用於預防肝功能障礙的包含蜘蛛酶的藥物組合物的製作方法

2023-05-22 01:51:16 5

專利名稱：：用於預防肝功能障礙的包含蜘蛛酶的藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於預防肝功能障礙的包含*蛛酶(arazyme)作為活性成分的藥物組合物，更確切地涉及一種用於預防肝功能障礙的包含由Aranicolaproteolyticus中得到的踟蛛酶的藥物組合物。
背景技術：
：在韓國，慢性肝病是當今死亡和成人病的一個主要原因。肝具有較大的緩衝能力，但是肝病一旦發生，直到它得到顯著地發展才能被發現，因為在該病的早期幾乎沒有能自我檢測到的症狀。更糟糕地是，尚未確定有效的治療試劑或者診斷方法。肝病的誘因是酒精、藥物、化學物質、病毒性肝炎、代謝性疾病例如膽道疾病，以及自身免疫病，然而仍然有更多的未知誘因。同時，作為解毒、血液存儲和循環以及血量調節的中心，肝臟似乎工作過度，因為現代人更多地與要求更大解毒能力的有害工業材料接觸，以及受到過大的壓力、過度飲酒、抽菸的影響，導致肝損傷、並進一步導致免疫系統的功能障礙且成為其他疾病的誘因。當肝損傷發展為肝纖維化和肝硬化時，大多數慢性肝病中都可檢測到影響預後的併發症及肝細胞瘤。因此，理解肝纖維化的發展以及開發抑制該發展的治療劑是非常重要的。臨床試驗中，肝病的治療劑是由德國Madaus有限公司於19世紀70年代生產的水飛薊素(Silymarin)、美國ParkDavis有限公司生產的Am-AMP、義大利Selvi有限公司提供的Carbaica以及中國的中國科學院藥物所於19世紀80年代提供的DDB,然而這些藥帶來了嚴重的副作用並且療效低。因此，人們迫切需要更經濟、安全和有效的治療劑。人們已經知道肝纖維化和肝硬化是由細胞因子及細胞外基質(ECM)之間的相互作用引起的。受損的肝細胞通過枯否細胞(kupffercells)引起噬菌作用，因此被活化的枯否細胞分泌各種細胞因子活化肝星狀細胞，這已經被認為是肝臟中的一般機制，但最近的報導補充說，受損的肝細胞直接活化肝星狀細胞，即所謂的自分泌。也就是說，一旦由任何原因引起肝細胞損傷導致細胞凋亡發生，TGF-1被表達以活化肝星狀細胞，然後該被活化的肝星狀細胞再次誘導導致細胞凋亡的TGF-1表達，這種惡性循環大概是嚴重肝病的一個原因(SunF等,BiochimBiophysActa2001年2月14曰；1535(2):186-191;JeongWI等，LiverInt.2004年12月；24(6):248-254;MarcinStopa等,J.Biol.Chem,2000年9月；29308-29317;JeongW.I等，AnticancerRes.2002年3-4月；22(2A):869-877;Ishakkg等，AlcoholClinExpRes.1991年；15:45-66;韓國專利申請號2001-0036463)。為了篩選用於預防肝功能障礙的藥物組合物，已經使用微生物、植物和合成的化學品進行了研究，但離工業化仍然有很長的路要走，遺留的問題包括難以獲得目標材料。本發明人試圖找到一種新的蛋白酶，最終發明人從棒絡新婦(Nephilaclavata)中分離了一種新型微生物AranicolaproteolyticusHY-3菌株(strain)(保藏號(AccessionNo):KCTC0268BP;WO01/57222)。接著本發明人從所述新型菌株中分離了一種新型蛋白酶-蜘蛛酶(Arazyme)。該枷蛛酶不僅在低溫和高鹽濃度下表現出出色的蛋白質降解活性，而且在37°C的人體溫度下可被高度活化並在寬pH範圍內表現出非常穩定的活性。本發明人進一步鑑別了這種新型蛋白酶的基因(WO01/57222)。本發明人研究了來自於Aranicolaproteolyticus的踟蛛酶的作用，並通過確認該蜘蛛酶能夠保護肝免受損傷從而能夠有效地用作預防5肝功能障礙的藥物組合物完成了本發明。
發明內容技術問題本發明的目的是提供一種來自於Aranicolaproteolyticus的蜘蛛酶的新用途，其作為藥物組合物用於預防肝功能障礙。技術方案為了實現上述目的，本發明提供一種用於預防肝功能障礙的包含蜘蛛酶作為活性成分的藥物組合物。本發明還提供一種肝病的治療方法，包括給予肝病患者有效劑量的所述藥物組合物。本發明還提供一種用於預防肝功能障礙的保健食品，包含Aranicolaproteolyticus培養液或者從該培養液中分離得到的活性成分-踟蛛酶。本發明還提供一種包含枷蛛酶作為活性成分的細胞凋亡抑制劑。本發明還提供一種包含蜘蛛酶作為活性成分的P-smad3表達抑制劑。本發明還提供一種靶向肝臟中央靜脈的肝細胞損傷抑制劑，該抑制劑包含蜘蛛酶作為活性成分。本發明詳述如下。本發明提供一種P-連環蛋白結合RNA適體。本發明提供一種用於預防肝功能障礙的包含蜘蛛酶作為活性成分的藥物組合物。該發明的蜘蛛酶是一種從Aranicolaproteolyticus中生產的酶，可以通過以下步驟製備1)培養Aranicolaproteolyticus製備其培養液；2)過濾該培養液獲得上清液；以及3)使用樹脂(WO01/57222)純化上清液中的蜘蛛酶。生產蜘蛛酶的優選的菌株是Aranicolaproteolyticus,更優選的菌株是AranicolaproteolyticusHY-3,本發明人已經於1996年7月29日將其在韓國生命工學研究院韓國菌種保藏中心保存，保藏號為KCTC0268BP,但並不總是限於此。AranicolaproteolyticusHY-3是一種從掛蛛的腸中分離的的革蘭氏陰性(Gram-negative)好氧菌，大小為0.50.8mm,圓形，能夠自己移動。AranicolaproteolyticusHY-3對過氧化氫酶表現出陽性反應但對氧化酶(韓國專利號0220091)表現出陰性反應。在本發明中，使用了下述方法獲得的蜘蛛酶。該發明的枷蛛酶為下述多肽中的一種(a)含有序列號1所示胺基酸序列的多肽；(b)與序列號l所示的序列具有至少70%的同源性且與(a)中的多肽具有相同生物學功能的多肽；以及(c)與包含序列號1所示胺基酸序列的多肽在生物學上相同，但是通過替換、刪除、增加和/或插入一種或多種胺基酸修飾的多肽。已知維生素C(L-抗壞血酸)具有抗氧化作用。當由碳-四氯化物(CC14)引發急性肝損傷時，肝中維生素C的水平下降，同時由碳-四氯化物導致的氧化應激傳遞至各個肝細胞，導致肝細胞的凋亡和壞死。SMP30(衰老標記蛋白30)是一種在肝細胞、腎小管以及上皮細胞中被大量表達的體內衰老標記蛋白。大鼠出生後12周內，肝臟中的SMP30逐漸增加，其表達在第12周時達最高。此後，隨著大鼠變老，SMP30水平逐漸降低。據推測，衰老期間SMP30的減少與性激素無關，而是獨立地發生。該蛋白質的主要功能是預防細胞凋亡，通過在維生素C生物合成中起類似葡糖酸內酯酶的作用提高維生素C的水平，以及增加體內維生素C的合成。通過SMP30增加的維生素C在受損細胞中用作抗氧化劑，並由此減少細胞凋亡和壞死。SMP30也參與在細胞凋亡期間流入細胞質的4丐的細胞外消除，這最終有利於預防細胞凋亡。SMP30敲除老鼠被用於比較在缺少SMP30的情況下維生素C與蜘蛛酶對肝的保護作用。將維生素C和蜘蛛酶給予野生型C57BL/6(WT)鼠和SMP30敲除C57BL/6(KO)鼠，以誘發急性肝損傷。組織學觀察中，觀察到了對肝細胞的細胞凋亡的抑制，表明肝臟沒有嚴重受損(參見圖1和2)。在SMP30敲除小鼠肝細胞中，沒有觀察到SMP30免疫反應，然而在野生型小鼠肝細胞中觀察到了特異性的SMP30免疫反應。同時，SMP30在用維生素C和蜘蛛酶處理過的小鼠中比在未用維生素C和蜘蛛酶處理的小鼠中表達更強(參見圖3、4、5和6)。根據細胞損傷和抗氧化活性，SMP30對細胞內鈣的積聚具有抑制作用，因此在用蜘蛛酶處理後的小鼠中，SMP30表達有助於抑制細胞凋亡和壞死。當肝細胞損傷發展成炎症和纖維化時，P-smad3被高度表達。一旦肝細胞受損，在肝細胞、淋巴細胞、肥大細胞和巨噬細胞中會合成TGF-1。接著，TGF-1結合到肝臟中的TGF-1受體II上，以激活它。激活的TGF-1受體II使TGF-1受體I磷酸化，導致TGF-1受體I活化。磷酸化的TGF-1受體I引起Smad2和Smad3的連續磷酸化，然後被磷酸化的Smad2和Smad3(P-smad2/3)形成異寡聚體(heterooligomer)和Smad4。該異寡聚體遷移到該肝細胞的細胞核中，並激發目標基因的轉錄。因此，P-smad3的強表達表明肝細胞嚴重損在野生型鼠組中，與用維生素C和蜘蛛酶處理的組(G3，G4)相比，在用CCU處理的組(G2)中明顯地檢測到P-smad3介導的免疫反應。在SMP30敲除鼠組中，與用蜘蛛酶處理的組(G8)相比，在用CCU單獨處理或用維生素C一起處理的組(G6，G7)中明顯地檢測到P-smad3介導的免疫反應(參見圖7、8、9和10)。此結果表明，SMP30敲除鼠甚至比在相同的CCU刺激下表現出更嚴重的肝細胞損傷。用蜘蛛酶處理的小鼠組中的P-smad3水平比用維生素C處理的組更低。此結果支持了該發現，即枷蛛酶通過TGF-1抑制慢性炎症，並具有出色的肝細胞保護作用。同時，在野生型小鼠組和SMP30敲除小鼠組中，肝細胞中的Smad水平沒有區別(參見圖11、12和13)。CYP2E1表達僅在蜘蛛酶處理過的小鼠肝細胞中被提高了(參見圖14和15)。即，在沒有用蜘蛛酶處理的組中，細胞凋亡和壞死在中央靜脈區域周圍的肝細胞中已經發生了，因此CYP2E1不再被表達。另一方面，在用蜘蛛酶處理的組中，由於^0蛛酶的保護作用，在中央靜脈區域周圍的肝細胞中僅僅觀察到了輕微的損傷，導致了CYP2E1的中度表達。CCU的新陳代謝從C-C1鍵的電子通過細胞色素P450(CYP)形成自由基這一步驟開始。三氯甲基自由基可被氧化或減少。CYP2E1和2B1/2B2使CCU失活，由此CYP2E1水平降低，並因此連續誘導CYP2E1表達。如上文所釋，蜘蛛酶處理通過預防尤其是中央靜脈區域中的由化學物質導致的肝細胞損傷來抑制該受損肝細胞的壞死、提高SMP30表達，降低P-smad3表達並誘導CYP2E1表達。因此，可以理解，本發明的蜘蛛酶具有肝保護作用。並且將蜘蛛酶對Wistar鼠口服給藥，以研究毒性。結果，在O,1250，2500和5000mg/kg的濃度下通過肉眼病理學觀察均沒有觀察到異常症狀。因此，在此次實驗中使用的蜘蛛酶被評價為安全物質，對於大鼠而言，其估計的LDs"直比5000mg/kg大得多。因此，本發明的蜘蛛酶可以被用作預防肝功能障礙的藥物組合物，且還可以被用於預防及治療肝病，例如急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷，酒精性肝病及肝癌。除了蜘蛛酶以外，本發明的組合物還可以包括一種或多種與本發9明的踟蛛酶具有相同或類似功能的活性成分。為了給藥，本發明的合成物還可以包括一種或多種藥學上可接受的的載體。可以通過將選自鹽水、無菌水、林格氏液、緩衝鹽水、葡萄糖溶液、麥芽葡萄糖(maltodextrose)溶液、甘油和乙醇中的多種成分混合來選擇或製備該藥學上可接受的的載體。也可添加其它的常規添加物，例如抗氧化劑、緩衝溶液、抑菌劑等。為製備注射液，例如水溶液，懸浮液和乳液、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑，可以另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑，粘合劑和潤滑劑。本發明的組合物還可以各種疾病或者根據成分按照在Remington'sPharmaceuticalScience(Mack出版公司，EastonPA,1990年18曰)中所述的方法進一步製成合適的劑型。本發明還提供一種肝病的治療方法，包括給予肝病患者有效劑量的藥物組合物的步驟。其中所述肝病包括急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷，酒精性肝病和肝癌。本發明的預防肝功能障礙的藥物組合物可口服或注射(例如，靜脈注射，皮下注射，局部或腹腔注射)給藥。所述組合物的有效劑量可以根據體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法，排洩和疾病的嚴重性來確定。本發明的蜘蛛酶的劑量為每天0.015000mg/kg，優選每天0.0110呢Ag。給藥頻率是一天一次或者優選一天幾次，但並不限於此，並可遵醫囑進行改變。本發明還提供一種包含一種用於預防肝功能障礙的保健食品，包含Aranicolaproteolyticus培養液或者從該培養液中分離得到的活性成分-蜘蛛酶。Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的枷蛛酶可以被用來作為食物添加劑。此時，根據常規方法，可將Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的活性成分蜘蛛酶直接被添加或者與其它食物或成分混合之後添加。活性成分的混合比率根據使用目的(預防、健康或治療)確定。如果生產食品或飲料，Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的4知蛛酶優選以0.0110重量份(weightpart),更優選以0.051重量份添加到原材料中。然而，當被用於長期給藥以改善健康狀況時該含量可以少於上述，但是由於本發明的培養液或枷蛛酶非常安全，因此有效劑量可以多於上述量。對可適用的食品沒有限制，示例有肉類、香腸、麵包、巧克力、糖果、點心、餅乾、比薩餅、拉麵(mmyun)、麵條、包括冰淇淋，湯、飲料、茶葉、飲品、酒類飲品及維生素複合物等的乳製品，事實上，一般生產的各種保健食品都被包括在內。包含本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的踟蛛酶的健康飲料還可以包含各種香料或天然碳水化合物等，如其它飲料。上述天然碳水化合物可以是單糖，如葡萄糖和果糖，雙糖如麥芽糖和蔗糖，多糖如糊精和環糊精，以及帶糖的酒精製品，如xilytole，山梨醇和赤蘚糖醇。作為甜味劑，天然甜味劑如沙馬汀和甜葉菊提取物或人工甜味劑如糖精和阿斯巴甜都可以使用。天然碳水化合物與本發明的組成物的比率優選為每100ml0.01~0.04g，更優選為每100ml0.02~0.03g。除了以上所述的成分以夕卜，本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的幽蛛酶可以包括於各種營養素、維生素、電解質、調味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、精氨酸(arginic)及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH值調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、酒精，用於被添加到蘇打中的碳酸鹽等。本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶也可以包括水果汁，水果飲料和/或可添加到蔬菜飲料中的果肉。所有提到的成分可以單獨或一起添加。事實上那些成分的混合比率並不重要，但是一般來說，每100重量份的本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶中，可以添加每種成分0.010.1重量份。本發明也提供一種包含蜘蛛酶作為活性成分的細胞凋亡抑制劑。本發明還提供一種包含蜘蛛酶作為活性成分的P-smad3表達抑制劑。本發明還提供一種靶向肝臟中央靜脈的以蜘蛛酶作為活性成分的肝細胞損傷抑制劑。參考附圖，本發明的優選實施方案的應用可以被很好地理解，其中圖l是具有急性肝損傷的野生型小鼠(WT)和SMP30敲除小鼠(WO)的肝臟的一組病理照片(H&E染色，A:放大率x33，B:放大率x132),Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；紅線中央靜脈(CV)區域周圍的壞死區域；以及箭頭受損肝細胞；圖2示出了通過病理組織學方法觀察的表現肝損傷的數值，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，踟蛛酶和CCU處理的；肝損傷程度O:根據形態學觀察沒有損傷的證據；肝損傷程度l:在中央靜脈區域周圍的5個肝細胞中的突發性壞死；肝損傷程度2:在中央靜脈區域周圍的5個受損肝細胞中以及未損傷區域中的平坦的壞死；以及肝損傷程度3:肝臟中包括在中央靜脈區域周圍和中央部分的5個肝細胞的全壞死；圖3是具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠的肝臟的一組12免疫組織學照片(放大率x13.2及x66)，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖4是示出了通過免疫組織學方法檢測的SMP30表達的圖表；Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖5是一組示出利用具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠進行免疫印跡的結果的照片，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，缺蛛酶和CCU處理的；圖6示出了通過免疫印跡檢測的SMP30表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，幽蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，踟蛛酶和CCU處理的；圖7是一組示出具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠中的P-smad3的免疫組織學照片，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖8是示出了通過免疫組織化學方法檢測的P-smad3表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖9是一組示出利用具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠中的P-smad3進行免疫印跡的結果的照片；Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，踟蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，雍生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，踟蛛酶和CCU處理的；圖IO是示出了通過免疫印跡檢測的P-smad3表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，踟蛛酶和CCU處理的；圖ll是一組示出具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠中的Smad3表達的免疫組織學照片(放大率x66)，Gl.'野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCl4處理的；G8:SMP30敲除鼠，枷蛛酶和CCU處理的；圖12是示出了通過免疫組織學方法進行檢測的Smad3表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖13是示出了通過免疫印跡進行檢測的Smad3表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，跏蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖14是一組示出具有急性肝損傷的野生型和SMP30敲除鼠中的CYP2E1表達的免疫組織學照片(放大率x66),Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，跏蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；圖15是示出了通過免疫組織學方法檢測的CYP2E1表達的圖表，Gl:野生型鼠，橄欖處理的；G2:野生型鼠，CCU處理的；G3:野生型鼠，維生素C和CCU處理的；G4:野生型鼠，蜘蛛酶和CCU處理的；G5:SMP30敲除鼠，橄欖處理的；G6:SMP30敲除鼠，CC14處理的；G7:SMP30敲除鼠，維生素C和CCU處理的；G8:SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCU處理的。具體實施例方式下面將通過實施例對本發明實用的和目前優選的實施方案進行詳細說明。然而，本領域的技術人員應能理解，在本發明公開內容的基礎上，可以在本發明的精神和範圍內對之進行修改和改進。實施例1:蜘蛛酶的製備為了製備活性成分'蜘蛛酶，，將AranicolaproteolyticusHY-3(KCTC0268BP)在培養基(細菌用胰蛋白腖0.5%，酵母提取物0.5%,氯化鈉0.1%，氯化鉀0.05%，氯化鈣0.02%,硫酸鎂0.02%)中，於22'C下培養18個小時。使用2，的薄膜過濾器對培養液進行薄膜過濾，從中分離出上清液和細胞。用10KDA的膜過濾濃縮分離出的上清液。本發明的蜘蛛酶基本呈現陰離子的特性。因此，通過使用經50mM三(羥基)氨基甲烷鹽酸鹽(tris-HCl)緩衝液(pH7.6)預處理的二乙氨基乙基(DEAE)纖維素的離子交換樹脂和使用經20mM三(羥基)氨基甲烷鹽酸鹽(tris-HCl)緩衝液(pH7.6)預處理的葡聚糖G-75的凝膠過濾交換樹脂對蜘蛛酶進行純化。將純化的酶溶液進行10%SDS-PAGE(十二垸基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠)電泳。結果，確認本發明的踟蛛酶是一種不具有亞基的單體，並顯示了51.5kDa條帶。為了製備蜘蛛酶，可將AranicolaproteolyticusHY-3菌株(KCTC0268BP)在各種工業媒體中進行培養，且它的培養液可以通過各種已知的不同方法進行分離和純化。本發明的跏蛛酶具有以序列ID號1表示的多肽序列以及以序列ID號2表示的多核苷酸序列。實驗例l:實驗組和給藥的構成SMP30是一種重要的衰老標記蛋白，其參與維生素C的生物合成，這表明SMP30通過增加維生素C的合成充當抗氧化劑。在本發明中，12周的雄性野生型C57BL/6(WT)和SMP30敲除C57BL/6(KO)鼠被用於通過CCU引發肝損傷，然後對SMP30與蜘蛛酶之間的關係進行了研究。10隻雄性和20隻雌性SMP30敲除C57BL/6鼠來自於東京都老年病學研究院，然後在韓國慶北大學獸醫學院病理系動物實驗室進行飼養。在通過培育產生的F1鼠中，通過聚合酶鏈反應進行尾部DNA定型來選擇敲除鼠。將野生型鼠在動物實驗室中隔離和適應了7天。在適應期間，對每種症狀進行了檢查，且僅選擇健康的動物。野生型和SMP30敲除鼠均為12周齡，排除了年齡的差異。將大鼠在溫度被調節到22士3'C、溼度被調整為55±10%,且光線也被調節到12L/12D(08:OO開燈，20:OO關燈)的動物設施中適應和飼養。定期檢査環境條件(每三個月)。在環境評估之後，沒有發現重要條件的改變。在整個實驗期間，將大鼠在聚碳酸酯籠中[240Wx390Lx175H(mm)]中飼養，每籠5隻。通過使用油性魔術筆和個體身份證的皮膚標記進行區分。實驗動物(美國，印第安納47374,里奇蒙北四街505,PMI國際營養組織)的飼料經過照射(13.2kGy)消毒之後在任何時間均可提供。自來水經過碳過濾器純化之後可在任何時間使用水瓶進行供給。將四氯化碳在橄欖油中稀釋至0.4ml/kg的濃度，並將其施予大鼠以誘導肝損傷。在注射之後24小時，進行屍體解剖。將野生型鼠和SMP30敲除鼠，按照每種5隻，分成陰性實驗組(G1,G5)、陽性實驗組(G2,G6)、實驗組l中的兩組(G3,G7)以及實驗組2中的兩組(G4，G8)(表l)。對陰性實驗組鼠(G1，G5)腔腹注射橄欖油一次，而對陽性實驗組鼠(G2，G6)腔腹注射CCU(0.4ml/kg)一次。同時，在實施CCU(0.4ml/kg)腔腹注射的前一17天將溶解在自來水中的100mg/kg的維生素C對實驗組l的鼠(G3,G7)口服給藥。在給予CCU24小時之後，對每隻鼠進行屍體解剖，且從每隻鼠中提取樣本用於進行組織病理學檢驗。實驗組的構成如表l所示。表1tableseeoriginaldocumentpage18動物12周齡，雄性，野生型C57BL/6鼠和SMP30敲除(KO)C57BL/6鼠*蛛酶的處理在給予CCU之前口服給藥(100mg/kg)維生素C的處理在給予CCU之前口服給藥(100mg/kg)CCU的處理腹腔給藥(0.4ml/kg=10%CC144ml/kg)實驗例2:對肝細胞的組織病理學觀察為了根據組織病理學檢驗，檢查踟蛛酶對CCl4所致肝損傷的作用，將從屍體解剖獲取的各個肝臟樣本固定在10%中性福馬林中，通過自動組織處理器對被固定的組織進行處理。將處理過的肝細胞用石蠟包埋，並切成4pm厚的小段。乾燥這些小段，並用蘇木精-曙紅(H&E著色)著色，然後在光學顯微鏡下觀察。結果，與野生型鼠(G1，G4)相比，在SMP30敲除鼠(G5，G8)中觀察到了小葉中心壞死和發炎。並且肝細胞中的壞死在用維生素C和蜘蛛酶處理過的野生型鼠(Gl，G4)和SMP30敲除鼠(G5,G8)中均被顯著地抑制了。從組織病理學觀察中獲得的肝損傷的數值如表2所示。表2通過組織病理學觀察獲得的肝損傷的數值等級肝損傷的程度0未檢測到肝損傷的形態學證據1在中央靜脈區域周圍的5個肝細胞中檢測到平坦的(even)但為散發性的壞死2在中央靜脈區域及未損傷區域周圍的5個肝細胞中檢測到平坦的壞死3在包括中央部分以及中央靜脈區域周圍的5個肝細胞在內的所有肝細胞中觀察到大範圍壞死實驗例3:肝細胞中的SMP30表達〈3-l〉肝細胞中SMP30的免疫組織學觀察為了對肝細胞中的SMP3O進行免疫組織學觀察，將用福馬林固定的石蠟包埋的組織切成44pm厚的小段，然後除去石蠟。為了抑制內源性過氧化物酶的活性，將這些小段用3%的&02處理30分鐘，並用O.OlMPBS衝洗。為了提高該組織的抗原表達，將這些小段用0.01M19杼檬酸鹽緩衝液處理，然後使用微波進行熱處理。為了抑制非特異性反應，將這些小段在37'C用20g/ml的朊酶K處理10分鐘，並用PBS進行衝洗，然後封閉(blocking)l小時。接著，將一抗SMP30(日本，Akihitolshigami，1:5000)在4。C處理過夜，然後用PBS衝洗三遍，共5分鐘。將該一抗與生物素結合。將生物素標記的一抗用緩衝液衝洗，將其與HRP(辣根過氧化物酶)偶合的抗生蛋白鏈菌素結合，用緩衝液再次清洗，然後使用Histostantin-plusbulkkit試劑盒(美國ZymedLaboratories公司)在30。C下反應30分鐘。在完全衝洗之後，用3,3-二氨基聯苯胺四水氯化物(3，3畫diaminobenzidinetetrahydrochloried)(DAB,美國ZymedLaboratories公司)溶液著色該樣品，用蒸餾水衝洗，並用Meyer的蘇木精(美國遺傳學研究公司(Researchgenetics,USA))進行反著色，然後在光學顯微鏡下觀察。通過對SMP30的免疫組織學觀察，確認了在SMP30敲除鼠中沒有觀察到SMP30介導的免疫反應，然而在野生型鼠的肝細胞中明確地觀察到了對SMP30呈陽性的免疫反應(圖3和4)。在野生型陰性實驗組(Gl)中的SMP30表達水平比由CCU引發的肝損傷組(G2)高得多。同時，用維生素C或蜘蛛酶處理的組(G3，G4)中的SMP30表達水平比僅用CCU處理的陽性實驗組中的SMP30表達水平高。〈3-2〉通過免疫印跡研究肝細胞中的SMP30表達通過免疫印跡對肝細胞中的SMP30表達進行研究。首先，將在-70。C下冷凍的肝組織在包含0.1mM原釩酸鈉(Na3V04)和蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑(德國，曼海姆，羅氏)的RIPA緩衝液片劑中均質化。將該被均質化的肝樣本在4000rpm，4°C下離心分離IO分鐘，以去除脂肪，並獲得上清液。將該上清液在14000rpm,4。C下再次離心分離20分鐘，再次分離上清液。通過布拉德福法測量蛋白質濃度，且將每個蛋白質樣本以80克/孔的濃度加到10%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，然後進行電泳。該凝膠上的蛋白質被電轉移到PVDF薄膜上(德國，Dassel,Schleicher&Chuell)。加載同等數量的蛋白質，通過考馬斯亮藍染色來確認。用封閉液(blockingsolution)(包含3%的牛血清白蛋白的PBS)封閉1個小時，然後將SMP30(日本，Akihitolshigami，1:5000)與卩-肌動蛋白(美國，聖克魯斯生物技術公司l:500)進行反應。在用包含0.5%吐溫(Tween)200的TBS緩衝液衝洗後，將該薄膜與抗兔酶標記抗體(anti-rabbit-HRP-antibody)(曰本，AkihitoIshigami，1:1000~1:2000),為二抗，在室溫下反應l個小時。將該薄膜用TBS緩衝液完全衝洗，並與持久性化學發光底物(supersignalWestDuraExtendedDurationSubstrate)(美國，PIERCE)反應，在臨床X-射線薄膜(曰本，東京，柯達)上曝光，以研究特異性反應。結果，在野生型鼠中檢測到SMP30表達，但在SMP30敲除鼠中未檢測到SMP30表達(圖5和6)。在野生型鼠組中僅用橄欖油處理過的陰性對照組中SMP30表達最高，但是僅用CCU處理的組2(G2)中的SMP30表達被抑制。同時，與僅用CCU處理過的組相比，用維生素C處理過的組(G3)和用蜘蛛酶處理過的組(G4)中的SMP30也高表。實驗例4:肝細胞中的P-smad3表達肝細胞中P-smad3表達的免疫組織學觀察為了通過免疫組織學方法研究肝細胞中的P-smad3表達，除了使用P-smad3(美國，CellSignalingTechnologyInc,1:200)代替SMP30作為一抗之外，按照與實驗例中所述的相同的方式進行實驗。結果，與野生型鼠組中用維生素C和,蛛酶處理過的組(G3，G4)相比，在僅用CCU處理過的組2(G2)中檢測到針對P-smad3的強免疫反應。在SMP30敲除鼠中，與用蜘蛛酶處理過的組(G8)(圖7和8)相比，在僅用CCU或維生素C處理過的組(G6，G7)中也檢測到該強免疫反應。用蜘蛛酶處理過的組(G4,G8)中的P-smad3表達低於用維生素C處理過的組(G3，G7)。適過免疫印跡檢測肝細胞中的P-smad3表達為了通過免疫印跡研究肝細胞中的P-smad3表達，除了使用P-smad3(美國，CellSignalingTechnologyInc，1:200)代替SMP30和抗兔酶標記抗體(美國，CellSignalingTechnologyInc，1:1000~1:2000)作為一抗之外，按照與實驗例<3-1〉中所述的相同的方式進行實驗。在SMP30敲除鼠(G5，G6，G7，G8)中的P-smad3表達高於野生型鼠(Gl，G2,G3，G4)。特別地，在僅用CCU處理的SMP30敲除鼠組(G6)中檢測到P-smad3表達最高，但是該表達在用維生素C和蜘蛛酶處理的組中均被抑制(圖9和10)。實驗例5:檢測肝細胞中的Smad3肝細胞中的Smad3表達的免疫組織學觀察為了通過免疫組織學織化學方法研究肝細胞中的Smad3表達，除了使用Smad3(美國，SantaCruzBiotechnologyInc，1:100)代替SMP30作為一抗之外，以與實驗例中所述相同的方式進行實驗。結果，在SMP30敲除鼠和野生型鼠中的Smad3表達沒有顯著的區別。也就是說，在所有實驗組中的Smad3表達始終是一致的。<5-2〉通過免疫印跡檢測肝細胞中的Smad3表達為了通過免疫印跡研究肝細胞中的Smad3表達，除了使用Smad3(美國，SantaCruzBiotechnologyInc，1:100)代替SMP30和抗兔酶標記抗體(美國，SantaCruzBiotechnologyInc，1:1000~1:2000)作為二抗之外，以與實驗例中描述的相同的方式進行實驗。結果，所有實驗組中的Smad3表達沒有顯著區別(圖13)。野生型鼠(Gl，G2，G3,G4)和SMP30敲除鼠(G5,G6，G7，G8)中的Smad3表達是一致的。實驗例6:肝細胞中CYP2E1表達的免疫組織學觀察'為了通過免疫組織學織化學方法研究肝細胞中的CYP2E1表達，除了使用CYP2E1(美國，SantaCruzBiotechnologyInc，1:800)代替SMP30作為一抗之外，以與實驗例中描述的相同的方式進行實驗。結果，僅在用蜘蛛酶處理過的組中檢測到CYP2E1的強表達，其它組的表達水平類似(圖14和15)。也就是說，CYP2E1僅僅在用蜘蛛酶處理過的組(G4，G8)中被高度表達。實驗例7:蜘蛛酶的急性細胞毒性試驗進行以下實驗以觀察枷蛛酶在鼠中是否具有急性毒性。將9周齡的SPF(無特定病原體)威斯塔系鼠(韓國，漢城，Orient有限公司)在溫度被調節到22士3i:、溼度被調整為55±10%，且光線也被調節到12L/12D的動物設施(4組，每組4隻鼠)中進行伺養。在使用前將這些鼠隔離和適應一周。整個實驗期間，將這些鼠在聚碳酸酯籠[240Wx390Lx175H(mm)]中飼養，每籠5隻。通過使用石油魔術筆和個體身份證的皮膚標記進行區分。用於實驗動物(美國，PMI國際營養組織)的飼料在消毒之後可在任何時間提供。自來水在通過碳過濾器純化之後可在任何時間使用水瓶提供。將本發明的蜘蛛酶以0、1250、2500及5000mg/kg的濃度溶解在蒸餾水中用於注射，使用針(zonde)將每份蜘蛛酶溶液按照10ml/kg對鼠口服給藥一次。經過一周的適應期之後，將鼠分為4組。在10周的時對鼠給予不同濃度的踟蛛酶，並檢查一般的症狀。為了評估蜘蛛酶對器官的毒性，在給藥24小時後進行屍體解剖。在對雌性鼠口服給予踟蛛酶之後，研究基於此次給藥的任何症狀，並對鼠的行為、外觀和生物學功能也進行觀察，以評估毒性。結果，未觀察到與姿態、行走、脾氣和抽搐有關的特定症狀。對鼠的外觀表也進行了仔細地觀察，結果，在毛皮、眼周區域、耳朵、外生殖器，四肢和尾巴處未檢測到改變。也對生物學功能例如呼吸，流涎，糞便和嘔吐進行了觀察，但沒有發現異常症狀。在給予幽蛛酶24小時後進行屍體解剖。肉眼觀察的屍體解剖的結果也與上述一致，表明該給予蜘蛛酶沒有導致各器官中的任何異常症狀或紊亂。估計踟蛛酶的LD5o遠遠大於5000mg/kg。通過顯微鏡，沒有在器官例如肝、心、肺和脾中觀察到病理變化。本發明組合物的製備實施例如下文所述製備實施例l:藥物製劑的製備粉末的製備蜘蛛酶乳糖將上述組分混合併製成粉末，填充於密封袋內。片劑的製備玉米澱粉乳糖硬脂酸鎂按照常規的片劑製備方法將上述組分混合，製成片劑膠囊的製備踟蛛酶玉米澱粉2glg100mg100mg100mg2mg100mg100mg乳糖lOOmg硬脂酸鎂2mg按照常規的膠囊製備方法將上述組分混合，製成膠囊。注射液的製備蜘蛛酶10pg/ml稀鹽酸pH值達到7.6氯化鈉注射液最大lml注射液的製備如下將蜘蛛酶溶解在適量可注射的NaOHBP中，用稀鹽酸BP將其pH值調至7.6。該可注射的NaOHBP用於調節溶液的體積。將該溶液充分混合後填入5mll型玻璃安瓿瓶中。玻璃嘴通過熔化密封。通過滅菌鍋將安瓿瓶在12(TC下消毒至少15分鐘。製備實施例2:食品的製備本發明人已經製備了下述食品，所述食品包含Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的活性成分枷蛛酶麵粉食品的製備通過向小麥麵粉中添加0.110.0重量份本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶製備改善健康的麵粉食品，然後將該麵粉製作成麵包、蛋糕、曲奇、餅乾和麵條。湯和肉湯的製備向湯和肉湯中添加0.11.0重量份本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的枷蛛酶製備出改善健康的肉類產品和麵條碎牛肉的製備向碎牛肉中添加10重量份本發明的Aranicolaproteolyticus培養25液或者從其中分離的踟蛛酶，製備出改善健康的碎牛肉。乳製品的製備向牛奶中添加0.11.0重量份本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶，製備乳製品，例如奶油、冰淇淋等。〈-5〉Sunsik的製備通過常規方法將糙米，大麥，糯米和薏米(薏苡job'stear)凝膠化，然後進行乾燥。將乾燥的混合物分散並粉碎，得到60目大小的穀物粉末。用常規方法將黑豆，黑芝麻和紫蘇蒸熟和乾燥。將該乾燥的混合物分散並粉碎，得到60目大小的穀物粉末。使用真空濃縮機將本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的跏蛛酶減壓真空濃縮，然後使用熱風乾燥器進行噴霧乾燥。用研磨器將該乾燥過的材料粉碎，得到60目大小的穀物粉末。將所製備的穀物、種子，和Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的幽蛛酶的乾燥粉末按以下比率全部混合。穀物(糙米30重量份、薏米15重量份，大麥20重量份)，種子(紫蘇7重量份、黑豆8重量份，黑芝麻7重量份)，Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的幽蛛酶的乾燥粉末(l重量份),靈芝(0.5重量份),地黃(0.5重量份)。製備實施例3:飲料的製備本發明人已經製備了包含Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的活性成分枷蛛酶的飲料如下健康飲料的製備將酸果糖(0.5%)、低聚糖(2%)、糖(2%),鹽(0.5%)和水(75%)與Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶一起均勻混合，然後進行消毒。將該混合物置於小容器例如玻璃瓶或塑料瓶(patbottle)中，得到健康飲料。蔬菜汁的製備將0.5g本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶添加到1000ml的西紅柿或胡蘿蔔汁中，製備得到健康的蔬菜汁。水果汁的製備將0.1g本發明的Aranicolaproteolyticus培養液或者從其中分離的蜘蛛酶添加到1000ml的蘋果或葡萄汁中，以製備得到健康的水果汁。工業實用性如上文所釋，由Aranicolaproteolyticus中製備的本發明的蜘蛛酶抑制受損肝臟中的肝細胞的壞死，提高SMP30表達、抑制P-smd3表達並通過抑制中央靜脈周圍的肝損傷保護肝臟。因此，本發明的蜘蛛酶可以被有效地用作預防肝功能障礙的藥物組合物。序列表文本序列l是Aranicolaproteolyticus的多肽序列，序列2是Aranicolaproteolyticus的的多核苷酸序列。本領域的技術人員應將理解，前述說明書中公開的概念和具體的實施方案可以被輕易地用作修改或設計可實現本發明的相同目的其它實施方案的基礎。本領域的技術人員也將理解，這些等同的實施方案並未背離如所附的權利要求書中所限定的本發明的精神和範圍。權利要求1、一種用於預防肝功能障礙的包含活性成分蜘蛛酶的藥物組合物。2、根據權利要求l所述的預防肝功能障礙的藥物組合物，其中，該跏蛛酶是下列多肽中的一種(a)含有序列號l所示胺基酸序列的多肽；(b)與序列號l所示的序列具有至少70%的同源性且與(a)中的多肽具有相同生物學功能的多肽；以及(c)與包含序列號1所示胺基酸序列的多肽在生物學上相同，但是通過替換、刪除、增加和/或插入一種或多種胺基酸修飾的多肽。3、根據權利要求l所述的預防肝功能障礙的藥物組合物，其中，該枷珠酶從Jram'co/aprafeo/^/c^培養液中分離得到。4、根據權利要求3所述的預防肝功能障礙的藥物組合物，其中，所述Jram'co/",她o(y"CMS為Jraw'co/a/rafeo(yf/cwHY-3(保藏號KCTC0268BP)。5、根據權利要求1-4中任一項所述的預防肝功能障礙的藥物組合物，其中，該組合物用於預防和治療肝病。6、根據權利要求5所述的預防肝功能障礙的藥物組合物，其中，所述肝病選自急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷、酒精肝及肝癌。7、一種肝病的治療方法，包括給予肝病患者有效劑量的權利要求1所述的藥物組合物。8、根據權利要求7所述的肝病的治療方法，其中，該肝病選自急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷、酒精性肝病及肝癌。9、一種用於預防肝功能障礙的保健食品，包含^ram'co/a(y"c附培養液或者從該培養液中分離得到的活性成分枷蛛酶。10、根據權利要求9所述的預防肝功能障礙的保健食品，其中，所述^(ra"/co/"/ra加/,'c附為爿ra"/co/aHY-3(保藏號KCTC0268BP)。11、根據權利要求9所述的預防肝功能障礙的保健食品，其中，該跏蛛酶是下列多肽中的一種(a)含有序列號l所示胺基酸序列的多肽；(b)與序列號l所示的序列具有至少70%的同源性且與(a)中的多肽具有相同生物學功能的多肽；以及(c)與包含序列號1所示胺基酸序列的多肽在生物學上相同，但是通過替換、刪除、增加和/或插入一種或多種胺基酸修飾的多肽。12、根據權利要求911中任一項所述的預防肝功能障礙的保健食品，其中，該保健食品用於預防和改善肝病。13、根據權利要求12所述的預防肝功能障礙的保健食品，其中，該肝病選自急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷、酒精性肝病及肝癌。14、一種包含活性成分蜘蛛酶的細胞凋亡抑制劑。15、一種包含活性成分蜘蛛酶的P-smad3表達抑制劑。16、一種靶向中央靜脈區周圍肝細胞的肝細胞損傷抑制劑，該抑制劑包含活性成分蜘蛛酶。全文摘要本發明涉及一種用於預防肝功能障礙的以蜘蛛酶作為活性成分的藥物組合物，更確切地涉及一種用於預防肝功能障礙的包含由Aranicolaproteolyticus中得到的蜘蛛酶的藥物組合物。本發明的蜘蛛酶可抑制受損肝細胞中的細胞凋亡，增加SMP30表達、抑制P-smad3表達，並通過抑制中央靜脈區域周圍的肝損傷保護肝臟。因此，本發明的蜘蛛酶可被有效地用作預防肝功能障礙的藥物組合物。文檔編號A61K38/43GK101600452SQ200680056897公開日2009年12月9日申請日期2006年12月28日優先權日2006年12月28日發明者孫光熙,樸鎬用,申東夏,鄭圭植申請人:金英賽得科技有限公司