用於基因治療的病毒載體的製作方法

2023-05-22 07:58:51

專利名稱：用於基因治療的病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的病毒載體，它們的製備和基因治療用途。還涉及含有所述病毒載體的藥物組合物。更具體地，本發明涉及作為用於基因治療的載體的重組腺病毒。
基因治療在於通過向病體細胞或器官中引入一種基因信息以糾正缺陷或異常(突變、異常表達等)。該基因信息或在體外引入從器官中取出的細胞中，然後修飾後的細胞再返回機體中，或在體內直接引入適當組織中。在後一情形下，存在不同技術，其中各種轉染技術DNA與DEAE-葡聚糖的複合物(Pagano等，J.Virol.1(1967)891)、DNA與核蛋白的複合物(Kaneda等，Science 243(1989)375)、DNA與脂質的複合物(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)、脂質體的使用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。最近，使用病毒作為轉移基因的載體已顯示是這些物理轉染技術的有利替代技術。關於這一點，已經試驗了不同病毒感染某些人體細胞的能力。特別是逆轉錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺相關病毒和腺病毒。
在這些病毒中，腺病毒具有用於基因治療的某些令人感興趣的特徵。特別是，它具有足夠大的宿主譜，能夠感染休止細胞，不與所感染細胞的基因組合，及至今對人體沒有產生嚴重病理影響。
腺病毒為具有長度為36kb左右的線性雙鏈DNA的病毒。其基因組特別包括末端的逆向重複序列(ITR)、包裝序列、早期基因和晚期基因(參見

圖1)。主要早期基因為E1(E1a和E1b)、E2、E3和E4基因。主要晚期基因為L1到L5基因。
鑑於腺病毒的上述特徵，它們已被用於體內轉移基因。實際上已製備了衍生自腺病毒的不同載體，其中整合了不同的基因(β-gal、OTC、α-1AT、細胞素等)。在這些構建系中，腺病毒都被以某種方式修飾使其在所染細胞中無法複製。因此，現有技術中描述的構建係為缺失E1(E1a和/或E1b)區及有時缺失E3區的腺病毒，在此基礎上插入異源DNA(Levrero等，Gene 101(1991)195;Gosh-Choudhury等，Gene 50(1986)161)。但是，現有技術中描述的載體存在許多限制基因治療應用的缺陷。特別是，所有這些載體含有許多病毒基因，它們在體內的表達是基因治療領域所不希望的。另外，這些載體不能融合很長的DNA片段，而這是某些應用中所必需的。
本發明克服了這些缺陷。本發明實際上描述用於基因治療的重組腺病毒，它能夠在體內有效地轉移DNA(長達30kb)，在體內以更高水平穩定地表達該DNA，完全消除了產生病毒蛋白、病毒傳播、致病性等的危險。特別是，發現可以大大減小腺病毒基因組的長度而不妨礙包裝化病毒顆粒的形成。這一點是令人驚異的，因為在其它病毒如逆轉錄病毒中已觀察到沿基因組長度分布的某些序列對病毒顆粒有效地包裝是必需的。因此，製造具有重要內部缺陷的載體受到很大限制。本發明還顯示缺失病毒基因的主要部分也不影響這種病毒顆粒的形成。雖然對它們的基因組進行了很多修飾，但如此得到的重組腺病毒保留了它們感染能力強、在體內的穩定性等優越特徵。
由於能夠整合很長的目標DNA序列，本發明的載體特別有益，例如可能插入長度大於30kb的基因。這一點是令人感興趣的，因為某些疾病的治療需要多種基因的共同表達，或表達很大的基因。例如在肌肉萎縮的例子中，到現在還不可能轉移此病的天然責任基因(萎縮基因)相應的cDNA，因為它很長(14kb)。
本發明載體的另一個優點是，它們所有的功能性病毒區段很少，因此大大減小甚至消除了使用病毒作為基因治療載體的固有危險，如免疫原性、致病性、傳染、複製、重組等。
因此，本發明提供特別適合於體內轉移和表達目標DNA序列的病毒載體。
所以本發明的第一個目的是重組缺陷性腺病毒，它包括-ITR序列-使其包裝的序列-異源DNA序列，及其中
-E1基因非功能化及-E2、E4、L1-L5基因中至少一種非功能化。
在本發明中，術語「缺陷性腺病毒」指在靶細胞中不能自主複製的腺病毒。一般來說，本發明的缺陷性腺病毒的基因組至少缺失該病毒在所感染細胞中複製的必需序列。這些區域或被消除(全部或部分)、或失去功能、或被其它序列特別是被異源DNA序列取代。
逆向重複序列(ITR)構成腺病毒複製的起點。它們位於病毒基因組的3′和5′末端(參見圖1)，按照本領域技術人員已知的經典分子生物學技術可容易地從中將它們分離出來。人體腺病毒(特別是血清型Ad2和Ad5)的ITR序列的核苷酸序列在文獻中有述，狗的腺病毒(特別是CAV1和CAV2)也是如此。例如腺病毒Ad5，其左側ITR序列相當於基因組中含核苷酸1-103的區域。
包裝序列(也稱為Psi序列)是包裝病毒DNA所必需的。因此應該保存該區域以使製備本發明的重組缺陷性腺病毒成為可能。該包裝序列位於腺病毒基因組中左側(5′)ITR與E1基因之間(參見圖1)。它可用分子生物學的經典技術分離或人工合成。人體腺病毒(特別是血清型Ad2和Ad5)的包裝序列的核苷酸序列在文獻中有述，狗的腺病毒(特別是CAV1和CAV2)也是如此。例如腺病毒Ad5，其包裝序列相當於基因組中含核苷酸194-358的區域。
存在不同血清型的腺病毒，其結構和性質有些差異。但這些病毒具有相似的基因結構，本領域技術人員可在所有腺病毒上容易地重複本申請中的教導。
本發明的腺病毒可來源於人、動物或其混合(人和動物)。
關於源於人的腺病毒，優選C組腺病毒。更優選地，在人腺病毒的不同血清型中，本發明範圍內優選使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
如上所述，本發明的腺病毒也源自動物，或包括源自動物的腺病毒衍生的序列。實際上申請人已證明來自動物的腺病毒能夠很有效地感染人體，並且它們在已測試的人體細胞中不能繁殖(參見申請FR9305954)。申請人還證明動物腺病毒根本不會被人腺病毒轉補，這就消除了在人腺病毒存在下，在體內重組和繁殖從而導致感染顆粒形成的危險。因此，使用來自動物的腺病毒或腺病毒區段特別有利，因為用病毒作為基因治療載體的固有危險更小。
用於本發明的動物腺病毒可來自狗、牛、鼠(如Mavl，Beard等，Virology 75(1990)81)、羊、豬、禽或猴(如SAV)。更具體地，禽類腺病毒中也舉出可從ATCC可得到的血清型1-10，例如下列菌種Phelps(ATCC VR-432)、Fontes(ATCC VR280)、PT-A(ATCC VR-827)、IBH-2A(ATCC VR-828)、J2-A(ATCC VR-829)、T8-A(ATCC VR-830)、K-11(ATCC VR-921)或ATCC VR-831-835注有出處的菌株。在牛腺病毒中，可使用已知的不同血清型，特別是從ATCC可自由取得的註明為ATCC VR-313、314、639-642、768和769的那些(1-8型)。還可列舉鼠腺病毒FL(ATCC VR-550)和E20308(ATCC VR-528)、5型羊腺病毒(ATCC VR-1343)、或6型(ATCC VR-1340);豬腺病毒(5359)、或猴腺病毒如特別是在ATCC註冊的腺病毒VR-591-594、941-943、195-203等。
優選地，在不同的動物腺病毒中，本發明中使用狗的腺病毒或腺病毒區段，特別是所有CAV2腺病毒株[例如manhattan株或A26/61(ATCC VR-800)株]。對狗腺病毒進行了許多結構研究。腺病毒CAV1和CAV2的完全的限制性酶切圖譜在現有技術中已經描述(Spibey等，J.Gen.Virol.70(1989)165)，E1a和E3基因以及ITR序列已被克隆並測序(具體見Spibey等，Virus Res.14(1989)241;Linne，Virus Res.23(1992)119，WO 91/11525)。
如前所示，本發明的腺病毒包含異源DNA序列。異源DNA序列是指引入重組病毒中並希望其在靶細胞中轉移和/或表達的所有DNA序列。
特別是，異源DNA可含有一個或多個治療基因和/或一個或多個編碼抗原性肽的基因。
被如此轉移的治療基因為在靶細胞中轉錄和任選地翻譯後產生具有治療作用的產物的所有基因。
這可特別涉及編碼具有治療作用的蛋白產物的基因。如此編碼的蛋白產物可為蛋白質、肽、胺基酸等。該蛋白產物可能與靶細胞同源(即在不產生任何疾病的情況下在靶細胞中正常表達的產物)。在此情形下，一種蛋白質的表達使得例如緩和細胞中的表達不足或由於某種修飾造成的無活性或弱活性蛋白質的表達，或所述蛋白質的過度表達。該治療基因還可以編碼穩定性提高、活性改善的細胞蛋白質突變體。在此情形下，所表達蛋白質可以例如補充或提供細胞中的不足的活性，以此來防治某種疾病。
本發明意義上的治療產物中，特別可列舉酶、血製品、激素、淋巴因子白細胞介素、幹擾素、TNF等(FR9203120)，生長素、神經遞質或它們的前體或合成酶，營養素BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等;原脂蛋白ApoAⅠ、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)、dystrophine或minidystrophine(FR9111947)，腫瘤的基因抑制劑P53、Rb、Rap1A、DCC、K-rev等(FR9304745)，凝集相關因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ因子等的編碼基因。
治療基因還可以是反義基因或序列，其在細胞中的表達可以控制細胞基因表達或細胞mRNA的轉錄。例如按照專利EP140308中描述的技術，這樣的序列可在靶細胞中轉錄成細胞mRNA的互補RNA，並因此阻斷它們翻譯成蛋白質。
如上所述，異源DNA序列還可以包括一種或多種編碼能夠在人體中產生免疫反應的抗原性肽的基因。在此具體實施方案中，本發明可製成使人體對特別是微生物或病毒有免疫性的疫苗。這特別涉及對EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP185573)、偽狂太病病毒、或特異腫瘤(EP259212)的特異性抗原性肽。
一般，異源DNA序列還包括使得治療基因和/或編碼抗原性肽的基因在所染細胞中表達的序列。這涉及那些在所染細胞中易於發揮作用的天然負責目標基因表達的序列。還涉及不同來源的序列(負責其它蛋白質的表達，或合成的等同物)。特別是涉及真核細胞或病毒基因的啟動(promotrice)序列，例如涉及來自欲感染細胞基因組的啟動序列。同樣涉及來自包括所有腺病毒在內的病毒基因組的啟動序列。關於這一點，例如可舉出E1A、M2P、CMV、RSV等基因的啟動子。另外，這些表達序列可通過加入活化序列、調節序列等來修飾。另外，當所插入基因不含表達序列時，可在缺陷性病毒基因組中在該序列的下遊插入這樣的序列。
另外，異源DNA序列，具體在治療基因的上遊還含有指示靶細胞的分泌道中治療產物合成的信號序列。這種信號序列可為治療產物的天然信號序列，但還涉及所有其它信號功能序列，或人工信號序列。
如上所述，本發明的載體具有非功能性E2、E4、L1-L5基因中的至少一種。該病毒基因可用於本領域技術人員已知的所有方法使其非功能化，特別是通過在所述基因中消除、取代、缺失、或加入一個或幾個鹼基。例如利用遺傳基因技術，或通過用致突變劑處理，可在體外(對分離的DNA)或體內獲得這樣的修飾。
在致突變劑中，可列舉例如，物理試劑如能量輻射(X射線、紫外線等)，或能與DNA鹼基的不同功能基反應的化學試劑，如烷化劑[甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N′-磺基-N-亞硝基胍、N-硝基喹啉-1-氧化物(NQO)]、雙烷化劑、插入劑等。
在本發明的意義上，缺失應理解為目標基因的所有消除。這主要涉及所述基因的全部或部分編碼區，和/或所述基因的全部或部分轉錄啟動區。如實施例所說明的那樣，按分子生物學的常規技術，通過適當的限制性酶消化然後連續來進行消除。
還可以通過基因破裂來獲得遺傳修飾，例如按照由Rothstein首先描述的方案[Meth.Enzymol.101(1983)202]。在此情形下，優選阻礙全部或部分編碼序列，使基因組序列通過同源重組被一種非功能化或突變序列取代。
該或所述遺傳修飾可位於有關基因的編碼部分，或在該編碼區以外，及例如在負責所述基因表達和/或轉錄調節的區域。所述基因的非功能化特徵然後通過以下顯示出來由於結構或構形改變產生無活性蛋白質，不產生蛋白質，產生改變了活性的蛋白質，或產生低水平天然蛋白質或按所希望的方式進行了調節。
另外，某些變異如點突變通過細胞機制可被校正或降低。因此這樣的遺傳變異在工業水平上的意義有限。因此特別優選非功能化特徵具有非常好的分離穩定性和/或不可逆性。
優選地，通過部分或全部缺失使基因非功能化。
本發明的重組缺陷性腺病毒特別缺少腺病毒的晚期基因。
本發明的一個特別有利的方案由這樣的重組缺陷性腺病毒構成，它包括-ITR序列，-包裝序列，-外源DNA序列，及-包括E2基因或其部分基因的區域。
本發明的另一特別有利的方案是如下重組缺陷性腺病毒，它包括-ITR序列-包裝序列-外源DNA序列，及-包括基因E4或其中一部分的區域。
同樣，在特別有利的方案中，本發明的載體另外含有在異源啟動子控制下的功能性基因E3。這些載體特別含有使蛋白質gp19k表達的基因E3的一部分。
可用不同方式製備本發明的重組缺陷性腺病毒。
第一種方法是體外製備(或通過連結，或以質粒形式)即在有能力的細胞系中轉染重組缺陷性病毒的DNA，該細胞系能補全缺陷性病毒所需功能。這些功能優選整合在細胞基因組中，這使得避免了重組的危險，並使得在細胞系中穩定性提高。在實施例中描述了這樣的細胞系的製備。
第二種途徑是在適當細胞系中，體外製備(或通過連結，或以質粒形式)的缺陷性重組病毒的DNA和輔助病毒的DNA共同轉染。按照該方法，沒必要使有能力的細胞系就能夠與重組腺病毒的所有缺陷功能互補。實際上，這些功能部分被輔助病毒補充。該輔助病毒也同樣應該是缺陷性的，並且細胞系具有需要其反式補充的功能。按此方法製備本發明的重組缺陷性腺病毒也在實施例中進行了說明。
在此第二種途徑中可使用的細胞系中，可特別舉出人胚胎腎細胞系293、KB細胞、Hela細胞、MDCK、GHK等(參見實施例)。
然後，按照分子生物學的常規技術收集、純化和擴增繁殖後的載體。
因此，本發明還涉及可被腺病毒感染的細胞系，它包括整合在其基因組中的、與如前述的重組缺陷性腺病毒互補的必要功能。具體地，它涉及包括整合在其基因組中的E1和E2區(特別是編碼蛋白質72k的區域)。和/或E4和/或糖皮質激素受體基因的細胞系。這些細胞系優選得自細胞系293或gm DBP6。
本發明還涉及含有一種或多種如前所述的重組缺陷性腺病毒的所有藥物組合物。可配製本發明的藥物組合物，以通過局部、口服、非胃腸道、鼻內、靜脈內、肌肉、皮下、眼內、經皮等途徑給藥。
優選地，在本發明藥物組合物中含有針劑配方的藥用載體。特別是消毒、等滲的鹽水溶液(磷酸一鈉、磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或幹組合物，特別是凍幹品，它通過加入無菌水或生理血清能形成注射溶液。
針劑中所用病毒的劑量可與不同參數相適應，特別是所用給藥方法、有關的疾病、要表達的基因、還有治療時間。一般地，本發明的重組腺病毒被配製成劑量為104-1014pfu/ml，優選106-1010pfu/ml，並以此形式結晶。pfu(斑點形成單位)相當於病毒溶液的感染能力，通過感染適當的細胞培養物，一般5天後測量被感染細胞的空斑數目。病毒溶液滴度pfu的測定技術在文獻中有充分的說明。
根據所插入的異源DNA序列，本發明的腺病毒可用於治療或預防許多疾病，包括遺傳病(營養障礙、囊性纖維變性等)、神經發生性(neurogegenerative)疾病(早老性痴呆、帕金森氏病、ALS等)、癌症、凝集失調或脂蛋白障礙引起的疾病、由病毒感染引起的疾病(肝炎、SIDA等)等。
藉助以下實施例將更完全地描述本發明，這些實施例是示範性的而不是限制性的。
圖1腺病毒Ad5的遺傳結構。在已知條件基礎上可自由取得Ad5的完全序列，並使本領域技術人員能夠選擇或確立限制性位點，並因此分離基因組的所有區段。
圖2腺病毒CAV2 Manhattan株的限制性酶切圖譜(根據前述Spibey等的文章)。
圖3通過連結構建本發明的缺陷性病毒。
圖4構建含有E4基因的重組病毒。
圖5構建帶有E2基因的重組病毒。
圖6質粒pPY32的構建和描繪。
圖7質粒pPY55的描繪。
圖8質粒p2的描繪。
圖9為構建質粒pITRL5-E4所用的中間質粒的描繪。
圖10質粒pITRL5-E4的描繪。
用於分子生物學中的常規方法如質粒DNA的製備性提取、質粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、電洗脫純化DNA片段、苯酚或苯酚-氯仿提取蛋白質、在含鹽介質中用乙醇或異丙醇沉澱DNA、在大腸桿菌中的轉化等都是本領域技術人員所熟知的，並在文獻中有充分的描述[Maniatis T.等，「Molecular Cloning，a Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982;Ausubel F.M.等(eds)，「Current Protocols in Molecular Biology」，John Wiley Sons，New York，1987]。
pBR322，pUC型質粒和M13系噬菌體是從市場上購得的(Bethesda Research Laborataries)。
關於連結，先將DNA片段用瓊脂糖或丙烯醯胺電泳按其大小分離，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉澱，然後按照供應商的推薦方法在噬菌體T4的DNA連結酶(Biolabs)存在下孵育。
按照供應商的說明，用大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅰ的klenow片段(Biolabs)對凸起的5′末端進行補充。按照製造商的推薦方法，在噬菌體T4的DNA聚合酶存在下對凸起的3′末端進行破壞。凸起的5′末端經核酸酶S1仔細處理進行破壞。
用合成寡聚脫氧核苷酸的體外定向突變是用Amersham提供的試劑盒按Taylor等開發的方法[Nucleic Acids Res.13(1985)8749-8764]來進行的。
用所謂的PCR技術對DNA片段的酶擴增[Polymerase Catalyzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350-1354;Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)335-350]可用「DNA thermal cycler」(Perkin Elmer Cetus)按製造商的說明進行。
用Amersham銷售的檢測盒根據Sanger等研製的方法驗證核苷酸序列。
所用的細胞系在以下實施例中，使用了或可以使用下列細胞系-人胚胎腎細胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)。該細胞系特別含有整合在其基因組中的人腺病毒Ad5基因組的左側部分(12%)。
-人KB細胞系來自人表皮癌，該細胞系及其培養條件可在ATCC得到(CCL17)。
-人Hela細胞系來自人上皮癌，該細胞系以及其培養條件可在ATCC得到(CCL2)。
-狗MDCK細胞系MDCK細胞的培養條件特別由Macatney等作了描述，Science 44(1988)9。
-gm DBP6細胞系(Brough等，Virology 190(1992)624)。該細胞系由含有在MMTV的LTR控制下的腺病毒E2基因的Hela細胞構成。
實施例1本實施例說明失去主要病毒基因後重組腺病毒的可行性。為此，通過體外連結建立了腺病毒中一系列缺失突變體，每種突變體與輔助病毒在KB細胞中進行轉染。該細胞使E1缺失病毒不能繁殖，轉互補是在E1區。
從腺病毒Ad5通過體外消化再連結製備了不同的缺失突變體。為此，按Lipp等描述的技術(J.Virol.63(1989)5133)分離Ad5病毒的DNA，在不同限制性酶存在下進行消化(參見圖3)，然後消化產物在T4 DNA連結酶存在下進行連結。然後在0.8%瓊脂糖SDS凝膠上測定這些不同缺失突變體的大小。再對這些突變體繪圖(參見圖3)。這些不同的突變體含有如下區域mt1片段Ad5 0-20642(SauⅠ)和(SauⅠ)33797-35935之間連結mt2片段Ad5 0-19549(NdeⅠ)和(NdeⅠ)31089-35935之間連結
mt3片段Ad5 0-10754(AatⅡ)和(AatⅡ)25915-35935之間連結mt4片段Ad5 0-11311(MluⅠ)和(MluⅠ)24392-35935之間連結mt5片段Ad5 0-9462(SalⅠ)和(XhoⅠ)29791-35935之間連結mt6片段Ad5 0-5788(XhoⅠ)和(XhoⅠ)29791-35935之間連結mt7片段Ad5 0-3665(SphⅠ)和(SphⅠ)31224-35935之間連結以上製備的每個突變體與Ad.RSVB Gal的病毒DNA(Stratford-Perricaudet等，J.Clin.Invest.90(1992)626)在磷酸鈣存在下在KB細胞中進行了共轉染。轉染後8天收集這些細胞，並收集培養液的上層，然後對KB細胞擴增直到得到每個轉染的原種為50盒(boites)。對每個樣品，用氯化銫梯度將附著體DNA分出並分離。在每例中都觀察到兩條不同的病毒譜帶，抽樣並分析。較重的帶Ad.RSVβGal的病毒DNA，較輕的帶為通過連結產生的重組病毒的DNA(圖3)。後者所得滴度為約108pfu/ml。
用相同方法通過體外連結建立了第二系列的腺病毒缺失突變體。這些不同突變體含有以下區域mt8Ad RSVβGal的0-4623(ApaⅠ)片斷與Ad5的(ApaⅠ)31909-35935片斷連結。
mt9Ad RSVβGal的0-10178(BglⅡ)片段與Ad5的(BamHI)21562-35935片斷連結。
這些含有RSV病毒的LTR啟動子控制下的Lac Z基因的突變體，隨後在缺失了E4區的H2dl808(Weinberg等，J.Virol.57(1986)833)病毒DNA存在下，在293細胞中共轉染。按照這第二種技術，交叉補充不再在E1區而是在E4區。如上所述，該技術使得產生了僅具有E4區作為病毒基因的重組病毒。
實施例2該實施例描述了通過與輔助病毒共轉染融合在質粒中的重組病毒DNA，製備本發明的重組缺陷性腺病毒。
為此，構建了含有Ad5的連接性ITR、包裝序列、在其固有啟動子控制下的E4基因作為異源基因，及RSV病毒的LTR啟動子控制下的Lac Z基因的質粒(圖4)。該質粒稱為pE4Gal，通過克隆並連結下列片段而得(見圖4)。
-來自質粒pFG144(Graham等，EMBO J.8(1989)2077)的HindⅢ-SacⅡ片段。此片段帶有反義的Ad5的ITR序列及包裝序列HindⅢ(34920)-SacⅡ(352)片段。
-Ad5的SacⅡ位點(位於第3827鹼基對)和PstⅠ位點(位於第4245鹼基對)之間的片段。
-pSP72(Promega)的PstⅠ位點(pb32)和SalⅠ位點(pb34)之間的片段。
-質粒pAd LTR GalⅨ的XhoⅠ-XbaⅠ片段，在Stratford-Perricaudet等(JCI90(1992)626)中所述。該片段帶有RSV病毒的LTR控制下的Lac Z基因。
-pSP72質粒的XbaⅠ(pb40)-NdeⅠ(pb2379)片段;
-Ad5的NdeⅠ(pb31089)-HindⅢ(pb34930)片段。位於Ad5基因組右端的該片段含有在其固有啟動子控制下的E4區。它已被克隆在pSP72質粒的NdeⅠ(2379)位點和第一片段的HindⅢ位點之間。
通過在pSP72質粒的指定區中克隆這些不同片段得到了該質粒。應該認識到本領域技術人員從其它材料可以得到相當的片段。
然後質粒pE4 Gal與H2dl 808病毒的DNA在磷酸鈣存在下在293細胞中共轉染。再按實施例1中描述的那樣製備重組病毒。作為唯一的病毒基因，該病毒含有腺病毒Ad5的E4基因(圖4)。其基因組的長度為12kb左右，這使得插入很長(達20kb)的異源DNA成為可能。因此，本領域技術人員可容易地用如上所提及的那些其它治療基因代替Lac Z基因。另外，該病毒帶有pSP72質粒的某些序列，必要時這可通過常規分子生物學技術消除。
實施例3本實施例描述通過整合在一質粒中的重組病毒DNA與輔助病毒共轉染，製備本發明的另一個重組缺陷性腺病毒。
為此，構建了含有Ad5的連接性ITR、包裝序列、在其固有啟動子控制下的Ad2的E2基因作為異源基因，及RSV病毒的LTR啟動子控制下的Lac Z基因的質粒(圖5)。該質粒稱為pE2Gal，通過克隆並連結下列片段來得到(見圖5)。
-來自質粒pFG144(Graham等，EMBO J.8(1989)2077)的HindⅢ-SacⅡ片段。該片段帶有反義的Ad5的ITR序列和包裝序列HindⅢ(34920)-SacⅡ(352)片段。它已與下列片段克隆在質粒pSP72的HindⅢ(6)-PstⅠ(32)位點。
-Ad5的SacⅡ位點(位於第3827鹼基對)和PstⅠ位點(位於第4245鹼基對)之間的片段。該片段已克隆在上述片段的ScaⅡ位點和質粒pSP72的PstⅠ(32)位點之間。
-pSP72(Promega)的PstⅠ(pb32)SalⅠ(pb34)位點間的片段;
-質粒pAdLTR GalⅨ的XhoⅠ-XbaⅠ片段，在Stratford-Perricaudet等(JCI90(1992)626)中有述。該片段帶有RSV病毒的LTR控制下的Lac-Z基因。它已被克隆在pSP72質粒的SalⅠ(34)和XbaⅠ位點之間。
-pSP72質粒(Promega)的XbaⅠ(pb34)和Bam HI(pb46)位點間的片段。
-Ad2的Bam HI(pb21606)-SamⅠ(pb27339)片段。此Ad2基因組的片段含有在其固有啟動子控制下的E2區。它已被克隆在pSP72質粒的BamHI(46)和EcoRV位點之間。
-pSP72質粒的EcoRV(pb81)-HindⅢ(bp16)片段。
通過在質粒pSP72的指定區域克隆這些不同片段得到該質粒。應認識到本領域技術人員可從其它材料得到相當的片段。
然後質粒pE2Gal與缺失E2區的H2dl802病毒(Rice等，J.Vi-rol.56(1985)767)的DNA，在磷酸鈣存在下在293細胞中共轉染。再按實施例1中描述的方法製備重組病毒。作為唯一的病毒基因，該病毒含有腺病毒Ad2的E2基因(圖5)。其基因組長度為12kb左右，這使得插入很長(長達20kb)的異源DNA成為可能。這樣，本領域技術人員可容易地用如上所提及的其它治療基因代替Lac Z基因。另外，該病毒含有中間質粒的某些序列，如有必要這可用分子生物學的常規技術消除。
實施例4本實施例描述與腺病毒的E1、E2和/或E4區互補的細胞系的構建。這些細胞系使得不藉助於輔助病毒可以構建缺失這些區域的本發明的重組腺病毒。這些病毒通過體內重組得到，並可帶有重要的異源序列。
在所述細胞系中，有潛在細胞毒性的E2和E4區被置於一可誘導的啟動子控制之下MMTV的LTR(Parmacia)，它以天然形式或以PNAS90(1993)5603中描述的最小形式被地塞米松誘導;或Gossen和Bujard(PNAS 89(1992)5547)描述的可被四環素抑制的系統。應該認識到也可以使用其它啟動子，特別是例如帶有異源調節區(特別是「增強子」區)的MMTV LTR的變體。在磷酸鈣存在下，相應的細胞用帶有轉錄啟動子和終止子(聚腺苷化位點)控制下的所示基因(腺病毒區和/或葡糖苷酶受體基因)的DNA片段轉染，從而構建本發明的細胞系。該終止子或為所染基因的天然終止子，或為別的終止子如SV40病毒的早期信使終止子。此DNA片段最好還帶有能使選擇轉化細胞成為可能的基因，例如抗geneticine基因。此抗性基因還存在於與前者一起共轉染的不同的DNA片段中。
轉染後，選擇被轉化的細胞，並分析其DNA以證實DNA片段在基因組中的整合。
該技術使得得到了下列細胞系1.帶有MMTV的LTR控制下的Ad5 E2區的72k基因的293細胞;
2.帶有MMTV的LTR控制下的Ad5 E2區的72k基因和糖皮質激素受體基因的293細胞;
3.帶有MMTV的LTR控制下的Ad5 E2區的72k基因和MMTV的LTR控制下的E4區的293細胞;
4.含有MMTV的LTR控制下的Ad5 E2區的72k基因、MMTV的LTR控制下的E4區、及糖皮質激素受體基因的293細胞;
5.帶有MMTV的LTR控制下的E4區的293細胞;
6.帶有MMTV的LTR控制下的E4區和糖皮質激素受體基因的293細胞;
7.帶有在其固有啟動子控制下的E1A和E1B區的gmDBP6細胞;
8.帶有在其固有啟動子控制下的E1A和E1B區和MMTV的LTR控制下的E4區的gmDBP6細胞。
實施例5本實施例描述其基因組中缺失E1、E3和E4基因的本發明的缺陷性重組腺病毒的製備。按照一種有利的實施方式，特別如本實施例和實施例3中所述，修飾本發明的重組腺病毒的基因組使得E1和E4基因至少為非功能性。這樣的腺病毒首先具有整合重要異源基因的能力。另外這些載體由於缺失E4區而提高了安全性，E4區與晚期基因的表達調節有關、與晚期核RNA的穩定性有關、與宿主細胞的蛋白質表達的消除有關及與病毒DNA複製的有效性有關。因此，這些載體帶有轉錄基底噪音和大大減小了病毒基因的表達。最後，特別有利的是這些載體可以產生與野生型腺病毒相當的滴度。
用含有Ad5腺病毒基因組的修飾過的右部的質粒pPY55，或通過與一輔助質粒共轉染(也見實施例1、2和3)，或以互補細胞系方式(實施例4)製備了這些腺病毒。
5.1構建質粒pPY55
a)構建質粒pPY32質粒pFG144[F.L.Graham等EMBOJ.8(1989)2077-2085]的AvrⅡ-BcⅡ片段相當於Ad5病毒基因組的右端，首先將它克隆在由dam-contexte製備的載體pIC19H的XbaⅠ和Bam HI位點之間。這樣就產生了質粒pPY23，它的一個令人感興趣的特徵是來自載體pIC19H克隆的多位點的SalⅠ位點是唯一的，並位於Ad5腺病毒基因組的旁邊。含有Ad5腺病毒基因組右端的質粒pPY23的HaeⅢ-SalⅠ片段從HaeⅢ位點開始位於35614位，它隨後被克隆在載體pIC20H的EcoRV和XhoⅠ位點之間，這就產生了質粒pPY29。該質粒的一個令人感興趣的特徵是來自載體pIC2011克隆的多位點的XbaⅠ和ClaⅠ位點位於克隆產生的EcoRV/HaeⅢ接合處的旁邊。另外，這種接合改變了與ClaⅠ位點緊鄰的核苷酸結構，這使其現在在dam+結構中可甲基化。Ad5腺病毒基因組的XbaⅠ(30470)-MaeⅡ(32811)片段隨後被克隆在由dam-結構製得的pPY29質粒的XbaⅠ和ClaⅠ位點之間，這就產生了質粒pPY30。質粒pPY30的SstⅠ片段相當於Ad5腺病毒基因組的30556位的SstⅠ位點到右末端之間的序列，它最後被克隆在載體pIC20H的SstⅠ位點之間，這就產生了質粒pPY31，圖6給出了其HindⅢ位點間插入段的限制性酶切圖譜。
質粒pPY31用BglⅡ部分消化後，用Bam HI完全消化，然後再連結得到了質粒pPY32。質粒pPY32相當於Ad5腺病毒基因組在質粒pPY31的Bam HI位點與處於30818位的BglⅡ位點間的缺失部分。在圖6中給出了質粒pPY32的HindⅢ片段的限制性酶切圖譜。質粒pPY32的一個特徵是它具有唯一的SalⅠ和XbaⅠ位點。
b)首先將Ad5腺病毒基因組的Bam HI(21562)-XbaⅠ(28592)片段克隆在從dam-結構製得的載體plC19H的Bam HI位點和XbaⅠ位點間，這樣產生了質粒pPY17。該質粒含有Ad5腺病毒基因組的HindⅢ(26328)-BglⅡ(28133)片段，它可被克隆在載體pIC20R的HindⅢ和BglⅡ位點間，以產生質粒pPY34。該質粒的一個特徵是來自克隆多位點的Bam HI位點與腺病毒Ad5基因組的HindⅢ(26328)位點緊鄰。
然後將來自質粒pPY17的腺病毒Ad5基因組的Bam HI(21562)-HindⅢ(26328)片段克隆在質粒pPY34的Bam HI和HindⅢ位點間，這樣就產生了質粒pPY39。質粒pPY39的Bam HI-XbaⅠ片段從結構dam-製得，含有包含Bam HI(21562)和BglⅡ(28133)位點間的腺病毒Ad5的部分基因組，隨後將此片段克隆在從dam-結構製得的載體pIC19H的Bam HI和XbaⅠ位點間。這就產生了質粒pPY47，其令人感興趣的一個特徵是來自克隆多位點的SalⅠ位點與HindⅢ位點相鄰(圖7)。
c)質粒pPY55的構建從dam-結構製得的質粒pPY47的SalⅠ-XbaⅠ片段含有從Bam HI(21562)位點到BglⅡ(28133)位點的腺病毒Ad5的部分基因組，將此片段克隆在質粒pPY32的SalⅠ和XbaⅠ位點間就產生了質粒pPY55。該質粒直接用於獲得至少缺失腺病毒Ad5的E3區(在位於腺病毒Ad5基因組的28133和30518位的BglⅡ位點間缺失)和其整體中的E4區(在MaeⅡ(32811)和HaeⅢ(35614)位點間缺失)的重組腺病毒(圖7)。
5.2製備至少在E4區有一個缺失的腺病毒，優選至少在E1和E4區域有缺失。
a)通過與輔助病毒E4在293細胞中共轉染來製備其原則是表達E4區的「小病毒」(輔助病毒)和至少E3和E4缺失的重組病毒間的轉補。這些病毒或通過體外連結獲得，或通過體內重組後獲得，按下列方案進行(ⅰ)病毒Ad-dl324的DNA(Thimmappaya等，Cell31(1982)543)和質粒pPY55兩者都使用Bam HI消化，首先在體外連結，然後與質粒pEAGal(在實施例2中有述)在293細胞中共轉染。
(ⅱ)用EcoRI消化的病毒Ad-dl324的DNA和用Bam HI消化的質粒pPY55與質粒pE4Gal在293細胞中共轉染。
(ⅲ)都用Bam HI消化的腺病毒Ad5的DNA和質粒pPY55被連結，然後與質粒pE4Gal在293細胞中共轉染。
(ⅳ)用EcoRI消化的腺病毒Ad5的DNA和用Bam HI消化的質粒pPY55與pEA Gal在293細胞中共轉染。
方案(ⅰ)和(ⅱ)使得產生E1、E3和E4區缺失的重組腺病毒;方案(ⅱ)和(ⅳ)使得產生E3和E4區缺失的重組腺病毒。當然，缺失E1區但表達任何一個轉基因的重組病毒DNA可用於代替方案(ⅰ)和(ⅱ)中的病毒Ad-dl324的DNA，目的是產生E1、E3和E4區缺失的重組病毒並表達所述轉基因。
b)用轉補E1和E4功能的細胞系的方法製備這是基於衍生自例如293細胞系的表達E1區，而且還至少表達如可誘導的啟動子控制下的腺病毒Ad5 E4區的開放語句ORF6和ORF6/7的細胞系，能夠同時與腺病毒Ad5的E1和E4區互補的事實。這樣的細胞系描述在實施例4中。
這樣，按照以上描述的方案，通過體外連結或體內重組可得到E1、E3和E4區缺失的重組病毒。無論使用哪一種產生至少E4區缺失的病毒的方案，在所用細胞中轉染以後都觀察到細胞病變效果(表示產生重組病毒)。然後收集這些細胞，在其上清液中通過三次凝集-解凝循環將它們破壞，然後在4000rpm下離心10分鐘。然後所得上清液在新鮮細胞培養物(對方案a來說為293細胞)和能表達E4區的293細胞(對方案b)上擴增。從plage中純化這些病毒，用Hirt的方法(如前所述)分析它們的DNA。然後用氯化銫梯度製備病毒原種(stock)。
實施例6本實施例描述其基因組缺失E1、E3、L5和E4的本發明的缺陷性重組腺病毒的製備。這些載體特別有利，因為L5區編碼一種纖維，它是一種對細胞非常有毒性的蛋白質。
這些腺病毒是從質粒P2通過與不同輔助質粒共轉染而製得的，質粒P2含有腺病毒Ad5基因組的修飾過的右部。它們還可用互補性細胞系來製備。
6.1.構建質粒P2這些質粒含有從Bam HI(21562)位點開始的腺病毒Ad5基因組的全部右側區域，其中已缺失了含有E3、L5和E4基因的XbaⅠ(28592)位點和AvrⅡ(35463)位點間的片段。通過在用Bam HI線性化並脫磷酸的質粒pIC19R中克隆並連結下列片段得到質粒P2(見圖8)-Bam HI(21562)位點和XbaⅠ(28592)位點間的腺病毒Ad5基因組的片段;和-腺病毒Ad5的右端(含右側的ITR)從AvrⅡ(35463)位點開始，到BclⅠ位點(相容性Bam HI)。
6.2.含L5基因的輔助質粒(pITR L5-E4)的構建輔助質粒pITR L5-E4含有基因E4和L5。它相當於實施例2中描述的質粒pE4 Gal，但還含有在腺病毒Ad2的啟動子MLP控制下的編碼纖維(la fibre)的L5區。用下述方式構建了質粒pITR L5-E4(見圖9和10)合成了在5′-3′方向含有HindⅢ位點、纖維的ATG和直達腺病毒Ad5基因組的31089位的NdeⅠ位點的編碼纖維的序列的58pb寡核苷酸。此寡核苷酸5′-3′方向的序列如下所示 5′端的HindⅢ位點和3′端的NdeⅠ位點下劃有單線，纖維的ATG下劃有雙線。
從質粒pMLP10(Ballay等，(1987)UCLA Symposia on molecular and Cellular biology，New Series，Vol70，Robinson etal(Eds)New-York，481)分離了含有腺病毒Ad2的由三部分組成的先導物(leader)的連續啟動子MLP序列的SspⅠ-HindⅢ片段。該片段與上述58pb寡核苷酸被插入質粒pIC19R的NdeⅠ位點和EcoRV位點之間，以提供中間質粒(見圖9)。然後將質粒pE4Gal(實施例2)的SacⅡ(rendu.blunt)-NdeⅠ片段引入該中間質粒的SspⅠ和NddeⅠ位點之間，以產生質粒pITR L5-E4(圖10)。
6.3.在E1、E3、L5和E4區帶有一種缺失的重組缺陷性腺病毒的製備a)在293細胞中通過與輔助病毒共轉染來製備原則是表達L5區或E4和L5區的「小病毒」(輔助病毒)與至少E3、E4和L5缺失的重組病毒間的轉補。
這些病毒按以下方案，或通過體外連結或在體內重組而得到
(ⅰ)都用Bam HI消化的病毒Ad-dl324的DNA(Thimmappaya等，Cell31(1982)543)和質粒P2首先在體外連結，然後與輔助病毒pITRL5-E4(實施例6.2)中293細胞中共轉染。
(ⅱ)用EcoRI消化的病毒Ad-dl324的DNA和用Bam HI消化的質粒P2與質粒pITR L5-E4在293細胞中共轉染。
(ⅲ)均由Bam HI消化的腺病毒Ad5的DNA和質粒P2連結，然後與質粒pITR L5-E4在293細胞中共轉染。
(ⅳ)用EcoRI消化的腺病毒Ad5的DNA和用Bam HI消化的質粒P2與pITR L5-E4在293細胞中共轉染。
方案(ⅰ)和(ⅱ)使得產生缺失E1、E3、L5和E4區的重組腺病毒;方案(ⅲ)和(ⅳ)使得產生缺失E3、L5和E4區的重組腺病毒。當然，可用缺失E1區但可表達任何一種轉基因的DNA代替方案(ⅰ)或(ⅱ)中的病毒Ad-dl324的DNA，目的是產生缺失E1、E3、L5和E4區並表達所述轉基因的重組病毒。
上述這些方案還可用僅含L5區的輔助病毒和用如實施例4中所述的能夠表達腺病毒的E1和E4區的細胞系來實施。
另外，還可能使用能夠表達E1、E4和L5區的互補性細胞系，從而完全避免使用輔助病毒。
轉染後，在實施例5中描述的條件下收集所產生的病毒，、並擴增、純化。
權利要求
1.重組缺陷性腺病毒，含有-ITR序列，-使其包裝的序列，-異源DNA序列，及其中E1基因和E2、E4、L1-L5基因中的至少一種為非功能性的。
2.權利要求1的腺病毒，其特徵在於它來自人、動物、或其混合。
3.權利要求2的腺病毒，其特徵在於來自人的腺病毒選自C組腺病毒，優選選自2或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
4.權利要求2的腺病毒，其特徵在於來自動物的腺病毒選自來自狗、牛、鼠、羊、豬、禽和猴的腺病毒。
5.根據以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於E1和E4基因至少是非功能性的。
6.根據以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於它缺失晚期基因。
7.權利要求1的腺病毒，其特徵在於它包括-ITR序列，-使其包裝的序列，-異源DNA序列，和-含E2基因或其部分基因的區段。
8.權利要求1的腺病毒，其特徵在於它包括-ITR序列，-使其包裝的序列，-異源DNA序列，和-含E4基因或其部分基因的區段。
9.權利要求1的腺病毒，其特徵在於其基因組缺失E1、E2和E4基因。
10.權利要求1的腺病毒，其特徵在於其基因組缺失E1、E3、L5和E4基因。
11.以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於它另外還含有在異源啟動子控制下的功能基因E3。
12.以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於異源DNA序列含有一種或多種治療基因和/或一種或多種編碼抗原性肽的基因。
13.權利要求12的腺病毒，其特徵在於治療基因選自酶、血製品、激素、淋巴因子(白細胞介素、幹擾素、TNF等)、生長素、神經遞質或它們的前體或合成酶、營養素(BDNF、CNTE、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等)、原脂蛋白(ApoAⅠ、ApoAⅣ、ApoE等)、dystrophine或minidystrophine、腫瘤基因抑制劑的編碼基因或編碼凝集相關因子(Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ等因子)的基因。
14.權利要求12的腺病毒，其特徵在於治療基因為反義基因或序列，其在靶細胞中的表達可以控制細胞基因的表達或細胞mRNA的轉錄。
15.權利要求12的腺病毒，其特徵在於編碼能夠在人體中產生抗微生物或病毒的免疫反應的抗原性肽的基因。
16.權利要求12的腺病毒，其特徵在於編碼E.B病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒、偽狂太病毒、或特異性腫瘤的特異抗原性肽的基因。
17.根據以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於異源DNA序列還包括使治療基因和/或編碼抗原性肽的基因在所染細胞中表達的序列。
18.根據以上權利要求之一的腺病毒，其特徵在於異源DNA序列在治療基因的上遊含有指示靶細胞的分泌道中合成治療產物的信號序列。
19.可被腺病毒感染的細胞系，它含有整合在其基因組中的與權利要求1-18之一的缺陷性重組腺病毒互補所需的功能。
20.權利要求19的細胞系，其特徵在於在其基因組中至少含有腺病毒的E1和E2基因。
21.權利要求20的細胞系，其特徵在於它另外還含有腺病毒的E4基因。
22.權利要求19的細胞系，其特徵在於它在其基因組中至少含有腺病毒的E1和E4基因。
23.根據權利要求19-22之一的細胞系，其特徵在於它另外還含有糖皮質激素受體基因。
24.根據權利要求19-23之一的細胞系，其特徵在於E2和E4基因被置於可誘導啟動子的控制之下。
25.權利要求24的細胞系，其特徵在於可誘導啟動子為MMTV和LTR啟動子。
26.根據權利要求19-25的細胞系，其特徵在於基因E2編碼72K蛋白。
27.根據權利要求19-26的細胞系，其特徵在於它從細胞系293得到。
28.含有至少一種權利要求1-18之一的重組缺陷性腺病毒的藥物組合物。
29.權利要求28的藥物組合物，它含有權利要求5-10之一的重組腺病毒。
30.權利要求28或29的藥物組合物，它含有配製針劑的藥用載體。
全文摘要
本發明公開了衍生自腺病毒的新病毒載體、它們的製備和基因治療應用。
文檔編號A61K48/00GK1113390SQ9419059
公開日1995年12月13日 申請日期1994年7月8日 優先權日1993年7月13日
發明者M·佩裡卡狄特, E·萬尼, P·耶和 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司