適用於哺乳動物表達的人源化mfat1基因及其應用的製作方法

2023-05-22 07:25:41

專利名稱：適用於哺乳動物表達的人源化mfat1基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種人源化的mfatl基因。
背景技術：
Omega-3 多不飽 和脂肪酸(omega_3polyunsaturated fatty acids, n_3PUFAs ;又稱n_3, ω-3),是人體生長和健康所必需的物質,屬於18-24碳脂肪酸家族,其碳鏈上具有3個以上的雙鍵，依照第一個雙鍵距離甲基端碳原子不同分為η-3系、η-6系、η-7系、η_9系(即η編號系統，也叫ω編號系統)，n-3PUFAs是指從脂肪酸碳鏈甲基端算起，第一個雙鍵位於第3位碳原子上的多不飽和脂肪酸，屬於亞麻酸類。由於哺乳類細胞不具有能增加雙鍵到第9位原子後的酶，因此，n-3PUFAs是人體必需胺基酸，是細胞膜磷脂的主要成分，在體內不能合成，必須從食物中提供。n_3PUFAs 主要包括 α -亞麻酸(a-1inolenic acid, ALA, 18:3η_3), 二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA, 20: 5n_3), 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA，22:6n-3)。ALA多來自植物油，如亞麻籽、核桃仁及其他種子油，EPA和DHA主要來自魚油，這些成分由於體內不能合成，只能從食物中攝取，因此，被稱為「必需」脂肪酸(essential fatty acid, EFA)。其中α -亞麻酸作為n_3多不飽和脂肪酸的前體,在體內經去飽和與延長反應，生成EPA或DHA等η-3多不飽和脂肪酸，人體內無催化n_6PUFAs向n-3PUFAs轉化的n_3多不飽和脂肪酸脫氫酶。目前n_3PUFAs主要從魚油中獲取，但提煉工藝複雜且產率低。來源於秀_線蟲(Caenorhabditis elegans)的n_3多不飽和脂肪酸脫氫酶基因(fat-Ι)，其編碼產物是η-3多不飽和脂肪酸脫氫酶，可以n-6PUFAs為優先底物，使其脫氫轉化為n-3PUFAs。目前，η-3多不飽和脂肪酸(n_3PUFA)主要成果在心血管方面的研究。它具有降低血脂，改變血液流變學，抑制血小板聚集和血栓形成，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成等作用(Kobayashi M, Sasaki S，Hamada GS.et al.Serum n_3fatty acids, fishconsumption and cancer mortality in six Japanese populations in Japan andBrazil.J Cancer Res.1999;90(9):914-21.Saadatian-Elahi M, Toniolo P, Ferrari P.etal.Serum fatty acids and risk of breast cancer in a nested case—control studyof the New York University Women's Health Study.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.2002;11 (11):1353-60)隨著研究的不斷深入，人們發現n-3PUFA還具有抗腫瘤功能，並且越來越重視其抗腫瘤作用(Barber MD, Ross JA, Preston T, et al.Fish oil-enriched nutritionalsupplement attenuates progression of the acute—phase response in weight-losingpatients with advanced pancreatic cancer.J Nutr.1999; 129(6): 1120-5)。人體血液中的脂肪酸含量測定研究顯示，血液中n-3PUFAs水平和前列腺癌發病率成反比關係(PrattVC, Watanabe S，Bruera E, et al.Plasma and neutrophil fatty acid compositionin advanced cancer patients and response to fish oil supplementation.Br JCancer.2002，87 (12): 1370-1378)。研究結果發現，n_3PUFAs可以通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡(Stoll BA.N-3fatty acids and lipid peroxidation inbreast cancer inhibition.Br J Nutr.2002, 87(3):193-198.Palakurthi SS, FluckigerR, Aktas H, et al.1nhibition of translation initiation mediates the anticancereffect of the n-3polyunsaturated fatty acid eicosapentaenoic acid.CancerRes.2000,60(11): 2919-2925)。基於這些數據，我們對fat I基因進行了改造，得到mfatl基因，以使該基因能夠在哺乳動物中高效表達。我們預期在哺乳動物中表達人源化的mfatl基因，可有效提聞各種轉基因動物的品質。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種人源化的可以在哺乳動物中高效表達的mfatl基因。本發明序列如SEQ ID No:1所示。上述適用於哺乳動物表達的人源化mfatl基因在提高轉基因哺乳動物品質中的應用。其中，所述的哺乳動物為小鼠。其中，所述的提聞轉基因哺乳動物品質，為人源化mfatl基因在哺乳動物體內完成轉化為Omega-3多不飽和脂肪酸的功能；在胰島組織中提高胰島細胞分泌胰島素的水平；提高胰島細胞抵抗細胞因子誘導的凋亡能力。有益效果:本發明的人源化mfatl基因可以用於在哺乳動物中表達，同時在體內完成轉化為Omega-3多不飽和脂肪酸的`功能，在胰島組織中可以有效提高胰島細胞分泌胰島素的水平，另外，可以提高胰島細胞抵抗細胞因子誘導的凋亡能力。


圖1是本發明實施例中構建的pST181轉基因載體的示意圖。圖2是mfatl轉基因和野生型對照小鼠分別分離胰島組織後，用不同濃度的葡萄糖和lOnmol/Ι的胰高血糖素樣肽_1共同處理30分鐘，測量胰島素分泌水平。結果顯示在葡萄糖和胰高血糖素樣肽-1刺激下，mfatl轉基因小鼠的胰島有更高水平的胰島素分泌。圖3是mfatl轉基因和野生型對照小鼠分別分離胰島組織，然後用1.lmmol/1的葡萄糖以及10mmol/l亮氨酸和10mmol/l穀氨酸鹽處理60分鐘,對照是僅用1.lmmol/1的葡萄糖處理，測定胰島素分泌水平。結果顯示在葡萄糖，亮氨酸和穀氨酸鹽刺激下，mfatl轉基因小鼠的胰島有更高水平的胰島素分泌。圖4是mfatl轉基因和野生型對照小鼠分別分離胰島組織，用10 μ mol/1前列腺素E2 (PGE2)預處理，之後分別用50ng/ml百日咳毒素(PTX)處理，沒有百日咳毒素處理的作為對照，然後研究葡萄糖刺激的胰島素分泌水平。結果顯示mfatl轉基因小鼠的胰島組織分泌更多的胰島素。圖5是細胞因子誘導的凋亡測試。從mfatl轉基因小鼠和對照野生型小鼠分離的胰島用細胞因子處理48小時，然後用螢光共聚焦顯微鏡分析。結果顯示mfatl轉基因小鼠可以明顯抑制細胞因子誘導的凋亡。
圖6是細胞因子誘導的凋亡測試的定量統計分析。結果顯示mfatl轉基因小鼠可以明顯抑制細胞因子誘導的凋亡。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1:pST181質粒的構建。首先根據線蟲fatl基因的cDNA序列，根據哺乳動物核苷酸使用頻率進行優化，合成了在哺乳動物中高效表達fatl的cDNA序列(由Geneart合成)，命名為mfatl,這種能廣泛在小鼠中表達fatl的轉基因片段包含有1.7kb的CMV聯合雞β-肌動蛋白(CMV-chicken- β -actin promoter)基因的啟動子、肌肉肌酸激酶增強子muscle creatinekinase (MCK) enhancer,小鼠fatl基因的cDNA(哺乳動物mfat-lcDNA,其編碼區經優化以後在哺乳動物細胞體系中具有有效的翻譯)和牛生長激素基因(bGH)的3』端不翻譯區，且帶有哺乳動物細胞中篩選用 的抗性基因新黴素(Neomycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因一氨苄青黴素(ampicillin)基因(見圖1)。這種能廣泛性表達的β-骨骼肌肌動蛋白(CMV-chicken-β -actin promoter)基因的啟動子可保證下遊基因廣泛性表達。本發明構建的全身性表達mfatl的轉基因載體的全序列如SEQ ID No:1所示，其中586-2285鹼基為基因的啟動子區，第317-533鹼基為MCK enhancer，第2286-3516鹼基為mfatl基因的編碼區，第3572-3796鹼基為bGH3』端不翻譯區，第4275-5778鹼基為新黴素(Neomycin)抗性基因，第6972-7971鹼基為氨苄青黴素(Ampicillin)抗性基因。實施例2:利用原核注射的方法構建轉基因小鼠並進行鑑定。將構建好的pST181轉基因載體，用Bgl II和Rsr II限制性內切酶酶切，回收所需片斷，通過原核注射的方法直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，然後將受精卵植入4-5周齡的代孕C57BL/6母鼠體內。提取mfat-1轉基因小鼠尾部的基因組，利用PCR引物進行擴增，進行基因型鑑定。正向引物為:5』 -GGACCTTGGTGAAGAGCATCCG-3，，反向引物為:5』 -GCGTCGCAGAAGCCAAAC-3 』。得到的438bp的片段為陽性片斷。實施例3:mfat-l轉基因小鼠的表型功能分析。1.小鼠體內組織的脂肪酸測定，mfatl轉入小鼠體內，可以有效地將小鼠體內0mega-6多不飽和脂肪酸轉化為Omega-3多不飽和脂肪酸。提取小鼠鼠尾和胰島組織的脂肪酸，通過氣象色譜的方法測定小鼠鼠尾和胰島組織中不飽和脂肪酸含量，發現實施例2製得的轉基因小鼠的鼠尾和胰島組織較野生型對照小鼠相比，含有更高水平的Omega-3多不飽和脂肪酸，和較低水平的Omega-6多不飽和脂肪酸。如表I所示。表I是本發明實施例3中，轉基因小鼠和對照野生型小鼠鼠尾和胰島組織的脂肪酸測定結果，mfatl轉基因小鼠和野生型對照組小鼠分別取用50mg的尾巴組織和200個胰島。結果說明將mfatl轉入小鼠體內，可以有效地將小鼠體內的0mega-6多不飽和脂肪酸轉化為Omega-3多不飽和脂肪酸。
表權利要求
1.適用於哺乳動物表達的人源化mfatl基因，其全序列如SEQID No:l所示。
2.權利要求1所述的適用於哺乳動物表達的人源化mfatl基因在提高轉基因哺乳動物品質中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的哺乳動物為小鼠。
4.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的提高轉基因哺乳動物品質，為人源化mfatl基因在哺乳動物體內完成轉化為Omega-3多不飽和脂肪酸的功能；在胰島組織中提高胰島細胞分泌胰島素 的水平；提高胰島細胞抵抗細胞因子誘導的凋亡能力。
全文摘要
本發明公開了一種適用於哺乳動物表達的人源化mfat1基因，其全序列如SEQ ID No1所示。本發明還公開了上述人源化mfat1基因在提高轉基因哺乳動物品質中的應用。本發明的人源化mfat1基因可以在哺乳動物中高效表達，從而可以有效改善轉基因動物的品質。
文檔編號C12N15/12GK103074347SQ20131002591
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者戴一凡 申請人:南京華貞生物醫藥科技有限公司