一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達載體的製作方法
2023-05-21 15:03:16 3
專利名稱：一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達載體。
背景技術：
畜牧業規模化養豬產生的廢氣對周圍環境造成了較大的汙染，而H2S是產生惡臭氣味的重要因素之一，可使畜禽生產性能下降，造成幼仔中毒死亡，給農業生產和人民生活都造成較大的影響。隨著轉基因技術的發展，培育減排H2S的環境友好型轉基因豬便成為可能，它可以從根本上緩解養殖場產生的環境問題。生活在潮溼惡臭環境中的光合細菌莢膜紅細菌capsulatus)中產生一種膜結合蛋白_硫化物醌氧化還原酶(Sulfide-quinone reductase, SQR),可以利用H2S作為氫供體為光合細菌提供能量。 雖然莢膜紅細菌可以產生SQR蛋白，但因該細菌生長條件較難控制，將其進行工業化生產仍然受到限制，所以如何製備適於工業化生產的重組細菌成為目前研究的課題。外源蛋白的表達水平與多種因素有關，如啟動子和終止子的強弱、質粒拷貝數、蛋白穩定性、翻譯效率，表達系統和宿主的兼容性等。其中，宿主密碼子偏好性是影響外源蛋白表達的重要因素之一。無論在原核表達系統還是真核表達系統，稀有密碼子過多會嚴重影響蛋白的表達，導致表達水平急劇下降；而偏離規範的密碼子，即不同的生物能把同種密碼子識別為不同的胺基酸，將直接導致了基因不能進行異源表達或者只表達出無活性的蛋白質。目前，克服制約瓶頸現象解決的主要策略是在不改變所編碼蛋白的胺基酸序列基礎上，通過序列定點突變或全基因合成手段，從基因本身更改特有的稀有密碼子從而實現功能蛋白的異源表達。而對於SQR蛋白的基因優化目前還屬於空白。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中的上述不足，提供一種優化的硫化物醌氧化還
原酶基因。本發明的另一目的是提供上述優化的硫化物醌氧化還原酶基因的表達載體。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。本研究對sqr基因進行優化的時候兼顧以下幾個方面儘量使用偏好密碼子，以提高mRNA的翻譯效率；降低GC含量，調整基因AT含量，防止提前終止；去除sqr基因中影響mRNA有效翻譯和穩定性的二級結構；除去使mRNA不穩定和降解的序列和結構。實驗表明優化後的基因在CHO細胞系中轉錄水平和翻譯水平均高於其原始基因序列。優化後的sqr基因片段核苷酸序列與原序列比對相似性為81%，427個胺基酸中有228個胺基酸的密碼子得到優化，優化率達到54%。一種硫化物醌氧化還原酶的表達載體,該表達載體是由優化的硫化物醌氧化還原酶基因插入到表達載體(也稱出發載體)的多克隆位點構建而成。所述出發載體優選原核表達載體為大腸桿菌表達載體pRSET A、或真核表達載體pcDNA3. I。一種轉基因細胞系，是由上述硫化物醌氧化還原酶的表達載體轉染到宿主細胞構建而成。本發明的優化的硫化物醌氧化還原酶基因在製備轉基因動物中的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本研究對光合細菌(莢膜紅細菌)中的硫化物醌還原酶(sqr)基因進行了優化，使其在表達量上高出正常菌株，從培育環境友好型動物新品種的角度出發，為轉基因豬的製備探路，以期從轉基因全新的角度降低養殖場中硫化氫氣體的排放，從根本上解決養豬產業中的環境汙染問題。
圖I.莢膜紅細菌sqr2基因PCR擴增結果，其中1、2為sqr2基因；M :DNA分子量標準。圖2 . sqr基因的信號肽預測。圖3. sqr基因優化前後的CAI值及密碼子頻率分布。圖4. sqr基因優化前後mRNA 二級結構。圖5.重組質粒pRSET A-sqr的菌液PCR鑑定，I 陰性對照；2飛=PCR擴增重組質粒pRSET A-sqr ；M DNA分子量標準。圖6.不同誘導時間的pRSETA-sqr融合蛋白表達。0 :IPTG誘導空載體pRSETA的表達；M :分子量標準蛋白Marker ;1 7 :IPTG分別誘導0、2、4、5、6、7、8h時pRSETA-sqr的表達。圖7. SQR原核表達產物的Western-blot驗證，M :分子量標準蛋白Marker ；1 pRSETA 載體；2 pRSETA-sqr2 融合蛋白。圖8. 15min內不同濃度的decyl_UQ反應情況(A)和雙倒數法求SQR酶的Km值(B)。圖9.真核表達載體 pcDNA3. I-SQR(A)與 pcDNA3. 1-SQR2 (B)的構建。M DL5000marker ； I :重組載體；2 :重組載體的Xho I和Kpn I雙酶切結果。圖10. CHO細胞的總RNA抽提。圖11. sqr與sqr2的mRNA相對表達。圖 12. pcDNA3. 1-sqr 與 pcDNA3. I_sqr2 融合蛋白表達，SQR pcDNA3. 1-sqr 融合蛋白；SQR2: pcDNA3. I_sqr2融合蛋白；B pcDNA3. IB空載體；L :未進行轉染的CHO細胞。圖13. sqr2轉基因小鼠總RNA抽提結果。圖14. sqr2基因在轉基因小鼠不同組織的表達情況，1_13分別為心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、肌肉、腮腺、頜下腺、舌下腺、水、陽性質粒。圖15. Western blot驗證SQR蛋白在轉基因小鼠各組織的表達情況，a (_)、c(-):轉基因陰性小鼠；b (+)、d(+):轉基因陽性小鼠。圖16. Western blot驗證SQR蛋白在轉基因小鼠各組織的表達情況的灰度值分析。圖17.小鼠代謝收集的氣體圖譜代謝產生的氣體(A)，糞便發酵產生的氣體(B)。
圖18.小鼠代謝和糞便發酵產生的氣體中H2S含量分析，其中A圖為小鼠代謝產生氣體中H2S含量，(NaHS-(+):飼餵日常飼料的轉基因陽性鼠；NaHS-(-):飼餵日常飼料的轉基因陰性鼠；NaHS+(+):飼餵添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉基因陽性鼠；NaHS+(-):飼餵添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉基因陰性鼠。B圖為糞便發酵產生的氣體中H2S含量，其中，(NaHS-(+):飼餵日常飼料的轉基因陽性鼠；NaHS-(-):飼餵日常飼料的轉基因陰性鼠；NaHS+(+):飼餵添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉基因陽性鼠；NaHS+(-):飼餵添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉基因陰性鼠。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步解釋本發明，但實施例不對本發明構成任何限制，實施例中如無特殊說明，均為本領域常規實驗技術。實施例中所用生物材料來源如下
莢膜紅細菌{Rhodobacter capsulatus ):購於廣東省微生物研究所。pMD18-T vector、pMD20_T vector、大腸桿菌表達載體pRSET A、大腸桿菌感受態細胞BL21 (DE3)、DH5a感受態細胞均購自Takara公司。真核表達載體pcDNA3. I購自廣州英偉創津公司。實驗所用的Fvb和ICR小鼠購自廣州賽業公司。實施例I
一、莢膜紅細菌sqr基因的克隆 購買的莢膜紅細菌進行復甦擴大培養。參照GenBank 上莢膜紅細菌 DSM155(Accession No. X97478. 2)的 sqr 基因序列，利用primer5. O、Genetool等軟體設ii^一對引物SI
F :5』 GAGCTGGCCGGTCTGAACTTC 3』(SEQ ID NO:2);
R:5』 CGCGCCTGTCCTTCGCCTCCGTGACA 3』 (SEQ ID NO:3)。利用上述引物，以提取的莢膜紅細菌基因組DNA為模板，常規PCR擴增sqr基因。擴增產物電泳檢測結果如圖1，可見一條約1550bp的條帶。按Omega公司PCR產物純化回收試劑盒說明書來進行PCR產物的回收和提純，經測序，片段長度為1547bp，其中包括1284bp的sqr基因全長⑶S。二、sqr基因的信號肽預測及密碼子優化
將克隆所得的sqr基因通過網上資料庫SignalP 4. 0 Sever信號肽預測(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)和DNAStar序列分析軟體對基因產物進行信號妝的預測。為使sqr基因在小鼠體內得到更高水平的表達從而更好的發揮功能，根據sqr在小鼠中表達的密碼子使用偏好性，使用GenScript稀有密碼子分析軟體對克隆所得的sqr基因進行優化設計，提高密碼子適應指數CAI值。同時，在sqr基因5'端分別添加豬腮腺蛋白基因的信號肽。SignalP 4.0預測結果中，C-Score預測待測胺基酸序列可能的切割位點，而且信號肽切割位點的C值最大。S-Score與C-Score結合起來更能準確預測切割位點。切割處的Y-Score對應的S值在曲線的波峰(谷)；C值峰值大。S-Mean是S值的平均數，而D-Mean是S-Mean和Y-Max的簡單平均數，是預測待測蛋白胺基酸序列為分泌型蛋白或非分泌型蛋白的標準。SignalP4. 0預測結果顯示(圖2):從莢膜紅細菌中擴增得到的SQR沒有信號肽，非分泌型蛋白。故在對其進行優化時，5'端添加了豬腮腺蛋白的信號肽。sqr基因中攜帶稀有密碼子，會降低在小鼠體內的轉錄水平和翻譯效率。根據小鼠對密碼子的偏愛性，將sqr基因進行了優化，得到的新序列定為sqr2(SEQ ID NO: I)。序列比對結果顯示與sqr序列的相似性為81%，胺基酸序列未變。427個胺基酸中有228個胺基酸的密碼子發生優化，優化率達到54%。為提高sqr基因在小鼠體內的表達水平，預測sqr2的CAI值由0. 79提高到0. 81(圖3)，經過密碼子偏好性改造，GC含量得到了優化，sqr基因的GC含量(GC%)由原來的64. 23%降為54. 95%，去除了一些重複序列，打破了一些莖環結構(圖4)，避免其影響與核糖體結合的mRNA的穩定性，延長了 mRNA的半衰期。sqr2全長基因序列為直接化學合成。
三、sqr2在大腸桿菌中的表達 I. pRSET- sqr2表達載體構建
以莢膜紅細菌基因組DNA為模板，以S2為引物，常規PCR擴增sqr2基因。F: 5，CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTG 3，(SEQ ID NO:4，下劃線部分為ZAo I酶切位點)；
R: 5』AACTCCAGTTACCCCTTCTTCACGGCCTTCAG3，(SEQ ID NO: 5，下劃線部分為I 酶切
位點)。PCR 反應程序為94°C預變性 3 min，I 個循環；94°C 30 s，61°C 30s,72°C 90s, 29個循環；72°C後延伸8 min。PCR產物回收，與pMD18_T simple載體克隆連接構建成克隆載體T_sqr2進行克隆擴增，培養後選擇經鑑定正確的陽性T_sqr2菌抽提質粒(按Omega Plasmid Kit試劑盒操作)。將質粒pRSET A與T_sqr2用通o I和I限制性內切酶進行雙酶切。酶切產物連接，構建成原核表達載體pRSET-sqr2，轉化BL21 (DE3)感受態細胞，用Amp+抗生素平板進行篩選，隨機挑選10個單菌落用特異性引物利進行PCR鑑定，在約1300bp處均出現一條亮帶，與預期大小相符(圖5，其中泳道I為陰性對照)。2.重組質粒在大腸桿菌中的表達
將重組表達質粒pRSETA-sqr2和空質粒pRSET A轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細菌，塗板、挑囷；
2)在含Amp的LB培養基中371振蕩培養過夜後，取空載體的菌液和重組菌分別按1:100體積比接入含氨苄青黴素的3 mL和30 mL LB培養基中，220 r/min、37 °C振蕩培養;
3)測0D600值為0.4 0. 6時，分別取出3 mL重組菌液/管，共7管(包含空載體pRSETA菌液)，並均加入0.4 mmol/L的IPTG 37 °C繼續培養l_8h，分別在誘導2、4、5、6、7、8h時各取I管。另外取I mL未經IPTG誘導的菌液對照；
4)將表達後的菌液按6500r/min離心3. 5 min，棄上清，加入80 u LI X電泳上樣緩衝液懸浮菌體，於各EP管中混勻，混勻後100°C煮沸5 min,短暫離心，吸取上清8 y L點樣，進行12% SDS-PAGE電泳；5)電泳結果見圖6，不同誘導時間的全菌體經12% SDS-PAGE後染色，與空載體對照菌和未誘導菌相比，均在相對分子量約為50kD處出現新的蛋白帶，說明SQR融合蛋白在大腸桿菌中表達，隨誘導時間的延長，融合蛋白相對含量呈遞增趨勢，誘導6h表達產量達最高值，誘導時間再延長，表達產量不再增加。由此可見，用IPTG作為誘導物時，最佳誘導時間為4 h。將pRSET A-sqr2表達的融合蛋白命名為pRSET A-SQR06)將0.4 mmol /T, IPTG誘導表達6 h得到的SQR融合蛋白進行Werstern-blot檢測，His標籤抗體能特異與SQR融合蛋白上的His標籤結合，在大約50 KDa處檢測到重組菌液中SQR的表達(圖7)。3. SQR蛋白的酶活分析
測定0D275 nm處添加不同泛醌濃度時SQR催化decylubiquinone (decyl-UQ)的反應情況，繪製標準曲線，隨後測定在不同底物濃度下分析SQR蛋白酶的活性，發現該酶在Na2S的存在下有一定的消化decyl-UQ的能力(圖8)。根據雙倒數法計算出該酶的Km 4 (圖8)。 實施例2 sqr基因優化前後在CHO細胞系中的表達
真核表達載體pcDNA3. I_sqr/sqr2的構建設計含有通01和治粘性末端的序列引物S3，序列如下
F: 5' -CCGCTCGAGATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTATGGCTCATATCGTG -3' (SEQ ID NO:6，ZAo I);
R: 5' - CGGGGTACCGACCCCTTCTTCACGGCCTT -3' (SEQ ID , Kpn I)。分別以sqr和Sqr2基因序列為模板，S3為引物，進行常規PCR擴增。擴增產物經克隆載體克隆後分別與質粒pcDNA3. I進行雙酶切，酶切產物用連接酶連接，構建成新的表達載體 pcDNA3. 1-sqr 和 pcDNA3. I_sqr2。對構建的真核表達重組載體pcDNA3. l_sqr和pcDNA3. I_sqr2進行測序，並用XhoI和Kpn I雙酶切檢測(圖9，圖中2泳道)，在5000bp和1300bp附近均有檢測到表達載體和sqr/sqr2基因的目的條帶，證明真核表達載體構建成功。四、sqr與sqr2基因mRNA的表達水平比較
所得的pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2無內毒素抽提之後用脂質體轉染CHO細胞系，同時用空載體pcDNA3. I以及未轉染的CHO細胞作對照。試劑盒提取轉染48 h後各組CHO細胞的總RNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖10，圖中清晰可見28S與18S條帶和一條微弱的5S條帶，這是由於用試劑盒抽提一般都會將5S破壞，因此5S條帶非常模糊。一般地，只要28S和18S 2條帶清晰，完整無拖帶，且28S帶的亮度是18S帶的兩倍，表明總RNA無降解。本實驗所提取的RNA完全符合這要求，並且總RNA經Eppendorf核酸蛋白濃度測定儀測定,260 nm的吸收值與280 nm的吸收值比值均在I. 8 - 2.0之間，表明無蛋白質和其它雜質汙染，提取的總RNA質量完好，可以繼續進行下遊的反轉錄及實時定量檢測。通過Realtime-PCR檢測sqr、sqr2基因在CHO細胞中的表達，以GAPDH為內參作為對照，結果如圖11所示，實驗組細胞目的基因sqr2的mRNA表達水平是sqr的9倍之多，這表明pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2質粒成功的轉染CHO細胞後，sqr2的mRNA表達水平極顯著的高於sqr的表達水平(/ < 0. 001)。
Western blot檢測sqr基因優化前後蛋白表達水平比較對瞬時轉染48h的CHO細胞進行蛋白抽提，以小鼠內參GAPDH做內參，通過His標籤抗體檢測pcDNA3. l_sqr與pcDNA3. I_sqr2融合蛋白在CHO細胞中的表達情況，Western blot結果表明(圖12)，轉染兩個表達載體的CHO細胞的培養基中均未檢測到SQR的表達，而在CHO細胞內有SQR蛋白的表達，55KD處有目的條帶出現，且轉染了 pcDNA3. I_sqr2的CHO細胞中SQR蛋白的表達高於轉染pcDNA3. 1-sqr的細胞組，進一步說明優化後的sqr2基因比sqr基因更適於在倉鼠卵巢細胞CHO中表達。實施例3顯微注射法製備sqr2轉基因小鼠
將優化後的基因sqr2插入到轉基因載體的多克隆位點構建成轉基因表達載體，進行顯微注射小鼠(由廣州賽業公司完成)，一共注射了 350枚受精卵，第一次注射200個，存活 155個，移植6隻代孕鼠，出生9隻小鼠(部分死亡)。第二次注射150個卵，存活110個，移植4隻代孕鼠，出生17隻小鼠。首建者轉基因小鼠在6周齡左右與非轉基因小鼠進行第一次交配，獲得F1代小鼠，斷奶後又再次交配，小鼠傳代情況見表I所示。對出生的後代小鼠進行PCR檢測，根據陽性轉基因小鼠的數量可以計算遺傳率。結果表明pPSP- sqr2轉基因小鼠中15、35號不能將導入的外源基因遺傳給後代，其餘的14、16、33、34、36號Ftl小鼠都能遺傳給後代，其中14、16號遺傳概率最高,36號遺傳概率較高,33、34號遺傳率較低。表I轉基因小鼠的傳代
權利要求
1.一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因，其特徵在於核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種硫化物醌氧化還原酶的表達載體，其特徵在於由權利要求I所述優化的硫化物醌氧化還原酶基因插入到表達載體的多克隆位點構建而成。
3.根據權利要求2所述硫化物醌氧化還原酶的表達載體，其特徵在於所述原核表達載體為大腸桿菌表達載體pRSET A或真核表達載體pcDNA3. I。
4.一種轉基因細胞系，其特徵在於由權利要求2所述硫化物醌氧化還原酶的表達載體轉染到宿主細胞構建而成。
5.權利要求I所述優化的硫化物醌氧化還原酶基因在製備轉基因動物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種優化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達載體，屬於基因工程技術領域。該優化的硫化物醌氧化還原酶基因(sqr)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。優化後的sqr基因片段核苷酸序列與原序列比對相似性為81%，427個胺基酸中有228個胺基酸的密碼子得到優化，優化率達到54%。本發明從培育環境友好型動物新品種的角度出發，為轉基因動物的製備探路，以期從轉基因全新的角度降低動物養殖場中硫化氫氣體的排放，從根本上解決養殖產業中的環境汙染問題。
文檔編號C12N15/63GK102719454SQ20121019761
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者張哲 , 張豪, 李加琪, 賀豔芬 申請人:華南農業大學