徵在於將花生AWW基因在花生中超量表達，花生轉基因種子在1% NaCl溶液中發芽率最高達到50%。
【文檔編號】C12N9/90GK104372015SQ201410604319
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】隋炯明, 鄭春花, 王亞, 趙春梅, 孔祥遠, 王晶珊, 喬利仙 申請人:青島農業大學