一株烷烴降解菌及其應用的製作方法
2023-05-22 01:57:01 1
專利名稱：一株烷烴降解菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於環境汙染物生物強化技術領域，具體涉及一株烷烴降解菌及其應用。
背景技術：
隨著石油工業的發展，石油開採、運輸及煉製加工過程中，大量石油通過各種途徑進入大氣、水體及土壤，已造成嚴重的環境汙染。據美國環境保護署(EPA)估計，在美國約有3飛百萬個地下化學物質和石油儲存倉庫，每年平均約有I %的倉庫會發生洩漏，嚴重影響地表水和地下水的質量,對人的身體健康帶來極大危害。我國約有11萬座加油站,加油站如此密布在城市的大街小巷，一旦出現問題，對地下水將會造成巨大的危害。生物強化技術因其針對性強、效率高和成本低等優點，被認為是目前最有生命力的治理環境汙染的新技術，已廣泛應用於廢水與土壤的治理和修復，成為近年來的研究重點和熱點。高效菌技術的核心是針對目標汙染物篩選出具有優異降解能力的菌種。石油及 其產品是由正構烷烴、直鏈烷烴、芳烴、脂環烴及少量的其他有機物組成的混合物，其中以烷烴的含量最高。目前，已報導降解石油的菌種多為細菌類，其中主要有假單胞菌屬、黃桿菌屬、棒狀菌屬、無色桿菌屬、節桿菌屬和不動桿菌屬等，真菌類對石油類具有良好降解效果的主要為白腐真菌，放線菌中的紅球菌對石油也有很好的降解能力。迄今為止，國內外將冢村氏菌用於處理水體中的烷烴或用於修復土壤中石油類汙染則更是未見報導。
發明內容
本發明旨在克服現有石油類汙染物存在的問題，目的是提供一種烷烴降解菌及其應用，該菌種能高效地降解石油類汙染物中的烷烴組分。本發明所提供的冢村氏菌sp. )C20來源於中國石油化工股份有限公司武漢分公司汙水處理站內受汙染的土壤，經人工富集、平板劃線分離純化所得到。該菌為W^_iTsukainureUa sp.)編號為C20，革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面乾燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態為短杆狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜。過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性。該降解菌16S rDNA的GeneBank的登錄號為JQ806393，於2012年3月23日在中國典型培養物保藏中心(武漢大學)保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2012089。該菌能以正十六烷為唯一碳源和能源進行生長繁殖，能在48 h內將濃度為1000mg/L的正十六烷降解至20mg/L，降解率達98. 0%。該菌對石油類中的烷烴具有高效降解能力，當以柴油為唯一碳源時，該菌能對柴油中的中長鏈烷烴(C12 C24)高效地降解，用於煉油廢水、受石油類汙染水體和受石油類汙染土壤的治理與修復。本發明提供的冢村氏菌sp. ) C20為放線菌,不僅對石油中的燒烴具有良好的降解作用，而且在降解過程中還會產生生物乳化劑，由於生物乳化劑屬於表面活性物質，分子由疏水和親水兩部分構成，同時具有親脂和親水的性質，因此可增加油水的接觸面積，從而促進微生物對石油類汙染物的生物降解效果。與現有技術相比,本發明的冢村氏菌sp. ) C20能以正十六燒為唯一碳源和能源進行生長繁殖，對石油類汙染物有較強的降解能力，並且在降解烷烴組分的同時還可產生生物乳化劑，能夠提高烷烴和石油類汙染物在水中的溶解度，更有利於煉油廢水的生物強化處理，亦利於水體和土壤中石油類汙染物的治理與生物修復。
圖I為冢村氏菌(TiwAa皿reJ7a sp. ) C20降解正十六燒的效果 圖2為冢村氏菌sp. ) C20對柴油降解前後的氣相色譜 圖3為冢村氏菌sp. )C20對添加較高濃度正十六烷的煉油廢水強化處
理效果圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明做進一步描述，並非對其保護範圍的限制。實施例I :冢村氏菌sp. )C20的分離、鑑定及其對燒烴的降解性能 菌源採自中國石油化工股份公司武漢分公司汙水處理站內受汙染的土壤，距表層2
4 cm油泥混合物，呈黑褐色。將採集的土樣2g加入到100 mL含200 mg/L正十六烷的LB培養基(蛋白腖Iwt%，氯化鈉Iwt %，酵母抽提物O. 5 wt%)中，加入15 20顆滅菌的玻璃珠，在30°C和150 r/min條件下活化培養24 h。靜置10 min，取2 mL培養液轉接至100 mL正十六烷無機鹽培養集中，相同條件馴化培養I 2 d，梯度轉接4次，其中正十六烷濃度分別為200、500、1000、2000 mg/L。將含正十六烷2000 mg/L的培養液梯度稀釋，並塗布於無機鹽平板上，30°C培養24 h後，挑選邊緣清晰的菌落，經LB平板劃線純化至獲得單菌落，分別進行正十六烷降解試驗。正十六烷含量採用高壓氣相色譜方法測定。無機鹽培養基的組成如下(g/L) =(NH4)2S04 為 Ig ；Κ2ΗΡ04 · 3H20 為 O. 5g ；KH2PO4 · H2O 為 O. 5g ；NaCl 為 Ig ；MgS04 · 7H20 為 0. 2g ;FeSO4 · 7H20 為 0. 03g ；CaCl2 · 2H20 為 0. 002g ;去離子水為 I L ;自然 pH。烷烴降解菌C20為革蘭氏陽性菌，菌落呈橘黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面乾燥，中心凸起；過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性。將烷烴降解菌C20接種於LB培養集中，於37°C搖床(150 r/min)培養14 h，離心收集菌體，重懸，加溶菌酶和SDS破壁，用酚-氯仿法提取基因組DNA，並採用正向引物27f(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』)和反向引物 1492R (5，-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3』)，對其基因組進行PCR擴增，將擴增引物進行測序。16S rDNA基因序列長為1419 bp，然後在GenBank中進行Blast比對。結果顯示,與其序列相似性達到99%的均為Tsukamurel 13 sp,選取其中相似序列，採用Clustal X(l. 83)對所獲得的核苷酸序列進行比對分析，得到序列之間的相似度值，並用MEGA 2. O計算出序列的系統進化距離，構建系統進化樹。進化樹顯示，與其相似度最高的菌株都為sp.菌株,其16S rDNA序列如序列表所示。結合菌株的生理生化特性和16S rDNA的測定結果,將其歸屬為冢村氏菌屬iJsukamurelL·sp.)，編號為C20。
將冢村氏菌(TiwAafiM/reJJa sp. ) C20的懸菌液接種到含正十六燒1000 mg/L的無機鹽培養基中，分別測定不同時間剩餘的正十六烷濃度，測定結果如圖I所示，菌株在前8h內處於生長延滯期，8 h後降解菌適應環境，降解速率逐漸提升，在8 24 h為快速降解期，36 h時剩餘正十六烷的濃度降低到200 mg/L。36 48 h期間降解速率減慢，在培養48 h時，殘留正十六烷濃度僅為20 mg/L，表現出很好的降解性能。實施例2 :pH對冢村氏菌(TiwAaffitfrejUa sp. ) C20降解性能的影響
向無機鹽培養基接種2vol%的冢村氏菌iTsukamurella sp. ) C20菌懸液,調節無機鹽培養基為不同的pH值(5.0 8.0)，在起始正十六烷濃度為1000mg/L的條件下，培養36 h，測定pH值對C20降解正十六烷的影響，結果見表I。由表I表明，在pH為5. (T 7.0範圍內，隨著培養基中PH的升高，菌株C20降解烷烴能力增加，pH為7時，降解能力最強，降解率達79. 4 % ;pH為8. 0時，降解率下降至54. 2%，而pH為6. 0時的降解率卻達到了 65. 1%， 說明菌株C20在中性或弱偏酸性環境中對烷烴的降解能力較強。表I pH對菌株C20降解正十六烷性能的影響
初始卩爿降解率(％)
5 0 23. 1%
5 5 45. 7%
6 0 65. 1%
6 5 78.9%
TTo 79.4%
ITl TL 2%
87o~ 154. 2%
本實施例說明冢村氏菌(sp. ) C20在中性和弱偏酸性的pH範圍內均具有較強的降解能力，鹼性條件下該降解菌的活性會受到一定的抑制。實施例3 :冢村氏菌(TiwAaffitfreJrJa sp. ) C20對柴油的降解
將2vol%的冢村氏菌(TiwAafiM/reJJa sp. ) C20接種於添加有800mg/L柴油的無機鹽培養基中，於37°C和150r/min的搖床培養，分別培養8、12、18和23 h，取樣，氣相色譜法分析菌株對柴油的降解率，同時以不加菌的樣品為對照。從表2和圖2看出，雖然在初始的
12h內，柴油組分揮發損失達14. 2%,但加入菌株TiwAaffitfreJJa sp. C20的降解率已達到58. 1%，表明該菌能降解柴油中的大部分烷烴。從圖2看出，該菌對烷烴組分(C12 C24)有很好的降解效果。表2菌株C20對柴油的降解效果
不Ml錮菌
SBJ31J
ISMA剛
23Mj6711
本實施例說明冢村氏菌(Tsukamurella sp. ) C20不僅可以降解正十六焼，對柴油中的C12 C24中長鏈烷烴組分也具有很好的降解性能，為該菌對煉油廢水的生物強化處理和對受石油類汙染的土壤的生物修復提供了依據。實施例4 :冢村氏菌皿re77a sp. ) C20所產生的生物乳化劑的提取
將2vol%的冢村氏菌sp. ) C20接種於含500 mg/L的正十六燒無機鹽培養基中，37 1搖床培養(150 r/min) 3 d，取出培養液，用紗布脫脂棉過濾、離心和去菌體(菌體於45°C烘箱烘乾)，取一定量上清液，調pH為2，置於冰箱過夜，將上清液加入等體積的氯仿/甲醇提取，蒸乾，乾燥後的晶體再用氯仿洗滌，再蒸乾，得到白色生物表面活性劑。將5 mL培養液與5 mL石蠟混合，超聲波震蕩20 min,靜置I h，乳化指數達63%，表明冢村氏菌(Tsukamurella sp. ) C20產生的乳化劑具有較好的乳化性能。本實施例說明冢村氏菌sp. )C20不僅能利用正十六燒為唯一碳源和能源進行生長繁殖，而且在降解過程中還能產生具有表面活性作用的生物乳化劑，為其促進石油類汙染物的生物修復提供了理論依據。
實施例5sp. ) C20對添加較高濃度正十六烷的煉油廢水的強化處理
在錐形瓶中，將冢村氏菌sp. )C20投加到中石化的活性汙泥中，設置3組實驗考察其對正十六烷的去除效果。(a) 32 mL的煉油廢水+33 mL的無機鹽培養基+500 mg/L的正十六燒+30 mL的活性汙泥+5 vol %的C20菌懸液；
(b)32 mL的煉油廢水+33 mL的無機鹽培養基+500 mg/L的正十六燒+30 mL高壓滅菌後的活性汙泥+5 vol %的C20菌懸液；
(c)32 mL的煉油廢水+38 mL的無機鹽培養基+500 mg/L的正十六烷+30 mL活性汙泥。於37°C搖床(150 r/min)培養。間隔一定時間，取樣測定培養液中正十六烷的殘留濃度，結果如圖3所示冢村氏M ^Tsukamure113 sp. ) C20起到了明顯的生物強化作用，並在24 h內將添加500 mg/L正十六烷的煉油廢水中的正十六烷完全去除。本具體實施方式
為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的。本具體實施方式
的冢村氏菌sp. )C20能以正十六燒為唯一碳源和能源進行生長繁殖，對石油類汙染物有較強的降解能力，並且在降解烷烴組分的同時還可產生生物乳化劑，能夠提高烷烴和石油類汙染物在水中的溶解度，更有利於煉油廢水的生物強化處理，亦利於水體和土壤中石油類汙染物的治理與生物修復。
權利要求
1.一株燒烴降解菌，經鑑定為冢村氏菌sp.),編號為C20,保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2012年3月23日，保藏編號為CCTCC NO: M2012089，菌株.16S rDNA 的 GenBank 登錄號為 JQ806393，其特徵在於冢村氏菌(sp. ) C20為革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面乾燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態為短杆狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜；該菌的過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性，能利用正十六烷作為唯一碳源和能源進行生長繁殖。
2.如權利要求I所述燒烴降解菌的應用，其特徵在於所述冢村氏菌sp. )C20以正十六烷為唯一碳源和能源進行生長，用於煉油廢水、受石油類汙染水體和土壤的治理與修復。
3.根據權利要求2所述烷烴降解菌的應用，其特徵在於所述的石油類為烷烴中的C12-C24 組分。
全文摘要
本發明公開了一株烷烴降解菌及其應用。本發明所提供的一株烷烴降解菌C20屬於冢村氏菌(Tsukamurellasp.)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年3月23日，保藏編號為CCTCC NO:M 2012089，菌株16SrDNA的GenBank登錄號為JQ806393。該菌為革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面乾燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態為短杆狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜。該菌48h內對濃度為1000mg/L的正十六烷降解率高達98%，能高效降解柴油中的中長鏈烷烴(C12-C24)，並代謝產生能促進油類溶解的生物乳化劑。該菌應用於煉油廢水、受石油類汙染水體和土壤的生物強化處理與修復，應用前景良好。
文檔編號B09C1/10GK102703348SQ20121016594
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者姚嫚, 遊海, 王巧鳳, 許龍龍, 顏家保, 魏鑫 申請人:武漢科技大學