一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管的製作方法

2023-05-22 01:38:21

一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管的製作方法
【專利摘要】本申請涉及分子生物學領域，特別是核酸擴增與檢測領域。具體而言，本申請涉及一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及一種擴增和檢測核酸的方法，其包括使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管用於製備試劑盒的用途。
【專利說明】一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管
【技術領域】
[0001]本申請涉及分子生物學領域，特別是核酸擴增與檢測領域。具體而言，本申請涉及一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及一種擴增和檢測核酸的方法，其包括使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管用於製備試劑盒的用途。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈式反應技術(以下簡稱PCR技術)，是一種在體外快速擴增DNA的技術，其通常包括多個循環，每個循環包括變性、退火和延伸三個步驟，並且在理想狀態下，每經過一個循環，目的核酸分子的數目就擴增一倍。一般而言，經過30-40個循環後，目的核酸分子數目就能擴增到原來的近IO9倍。因此，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的最有效方法，並且所獲得的核酸分子可用於進一步的分析和檢驗。
[0003]目前，PCR技術已廣泛地應用於基礎研究和應用研究。例如，在基礎研究中，PCR作為一個「無細胞基因擴增系統」，可用於克隆基因，並由此可對基因組DNA進行直接序列分析，檢測突變位點，分析染色體重組等。在應用研究中，PCR則可以用於傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測、產前診斷、法醫研究等。美國專利4，683，202 ；4, 683, 159 ;4，800，159 ；4，965，188等已對PCR技術做出了詳細描述。
[0004]DNA的體內擴增是指，在細胞內有關因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA鹼基互補配對，形成引物單鏈DNA複合物；在0嫩聚合酶作用下，沿著5』 -3』方向，按鹼基互補配對原則，在引物3』端開始，逐一將互補的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。
[0005]DNA分子的體外PCR擴增模擬了體內的三個步驟:首先，在大約95°C的高溫下加熱雙鏈DNA分子，以使雙鏈間的氫鍵斷裂，從而使得DNA熱分解成兩條互補的單鏈DNA分子(這一過程稱為高溫解鏈反應)；然後，溫度迅速降到大約50-65°C的範圍內，在這個溫度下單鏈DNA與引物按鹼基互補配對原則結合(這一過程稱為低溫退火反應);退火反應結束後，溫度又迅速升高到72°C左右，在這個溫度下，在DNA聚合酶以及適當鎂離子濃度的條件下，從引物的3』端開始結合單核苷酸，從而形成一條新的DNA (這一過程稱為延伸反應)。經過一個這樣的過程，原來的一個DNA雙鏈分子就形成了兩個DNA分子，增加了一倍。反覆進行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個過程，就可以獲得數量更多的複製雙鏈，並且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環的模板。
[0006]通過這樣一種循環擴增方法，經過30-40個循環，目的核酸分子數目可由I個增加到原來的近IO9倍。然而，PCR的高靈敏度始終伴隨著這樣的弊端，即，其極其容易被汙染。僅僅I個DNA拷貝的汙染就可能會導致獲得錯誤的檢測結果。因此，為了避免檢測過程中的樣品汙染，國家衛生部明確規定:PCR臨床診斷必須將樣品處理、擴增和檢測在分割的房間進行，而且物流是從樣品處理，擴增至檢測一個方向進行，否則擴增後的試管不能進行開放檢測。
[0007]因此，如何在PCR的全過程中避免汙染也是現今核酸擴增和檢測領域的一個重要研究方向，並且也取得了很多的進展。例如，螢光PCR的出現使得對核酸產物的檢測避免了開管取樣的步驟，從而大大減少了核酸產物汙染的機會。另外，UNG酶的使用也避免了 PCR過程中核酸擴增產物的汙染。然而，以上所述方法均需要昂貴的試劑或精密的儀器，且操作複雜，不適宜用於核酸的現場快速檢測。
[0008]因此，本領域仍然迫切需要一種操作簡單、快速、成本低廉、能夠有效避免核酸擴增和檢測過程中的汙染的方法和裝置。為此，本申請開發出了一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。當使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行核酸擴增和檢測時，在核酸擴增後無需開管即可進行核酸檢測，從而有效避免了擴增產物的外洩以及擴增和檢測中的汙染。此外，使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行核酸擴增和檢測時，操作簡單、成本低廉、無須使用昂貴的試劑或精密的儀器，從而，本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管可廣泛應用於核酸的體外診斷，且特別適宜用於核酸的現場快速檢測。
實用新型內容
[0009]在本申請中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本申請，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0010]如本文中所使用的，術語「擴增」應從廣義上來理解，其包括從RNA或DNA獲得DNA的過程，並且包括但不限於PCR反應，逆轉錄反應，以及其各種變型(例如實時PCR反應)。
[0011]如本文中所使用的，術語「全封閉」是指，當擴增管(I)和檢測管(2)組裝完畢時，二者構成一個完全封閉的環境。
[0012]在一個方面，本申請提供了一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其包括相互配合的用於完成擴增反應的擴增管(1)，和用於對擴增產物進行檢測和結果判讀的檢測管
(2)，其中擴增管(I)與檢測管(2)是密閉連接的，並且擴增管(I)位於檢測管(2)的下方，並且檢測管(2 )包括固定在試紙條容納固定區(7 )中的試紙條(6 )。
[0013]在一個優選的實施方案中，擴增管(I)和檢測管(2)通過螺紋卡口結構、環狀卡口結構或凸點鎖扣結構而實現密閉連接。
[0014]在一個優選的實施方案中，擴增管(I)包括儲液區(3)及核酸擴增區(4)，其中儲液區(3)位於核酸擴增區(4)的上方。任選地，儲液區(3)中預裝有用於核酸擴增的試劑，例如但不限於，引物，dNTP混合物，酶(例如DNA聚合酶或逆轉錄酶)，探針，內標、緩衝液等。
[0015]在一個優選的實施方案中，擴增管(I)是適用於雷諾-本納德對流PCR擴增的擴增管。雷諾-本納德對流PCR擴增是指，利用自然對流(即雷諾-本納德對流)原理進行PCR擴增的方法。該技術是將PCR反應液置於一個封閉的柱形反應腔內，反應腔的上下表面分別進行恆溫控制，通常上端溫度為60°C，下端溫度為97°C。通過上下表面的溫差驅動液體經過不同的溫區，實現PCR擴增。這種方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅動來實現樣品的流動，只需要一個反應腔，並控制其上下兩端的溫度為恆溫，就可以實現PCR擴增。因此，該方法具有操作簡單、成本低廉等優點。[0016]因此，在一個優選的實施方案中，擴增管(I)是適用於雷諾-本納德對流PCR擴增的擴增管，其包括儲液區(3)及核酸擴增區(4)，其中儲液區(3)位於核酸擴增區(4)的上方。
[0017]在一個優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)的高度/內徑比值為3 — 12。在進一步優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)的高度/內徑比值為6 - 9，所述核酸擴增區(4)的最大內徑小於或等於10mm，且所述核酸擴增區(4)的內徑小於所述儲液區(3)的內徑。進一步優選地，所述核酸擴增區(4)的最大內徑小於等於5mm。
[0018]在一個優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)的內腔為橫截面上寬下窄的錐狀中空結構或多層梯形中空結構。
[0019]在另一個優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)的內腔為上下內徑相等的柱狀中空結構。
[0020]在一個優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)上設有可見的體積刻度標識。在一個優選的實施方案中，所述儲液區(3)的外壁上設有防滑溝槽。
[0021]在一個優選的實施方案中，所述核酸擴增區(4)與儲液區(3)的連接處內部為圓滑導角結構。
[0022]在一個優選的實施方案中，擴增管(I)通過螺紋卡口(5)而和檢測管(2)密閉連接。優選地，螺紋卡口(5)位於儲液區(3)的內部。然而，螺紋卡口(5)也可以位於儲液區
(3)的外部。
[0023]在一個優選的實施方案中，試紙條(6)包括用於與擴增產物接觸的樣品墊區(8)及用於反應和呈現結果的檢測區(9)。
[0024]在本領域中，利用試紙條來檢測核酸擴增產物的方法已得到良好建立。例如,一個典型的方法是，在核酸擴增過程中，使擴增產物同時攜帶第一標記和第二標記(例如，通過使用帶有第一標記(例如FITC)的探針以及帶有第二標記(例如生物素)的引物對樣品進行擴增)，並且在試紙條的上遊設置有可隨流體移動的、特異性識別第一標記的檢測劑(例如標記有鼠FITC抗體的乳膠顆粒)，在下遊(S卩，檢測線處)固定有不可移動的、特異性識別第二標記的捕獲劑(例如鏈黴親和素)。由此，當樣品中存在目的DNA時，在擴增後將產生同時攜帶第一標記和第二標記的擴增產物；該擴增產物在流動通過試紙條時，首先結合檢測劑形成擴增產物/檢測劑複合物，然後該複合物進一步被捕獲劑捕獲，並在固定捕獲劑的位置處(即，檢測線處)積累，並最終顯現出有色條帶。另外，為了驗證試紙條的有效性，還可以在檢測線的下遊(即，質控線處)固定特異性識別檢測劑的物質(例如羊抗鼠二抗)，從而檢測劑將在質控線處被捕獲和積累，並顯現出有色條帶。此外，為了驗證擴增過程的有效性，還可以在擴增過程中添加內標，並使內標的擴增產物攜帶第一標記和第三標記(例如，通過使用帶有第一標記(例如FITC)的內標特異性探針和帶有第三標記(例如地高辛)的內標特異性引物)，並且在檢測劑下遊、質控線上遊(即，內標線處)固定有不可移動的、特異性識別第三標記的捕獲劑(例如抗地高辛抗體)。由此，在擴增過程中，內標將被擴增並產生攜帶有第一標記和第三標記的擴增產物，該擴增產物移動通過試紙條時將結合檢測劑，並被特異性識別第三標記的捕獲劑所捕獲，從而在內標線處積累並顯色。關於檢測試紙條以及相關檢測方法的詳細描述，可參見例如，中國專利申請200610109620.4和Magda AnastassovaDineva 等人，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2005 年 8 月，第 4015 — 4021 頁，其全部公開內容通過引用併入本文。
[0025]因此，在一個優選的實施方案中，試紙條(6)的檢測區(9)包括測試線，其用於確定目標核酸分子是否存在於樣品中；並且任選地包括質控線和/或內標線，其中所述質控線用於驗證試紙條本身的有效性；所述內標線用於驗證擴增過程的有效性。在一個優選的實施方案中，試紙條(6 )的檢測區(9 )可包括一條或多條測試線，從而可用於單重或多重檢測(即，檢測一種或多重目標核酸分子)。
[0026]在一個優選的實施方案中，試紙條容納固定區(7)包括試紙條底座(10)和試紙條上蓋(11 )，其中，試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)能夠密閉連接且將試紙條
(6)固定在其中。
[0027]在一個優選的實施方案中，試紙條底座部分(10)包括用於支撐試紙條(6)的橫隔
(12)、用於試紙條(6)定位的凹槽(13)、用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)物理性分隔的橫隔(14)、用於實現檢測管(2)試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的凸條(15)、用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的側邊和試紙條上蓋部分(11)的側邊密閉的凸點(16)、用於與擴增管(I)的螺紋卡口(5)配合的螺紋卡口( 17);並且
[0028]試紙條上蓋部分(11)包括用於將試紙條(6)卡緊的相對於橫隔(12)的橫隔(18)、用於試紙條(6)定位的相對於凹槽(13)的凹槽(19)、用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)物理性分隔的相對於橫隔(14)的橫隔(20)、用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的相對於凸條(15)的凹槽(21)、用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的側邊和試紙條上蓋部分(11)的側邊密閉的相對於凸點(16)的凹槽(22)、用於與擴增管
(I)實現密閉的相對於螺紋卡口( 17 )的螺紋卡口( 23 )。
[0029]在一個優選的實施方案中，試紙條上蓋部分(11)還包括用於觀測試紙條(6)的檢測區(9)的透明視窗(24)。
[0030]在一個優選的實施方案中，在將擴增管(I)和檢測管(2)組裝完畢後，二者構成一個全封閉的環境，從而防止管內的擴增產物外洩，和避免可能的外來物質的汙染。
[0031 ] 在一個優選的實施方案中，在將擴增管(I)和檢測管(2 )組裝完畢後，通過超聲波對各組裝部件進行焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管整體進行包膜處理，從而實現更優的密閉效果。
[0032]在一個優選的實施方案中，擴增管(I)或檢測管(2)由聚合材料製成。在一個優選的實施方案中，擴增管(I)或檢測管(2)由玻璃或塑料製成。
[0033]在一個優選的實施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0034]在一個優選的實施方案中，所述擴增是PCR反應。
[0035]在一個優選的實施方案中，所述擴增是逆轉錄反應。
[0036]在另一個方面，本申請提供了一種擴增和檢測樣品中的目的核酸的方法，其包括使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。
[0037]在一個優選的實施方案中，本申請的方法包括以下步驟:
[0038]a)在擴增管(I)內進行核酸擴增反應；
[0039]b)在擴增反應完成後，倒轉全封閉一體式核酸擴增與檢測管，並且在全封閉條件下，使擴增管(I)內的擴增產物進入檢測管(2)，並轉移至檢測試紙條(6)上，而無需打開一體式核酸擴增與檢測管；和
[0040]c)讀取試紙條(6)上的檢測結果。
[0041]在一個優選的實施方案中，在步驟b)中通過離心或震動使擴增管(I)內的擴增產物進入檢測管(2)，並接觸試紙條(6)的樣品墊區(8)，然後，擴增產物通過毛細作用遷移經過試紙條(6)的檢測區(9)。
[0042]在一個優選的實施方案中，在步驟c)中，優選通過透明視窗(24)，優選通過肉眼讀取試紙條(6)上的檢測結果。
[0043]在一個優選的實施方案中，在檢測結束後，不打開所述一體式核酸擴增與檢測管，並將其整體廢棄於安全處。
[0044]在一個優選的實施方案中，步驟a)包括:
[0045]al)將待檢測的樣品和用於進行擴增反應的試劑添加至核酸擴增區(4)，並且例如通過離心或震動，使反應混合物混勻；
[0046]a2)將檢測管(2)與擴增管(I)密閉連接(例如通過螺紋卡口(5)、螺紋卡口(17)和螺紋卡口(23));和
[0047]a3)將密閉連接後的全封閉一體式核酸擴增與檢測管插入擴增儀進行核酸擴增。
[0048]在一個優選的實施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0049]在一個優選的實施方案中，所述擴增是PCR反應。
[0050]在一個優選的實施方案中，所述擴增是逆轉錄反應。
[0051]在另一個方面，本申請提供了一種試劑盒，其包含本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。本申請的試劑盒可用於在全封閉的條件下，在同一管內進行核酸擴增和檢測。
[0052]在另一個方面，還提供了本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管用於進行核酸擴增和檢測的用途。核酸擴增和檢測作為一個通用的平臺，可廣泛應用於各個方面:例如，其可用於非診斷目的，例如檢測不與疾病相關的特定基因或突變的存在；此外，其也可用於診斷目的，例如傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測、產前診斷、法醫研究等等。
[0053]在另一個方面，還提供了本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管用於製備試劑盒的用途，所述試劑盒用於進行核酸擴增和檢測。
[0054]實用新型的有益效果
[0055]本申請提供了一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管，以及在所述全封閉一體式管內進行核酸擴增及檢測的方法。與現有技術相比，本申請的技術方案將核酸擴增與試紙檢測整合至同一密閉式擴增與檢測反應管內，其具有以下有益效果:
[0056](I)在同一管內進行核酸擴增與試紙條檢測，即擴增與檢測過程是全封閉的，可有效防止核酸擴增產物外洩，避免交叉汙染，並且可有效避免核酸擴增與檢測過程中的汙染；
[0057](2)操作簡便、快速:不同於傳統的試紙條檢測方式(其在擴增完成後還需進行探針添加、孵育和/或稀釋等步驟)，本申請所述的方法僅需在擴增完成後倒轉反應管，通過離心、震動或其他方式，使擴增產物進入檢測管，並與試紙條接觸，靜置數分鐘後即可進行結果觀測；
[0058](3)成本低廉，有效地降低了核酸擴增和檢測的高價格門檻。[0059]此外，本申請的技術方案符合國家衛生部門對核酸診斷試劑的相關規定，對核酸的現場快速檢測具有重要的意義。
[0060]下面將結合附圖和實施例對本申請的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用於說明本申請的實施方案，而不是對本申請所請求保護的範圍的限定。根據附圖和優選實施方案的下列詳細描述，本申請的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說將變得顯然。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1A-圖1D示意性顯示了全封閉一體式核酸擴增與檢測管的結構。其中，圖1A、圖1B、圖1C分別呈現的是正視圖、側視圖及後視圖。圖1D呈現的是檢測管(2)的透視圖。
[0062]圖2A-圖2B示意性說明了本申請的優選全封閉一體式核酸擴增與檢測管的結構。圖2A呈現的是全封閉一體式核酸擴增與檢測管的正視方向分解圖，圖2B呈現的是全封閉一體式核酸擴增與檢測管的後視方向分解圖。其中，試紙條底座部分(10)的凹槽(13)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用於試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用於試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)的物理性分隔；試紙條底座部分(10)的凸條(15)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用於實現試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(16)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22 )，用於實現試紙條底座部分(10 )與試紙條上蓋部分(11)在側邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口(17)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用於實現檢測管(2)與擴增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分(11)的透明視窗(24)用於試紙條(6)的檢測結果觀測。
[0063]圖3A-圖3F示意性說明了使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行核酸擴增與檢測的流程。其中，圖3A表示，將反應試劑注入擴增管；圖3B表示，將擴增管與檢測管扣合；圖3C表示，進行擴增；圖3D表示，在擴增後取出全封閉一體式管；圖3E表示，倒轉全封閉一體式管並輕甩；圖3F表示，靜置數分鐘後觀察檢測結果。
【具體實施方式】
[0064]本申請提供了一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。特別地，圖1A-圖1D和圖2A-圖2B顯示了本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管的一種優選實施方案，其包括相互配合的用於完成擴增反應的擴增管(I)和用於對擴增產物進行檢測和結果判讀的檢測管
(2);其中，擴增管(I)包括位於上方的儲液區(3)及位於下方的核酸擴增區(4)，其中儲液區(3)內部有用於與檢測管(2)實現密閉的螺紋卡口(5);檢測管(2)包括試紙條(6)及試紙條容納固定區(7)。
[0065]在一個優選的實施方案中，試紙條容納固定區(7)包括試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)，用於容納和固定試紙條(6 )。其中，試紙條底座部分(10 )的凹槽(13 )及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用於試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用於試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)的物理性分隔；試紙條底座部分(10)的凸條
(15)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用於實現試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(16)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22 )，用於實現試紙條底座部分(10 )與試紙條上蓋部分(11)在側邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口(17)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用於實現檢測管(2)與擴增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分(11)的透明視窗(24)用於試紙條(6)的檢測結果觀測。
[0066]在一個優選的實施方案中，在將擴增管(I)與檢測管(2)組裝完畢後，可通過超聲波對各組裝部件進行焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管整體進行包膜處理，以實現更優的密閉效果。
[0067]本申請還提供了一種擴增和檢測樣品中的目的核酸的方法，其包括使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。特別地，圖3A-圖3F顯示了本申請方法的一種優選實施方案，其包括:
[0068]I)將待檢測的樣品和用於進行擴增反應的試劑添加至擴增管(I)的核酸擴增區
(4)，並且例如通過離心或震動，使反應混合物混勻；
[0069]2)通過螺紋卡口(5)、螺紋卡口( 17)和螺紋卡口(23)將檢測管(2)與擴增管(I)密閉連接(即，扣合)；
[0070]3)將密閉連接後的管插入擴增儀進行核酸擴增；
[0071]4)在擴增反應完成後，取出全封閉一體式管；
[0072]5)倒轉全封閉一體式管，並通過離心或震動使擴增管(I)內的擴增產物進入檢測管(2)，並轉移至檢測試紙條(6)上；和
[0073]6)通過透明視窗(24)讀取試紙條(6)上的檢測結果。
[0074]在一個優選的實施方案中，在檢測結束後，不打開所述一體式核酸擴增與檢測管，並將其整體廢棄於安全處。
[0075]實施例
[0076]現參照下列意在舉例說明本申請的實施方案(而非限定本申請所請求保護的範圍)的實施例來描述本申請。
[0077]除非特別指明，本申請中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J.SambiOOk等人，分子克隆:實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精編分子生物學實驗指南,第3版,John ffiley&Sons, Inc., 1995中所述的方法進行；酶的使用依照產品製造商推薦的條件。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本申請的實施方案，且不意欲限制本申請所要求保護的範圍。
[0078]實施例1:全封閉一體式核酸擴增與檢測管
[0079]如圖1A-圖1D和圖2A-圖2B所示，本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管包括相互配合的用於完成擴增反應的擴增管(I)和用於對擴增產物進行檢測和結果判讀的檢測管(2);其中，檢測管(2)包括試紙條(6)及試紙條容納固定區(7)。在擴增結束後，將全封閉一體式核酸擴增與檢測管從擴增儀從取出，整管倒轉並通過離心、震動或其他方式，在全封閉條件下，使擴增產物從擴增管(I)進入檢測管(2)，並與其中的試紙條(6)接觸，而後，擴增產物通過毛細現象向試紙條檢測區(9)遷移，並在檢測線和/或質控線上發生抗原一抗體的特異性免疫反應。
[0080]在本實施例中，全封閉一體式核酸擴增與檢測管中的擴增管(I)包括位於上方的儲液區(3)及位於下方的核酸擴增區(4)，其中儲液區(3)內部有用於與檢測管(2)實現密閉的螺紋卡口(5)。
[0081]同時，全封閉一體式核酸擴增與檢測管的檢測管(2)包括試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)，用於容納和固定試紙條(6)。其中，試紙條底座部分(10)的凹槽
(13)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用於試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用於試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)的物理性分隔；試紙條底座部分
(10)的凸條(15)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用於實現試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(16)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22)，用於實現試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在側邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口( 17)及與其相對應的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用於實現檢測管(2)與擴增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分
(11)的透明視窗(24)用於試紙條(6 )的檢測結果觀測。
[0082]另外，在將擴增管(I)與檢測管(2)組裝完畢後，可通過超聲波對各組裝部件進行焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管整體進行包膜處理，以實現更優的密閉效果。
[0083]實施例2:應用實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行的、以DNA為模板的擴增與檢測
[0084]1、實驗材料
[0085]化學試劑:LightCyclerFastStart DNA Master HybridizationMixture (Roche, Germany), 二價續離子，超純水
[0086]儀器耗材:自製核酸擴增儀(參見申請CN201110456811.9);實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其中檢測管(2)中的試紙條(6)在上遊設置了標記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下遊的檢測線(T)上固定有鏈黴親和素(SA)，在更下遊的質控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0087]引物:B3F(生物素標記的):5』-GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3』
[0088]B3R:5』 -AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3』
[0089]探針:B3T(FITC 標記的):5，-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3，
[0090]檢測範本1:HBV全長質粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0091]檢測範本2:超純水
[0092]2、實驗方法:
[0093]a)擴增試劑的配置:lpmol B3F, lpmol B3R, 0.25pmol B3T, 4 μ I LightCyclerFastStart DNA Master Hybridization Mixture, 4mM 二價續離子，10 μ I 檢測範本 I 或檢測範本2,總體積40 μ I,剩餘體積用超純水補足。
[0094]b)核酸擴增:將配置好的擴增反應混合物添加至擴增管(I)的儲液區(3)中，將檢測管(2)與擴增管(I)扣合，並通過離心、振動或其他方式，使擴增反應混合物從儲液區(3)流至核酸擴增區(4)並混勻；將裝有擴增反應混合物的全封閉一體式核酸擴增與檢測管插入自製核酸擴增儀，進行PCR核酸擴增。
[0095]c)擴增產物的檢測:將全封閉一體式核酸擴增與檢測管倒置並通過離心、振動或其他方式，在全封閉條件下，使擴增產物從擴增管(I)進入檢測管(2)，並與試紙條(6)的樣品墊區(8)接觸並被其吸附，而後，擴增產物通過毛細現象向試紙條的檢測區(9)遷移，並依次通過標記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈黴親和素(SA)的檢測線和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質控線，並在檢測線和質控線上發生特異性相互作用。靜置5分鐘後，即可通過透明檢測視窗(24 )肉眼觀測檢測結果。
[0096]實施例2的檢測結果顯示了以HBV全長質粒為範本的檢測結果:檢測線(T線)與質控線(C線)均呈紅色。質控線(C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線(T線)呈紅色說明檢測結果為陽性。實施例2的檢測結果還顯示了以超純水為範本的檢測結果:檢測線(T線)不呈色，質控線(C線)呈紅色。質控線(C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線(T線)不呈色說明檢測結果為陰性。
[0097]實施例3:應用實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行的、以RNA為模板的擴增與檢測
[0098]1、實驗材料
[0099]化學試劑:AccessQuickMaster Mix (Promega), AMV Reverse Transcriptase,DEPC 水。
[0100]儀器耗材:自製核酸擴增儀(參見申請CN201110456811.9)、實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其中檢測管(2)中的試紙條(6)在上遊設置了標記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下遊的檢測線(T)上固定有鏈黴親和素(SA)，在更下遊的質控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0101]引物:C3F(生物素標記的):5』-AGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG-3』
[0102]C3R: 5，-ACCTGGGGCCCCTGCGCGGCAACAAGTATA-3，
[0103]探針:C3T(FITC 標記的):5』 -TCCTAAACCTCAAAGA-3』
[0104]檢測範本1:HCV血清提取模板，濃度為IO4拷貝/ml
[0105]檢測範本2 =DEPC水。
[0106]2、實驗方法:
[0107]a)擴增試劑的配置:lpmol C3F, lpmol C3R, 0.25pmol C3T, 20 μ I AccessQuickMaster Mix (Promega), AMV Reverse Transcriptase8u, 10 μ I 檢測範本 I 或檢測範本 2,總體積40 μ I,剩餘體積用超純水補足。
[0108]b)核酸擴增:將配置好的擴增反應混合物添加至擴增管(I)的儲液區(3)中，將檢測管(2)與擴增管(I)扣合，並通過離心、振動或其他方式，使擴增反應混合物從儲液區(3)流至核酸擴增區(4)並混勻；將裝有擴增反應混合物的全封閉一體式核酸擴增與檢測管插入自製核酸擴增儀，進行逆轉錄擴增。
[0109]c)擴增產物的檢測:將全封閉一體式核酸擴增與檢測管倒置並通過離心、振動或其他方式，在全封閉條件下，使擴增產物從擴增管(I)進入檢測管(2)，並與試紙條(6)的樣品墊區(8)接觸並被其吸附，而後，擴增產物通過毛細現象向試紙條的檢測區(9)遷移，並依次通過標記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈黴親和素(SA)的檢測線和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質控線，並在檢測線和質控線上發生特異性相互作用。靜置5分鐘後，即可通過透明檢測視窗(24)肉眼觀測檢測結果
[0110]實施例3的檢測結果顯示了以HCV血清提取模板為範本的檢測結果:檢測線(T線)與質控線(C線)均呈紅色。質控線(C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線(T線)呈紅色說明檢測結果為陽性。實施例3的檢測結果還顯示了以超純水為範本的檢測結果:檢測線(T線)不呈色，質控線(C線)呈紅色。質控線(C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線(T線)不呈色說明檢測結果為陰性。實施例2和3的結果表明，本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管以及相關方法不僅適合用於DNA分子的擴增與檢測，而且適用於RNA分子的擴增與檢測。
[0111]實施例4:應用實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行的、含內標監控的、以DNA為範本的擴增與檢測
[0112]1、實驗材料
[0113]化學試劑:LightCyclerFastStart DNA Master HybridizationMixture (Roche, Germany), 二價續離子，超純水
[0114]儀器耗材:自製核酸擴增儀(參見申請CN201110456811.9);實施例1的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其中檢測管(2)中的試紙條(6)在上遊設置了標記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下遊的檢測線(T)上固定有鏈黴親和素(SA)，在內標線(I)上固定有抗地高辛抗體，在更下遊的質控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0115]引物:B3F(生物素標記的):5』-GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3』
[0116]B3R: 5 』 -AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3，
[0117]IF (地高辛標記的):5』 -TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCT-3』
[0118]IR:5』 -AACGGACAAGCGGCAAACCTAGATTGTTA-3』
[0119]探針:B3T(FITC 標記的):5』 -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3』
[0120]IT (FITC 標記的):5，-GCCTCATCCTGCTTGTTGGTTAAGCTGA-3』
[0121]內標:T-1(在 pMD-18T 載體中)
[0122]5，-TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCTGTTTTATCATCTTCCTCTGGCCTCATCCTGCTTGTTGGTTAAGCTGAGTTGGTTCTTCTGGTAACAATCTAGGTTTGCCGCTTGTCCGTT-3』
[0123]檢測範本1:HBV全長質粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0124]檢測範本2:超純水。
[0125]2、實驗方法:
[0126]a)擴增試劑的配置:lpmol B3F, lpmol B3R, 0.25pmol B3T, lpmol IF, lpmol IR,0.25pmol IT,4 μ I LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture,4mM 二價鎂離子，2 μ I內標質粒T-1 (濃度為IO5拷貝/ml)，10 μ I檢測範本I或10 μ I檢測範本
2,總體積40 μ I,剩餘體積用超純水補足。
[0127]b)核酸擴增:將配置好的擴增反應混合物添加至擴增管(I)的儲液區(3)中，將檢測管(2)與擴增管(I)扣合，並通過離心、振動或其他方式，使擴增反應混合物從儲液區(3)流至核酸擴增區(4)並混勻；將裝有擴增反應混合物的全封閉一體式核酸擴增與檢測管插入自製核酸擴增儀，進行PCR核酸擴增。[0128]c)擴增產物的檢測:將全封閉一體式核酸擴增與檢測管倒置並通過離心、振動或其他方式，在全封閉條件下，使擴增產物從擴增管(I)進入檢測管(2)，並與試紙條(6)的樣品墊區(8)接觸並被其吸附，而後，擴增產物通過毛細現象向試紙條的檢測區(9)遷移，並依次通過標記有抗FITC抗體的乳膠顆粒、固定有鏈黴親和素(SA)的檢測線、固定有抗地高辛抗體的內標線(I)和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質控線，並在檢測線、內標線和質控線上發生特異性相互作用。靜置5分鐘後，即可通過透明檢測視窗(24)肉眼觀測檢測結果O
[0129]實施例4的檢測結果顯示了以HBV全長質粒為範本的檢測結果:檢測線(T線)、內標線(I線)與質控線(C線)均呈紅色。內標線(I線)呈紅色說明擴增有效，質控線(C線)呈紅色說明試紙條檢測有效，檢測線(T線)呈紅色說明檢測結果為陽性。若質控線(C線)和/或內標線(I線)之任一不呈色，則說明擴增和/或檢測有問題:內標線(I線)不呈色說明擴增存在問題；質控線(C線)不呈色說明檢測試紙存在問題。實施例4的檢測結果還顯示了以超純水為範本的檢測結果:檢測線(T線)不呈色，內標線(I線)與質控線(C線)均呈紅色。內標線(I線)呈紅色說明擴增有效，質控線(C線)呈紅色說明試紙條檢測有效，檢測線(T線)不呈色說明檢測結果為陰性。實施例4的結果還表明，本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管以及相關方法適合用於多重檢測，即，可用於檢測一種或多種目標核酸分子。
[0130]最後應當說明的是:以上實施例僅用以說明本申請的技術方案而非對其進行限制。儘管本申請的【具體實施方式】已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解:根據已經公開的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本申請的保護範圍之內。本申請的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【權利要求】
1.一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其包括相互配合的用於完成擴增反應的擴增管(1)，和用於對擴增產物進行檢測和結果判讀的檢測管(2)，其中擴增管(I)與檢測管(2)是密閉連接的，並且擴增管(I)位於檢測管(2)的下方，並且檢測管(2)包括固定在試紙條容納固定區(7)中的試紙條(6)。
2.根據權利要求1所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，擴增管(I)和檢測管(2)通過螺紋卡口結構、環狀卡口結構或凸點鎖扣結構而實現密閉連接。
3.根據權利要求1所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，擴增管(I)包括儲液區(3)及核酸擴增區(4)，其中儲液區(3)位於核酸擴增區(4)的上方。
4.根據權利要求3所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，擴增管(I)通過螺紋卡口(5)而和檢測管(2)密閉連接。
5.根據權利要求4所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，螺紋卡口(5)位於儲液區(3)的內部或者位於儲液區(3)的外部。
6.根據權利要求1所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，試紙條(6)包括用於與擴增產物接觸的樣品墊區(8)及用於反應和呈現結果的檢測區(9)。
7.根據權利要求6所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，試紙條(6)的檢測區(9)包括一條或多測試線，其用於確定目標核酸分子是否存在於樣品中；並且任選地包括質控線和/或內標線，其中所述質控線用於驗證試紙條本身的有效性；所述內標線用於驗證擴增過程的有效性。
8.根據權利要求1所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，試紙條容納固定區(7 )包括試紙條底座(10 )和試紙條上蓋(11)，其中，試紙條底座部分(10 )和試紙條上蓋部分(11)能夠密閉連接且·將試紙條(6 )固定在其中。
9.根據權利要求8所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，試紙條底座部分(10)包括: 用於支撐試紙條(6)的橫隔(12)， 用於試紙條(6)定位的凹槽(13), 用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)物理性分隔的橫隔(14)， 用於實現檢測管(2)試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的凸條(15)， 用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的側邊和試紙條上蓋部分(11)的側邊密閉的凸點(16 )，和 用於與擴增管(I)的螺紋卡口(5)配合的螺紋卡口( 17);並且 試紙條上蓋部分(11)包括: 用於將試紙條(6)卡緊的相對於橫隔(12)的橫隔(18)， 用於試紙條(6)定位的相對於凹槽(13)的凹槽(19)， 用於實現試紙條(6)的樣品墊區(8)與檢測區(9)物理性分隔的相對於橫隔(14)的橫隔(20)， 用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的相對於凸條(15)的凹槽(21)， 用於實現檢測管(2)的試紙條容納固定區(7)的試紙條底座部分(10)的側邊和試紙條上蓋部分(11)的側邊密閉的相對於凸點(16)的凹槽(22)，和 用於與擴增管(I)實現密閉的相對於螺紋卡口( 17)的螺紋卡口(23)。
10.根據權利要求8所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，試紙條上蓋部分(11)包括用於觀測試紙條(6 )的檢測區(9 )的透明視窗(24 )。
11.根據權利要求1一 10任一項所述的全封閉一體式核酸擴增與檢測管，其特徵是，在將擴增管(I)和檢測管(2)組裝完畢後，通過超聲波對各組裝部件進行焊接，和/或，對所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管整·體進行包膜處理。
【文檔編號】C12M1/34GK203639460SQ201320429171
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】周文彬, 張師音, 葛勝祥, 陳杰裕, 張軍, 夏寧邵 申請人:廈門萬泰滄海生物技術有限公司, 廈門大學