雙半乳糖基二醯甘油酯的製備方法及其應用的製作方法

2023-05-22 01:04:21

專利名稱：雙半乳糖基二醯甘油酯的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥用天然表面活性劑的製備及應用技術領域，涉及雙半乳糖基二醯甘
油酯的製備方法及其應用，具體涉及其製備方法及其作為主動靶向藥物載體的應用。
背景技術：
在雙半乳糖基二醯甘油酯(DGDG)分子中，存在著一個二醯基甘油及兩個彼此連接的半乳糖殘基，第一個半乳糖殘基與甘油骨架上的C-3位-OH基團直接相連。第二個半乳糖殘基與第一個半乳糖以a-l，6糖苷鍵連接，其中，Rp&為不同種類的脂肪酸，在由燕麥麩皮提取的糖脂中，多為棕櫚酸(C15H31C0 ;16:0)、油酸(C17H33C0 ;18:1)、亞油酸(C17H31C0 ;18:2)、亦有少量的亞麻酸(C17H29C0 ; 18:3)、硬脂酸(C17H35C0 ; 18:0)、月桂酸(CnH23C0 ;12:0)等。DGDG不是一種純淨物，而是一組結構相近的混合物，其結構如圖1。從其結構來看，半乳糖單元的羥基和半乳糖醯基甘油為親水性基團，脂鏈為親脂性基團，這使得半乳糖脂具有明顯的兩親性，是一種天然的非離子型表面活性劑。製取半乳糖脂的方法已在專利CN1144478A中公開報導，它是從燕麥粉、麵筋粉、黑麥片中提取分離而得，用乙醇提取，矽膠柱分離，洗脫液分別為不同比例的己烷與異丙醇和丙酮。其方法的主要缺點是所用原料均為糧食，成本較高；乙醇提取液中提取了較多的雜質成分，為下一步分離精製增加了困難；最終由丙酮洗脫液精製所得DGDG中仍有雜質。DGDG的兩親性，使其可作為表面活性物質使用，由於其分子類似截頭圓錐，於水中可自發形成雙分子層，進而形成類脂質體或囊泡。基於以上兩點，DGDG可作為藥物、營養品，化妝品、食品、農用品的載體材料使用。然而以其作為中藥活性物質的載體材料未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種低成本且更為純淨的DGDG提取分離方法。提取物雜質少，精製得到的DGDG為薄層層析純，無剌激性與溶血性，並以其作為中藥活性物質的載體材料。 本發明是這樣實現的燕麥麩皮中含有較多的脂質成分，故選用麩皮而不用造價較高的燕麥粉；由丙酮所得提取物中雜質較少；通過兩次矽膠柱進行分離，最後一次矽膠柱採用分離度較好的氯仿_甲醇系統洗脫，分離得到純淨的DGDG。
其製備工藝步驟是 取燕麥麩皮，用2 4倍量(w/v)丙酮於40 56t:下，提取2 4小時，浸提3次，合併浸提液。浸提液40 5(TC下減壓濃縮，所得棕色油用2 3倍量(w/w)矽膠拌樣。於分離柱中先加入與拌樣矽膠等量的空白矽膠，後加入拌樣矽膠，然後用環己烷-丙酮的10 30 : 90 70 (v/v)混合洗脫液洗脫，用量為柱中總矽膠用量的2 4倍(w/w)，最後用丙酮洗脫，用量為柱中總矽膠用量的2.5 5倍(w/w)。丙酮洗脫液40 5(TC下減壓濃縮，所得黃色粘稠膏狀物為粗製DGDG，將其用1 3倍量(w/w)矽膠拌樣。於分離柱中加入拌樣矽膠2 4倍量(w/w)的空白矽膠，後加入拌樣矽膠，然後用氯仿_甲醇的70 90 : 30 10 (v/v)混合液洗脫，用量為柱中總矽膠量的4 8倍(v/w)，最後用氯仿-甲醇的60 80 : 40 20(v/v)混合液洗脫，用量為柱中總矽膠量的5 10倍(v/w)。氯仿_甲醇的60 80 : 40 20(v/v)洗脫液中即為精製DGDG。 亦可將燕麥麩皮用二氧化碳超臨界進行脫脂，萃取釜壓力為29. 0 31. 2MPa，萃取釜溫度為35 45。C，分一溫度為40 60。C，分二溫度為20 40。C，系統流量為70 83Kg h—、脫脂後的燕麥麩皮用2 4倍量丙酮於40 56"下，提取2 4小時，浸提3次，合併浸提液。浸提液40 5(TC下減壓濃縮，濃縮液用1 3倍量(w/w)矽膠拌樣。於分離柱中加入拌樣矽膠2 4倍量(w/w)的空白矽膠，後加入拌樣矽膠，然後用氯仿-甲醇的70 90 : 30 10 (v/v)混合液洗脫，用量為柱中總矽膠量的4 8倍(v/w)，最後用氯仿_甲醇的60 80 : 40 20(v/v)混合液洗脫，用量為柱中總矽膠量的5 10倍(v/w)。氯仿-甲醇的60 80 : 40 20 (v/v)洗脫液中即為精製DGDG。
所得DGDG以矽膠薄層展開，展開劑為氯仿_甲醇_水混合溶劑，薄層板揮幹後左側噴糖的顯色劑苯胺-二苯胺磷酸，右側噴通用顯色劑10%硫酸乙醇溶液，851:下加熱10分鐘顯色，如圖2: 所得DGDG以矽膠薄層展開，展開劑為氯仿_丙酮_乙酸混合溶劑，薄層板揮幹後右側噴糖的顯色劑苯胺-二苯胺磷酸，左側噴通用顯色劑10%硫酸乙醇溶液，851:下加熱IO分鐘顯色，如圖3 : 通過對比可見所提DGDG較為純淨，在薄層板中未檢出雜質。將所得DGDG用lmol *L—力C1於75。C下水解1小時，與半乳糖標準品共薄層展開，展
開劑分別為乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水=12 :3:3: 2，氯仿-甲醇-水=70 : 21 : 3，氯仿-甲醇-水=16 : 9 : 2，薄層板揮幹後噴顯色劑苯胺-二苯胺磷酸，85t:下加熱5分
鍾顯色，結果分別如圖4、圖5、圖6。由圖可知三種展開劑下Rf相同，說明水解後所得為
半乳糖。所得DGDG樣品tf-NMR(Bruker AX-300型核磁共振波譜儀，TMS內標)如圖7。
應用NMR法測得HLB值如Table 1 :
HLB = 18. 24R+1. 80 Table 1 The result of Hli5 value determination
批號 R HLB
200804
扁05 0.285 7.00
200809 o,316 7,% 應用螢光探針法測得DGDG的臨界膠束濃度為2X 10—3g L—、
DGDG的安全性評價
1、溶血試驗 按《中藥、天然藥物剌激性和溶血性研究的技術指導原則》測得結果，1. 5% DGDG水溶液無溶血現象。
4
2、剌激性試驗(兔耳皮下注射法) 取兩隻家兔，將其兩耳中部的毛褪去，左耳中部皮下注射被試物(1. 5%的DGDG水溶液)O. lmL，右耳中部皮下注射等量生理鹽水。觀察注射局部有無紅腫和充血現象，並與生理鹽水組對照，以判斷樣品有無剌激性。
各時間點觀察結果如Table 2 Table 2 The results of stimulation test _
性，並可
t/h
觀察家兔
0. 250. 50
0. 75
1. 00
2. 004. 0012. 0024. 00
無紅腫、充血現象無紅腫、充血現象無紅腫、充血現象無紅腫、充血現象無紅腫、充血現象無紅腫、充血現象
，藥液與生理鹽水組相比吸收較慢，藥液擴散，藥液繼續擴散，右耳變平
，右耳恢復正常，左耳變平，左耳觸摸仍有少量未吸收藥物無紅腫、充血現象，左耳觸摸正常，藥液完全吸收無紅腫、充血現象，左耳觸摸正常，藥液完全吸收
通過剌激性試驗證明DGDG無剌激性。
由於DGDG中含有酯鍵及不飽和雙鍵，應密閉於低溫(_4°C )下保存。本發明所製備的DGDG雜質少，精製得到的DGDG為薄層層析純，無剌激性與溶血以作為中藥活性物質的載體材料。


圖1為DGDG的分子結構圖2為以氯仿_甲醇_水展開後DGDG的薄層色譜3為以氯仿_丙酮_乙酸展開後DGDG的薄層色譜4為以乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水展開酸水解DGDG的薄層色譜5為以氯仿_甲醇-水(70 : 21 : 3)展開酸水解DGDG的薄層色譜e為以氯仿-甲醇-水(16 :9:2)展幵酸水解dgdg的薄層色譜7為DGDG的tf-NMR譜8為香葉油亞微乳粒徑及其分布9為葫蘆素類脂質體純化後的HPLC色譜10為30min時葫蘆素類脂質體的組織分布11為lh時葫蘆素類脂質體的組織分布12為2h時葫蘆素類脂質體的組織分布13為4h時葫蘆素類脂質體的組織分布圖
具體實施例方式
實施例1 :丙酮提取-矽膠柱分離DGDG 稱取市售燕麥麩皮500g加入1120mL丙酮於56"C下浸提4小時，浸提3次，合併3 次浸提液。浸提液於5(TC下減壓濃縮，濃縮液用100g矽膠拌勻，揮幹溶劑。在分離柱中加 入110g空白矽膠，後加入拌樣矽膠。先以環己烷-丙酮的28 : 72(v/v)的混合液680mL 洗脫，最後用丙酮900mL洗脫。丙酮洗脫液於47t:下減壓濃縮，濃縮物用30g矽膠拌樣， 揮幹溶劑。在分離柱中加入100g空白矽膠，後加入拌樣矽膠。先以6501^氯仿-甲醇的 85 : 15(v/v)混合液洗脫，最後以6801^氯仿-甲醇的70 : 30 (v/v)混合液洗脫，回收氯 仿-甲醇的70 : 30(v/v)混合洗脫液，所得即為精製DGDG。
實施例2 :二氧化碳超臨界脫脂_提取分離DGDG 稱取市售燕麥麩皮500g，放入二氧化碳超臨界萃取設備的萃取釜中，設置萃取壓 力31MPa，萃取溫度42t:，分離器一溫度為48t:，分離器二溫度為25°C ，系統流量為控制在 75 78Kg h—、每半小時於分離器一中接取萃取物，共萃取3小時。取出萃取後的燕麥麩 皮，用1200mL丙酮於5(TC下浸提2. 5小時，浸提3次，合併3次浸提液。浸提液於45"C下 減壓濃縮。濃縮液用25g矽膠拌樣，揮幹溶劑。在分離柱中加入85g空白矽膠，後加入拌 樣矽膠。先以700mL氯仿-甲醇的85 : 15(v/v)混合液洗脫，最後以750mL氯仿-甲醇 的70 : 30(v/v)混合液洗脫，回收氯仿-甲醇的70 : 30(v/v)混合洗脫液，所得即為精製 DGDG。 實施例3 :香葉油DGDG亞微乳的製備 稱取DGDGO. 8g，香葉油2g，油酸鈉0. lg，渦旋混勻後50 °C下保溫，加入 100mL(5(TC )注射用水，攪拌至成均一乳劑，將其用組織勻漿機剪切5min後，入高壓乳勻， 壓力750bar，勻質5次，即得。平均粒徑222. 2nm，粒徑分布較窄。見圖8。
實施例4 :葫蘆素DGDG類脂質體的製備 稱取DGDG75mg，膽固醇8mg，葫蘆素4mg，適量氯仿溶解，倒入茄形瓶中減壓旋轉蒸 發，形成薄膜後，倒入磷酸鹽緩衝液，超聲分散，過0. 45 ii m濾膜兩次即得。所得製劑微柱離 心法純化，除去游離葫蘆素。所以純化製劑異丙醇破壞，進HPLC分析，可檢出葫蘆素藥物 峰。見圖9。 實施例5 :葫蘆素DGDG類脂質體的組織分布 由實施方法四製備製劑，同時製備含藥量相等的葫蘆素水溶液，作為對照。Wistar 大鼠雌雄各半，體重200士20g。按常規組織分布試驗方法，分別測定30min， lh，2h，4h時的 組織分布，結果如圖10 11， 12， 13。
權利要求
雙半乳糖基二醯甘油酯的製備方法，其特徵在於採用以下步驟製備取燕麥麩皮用丙酮提取，浸提液減壓濃縮，所得棕色油狀物用2～3倍量(w/w)矽膠拌樣吸附。在分離柱中先加入空白矽膠，後加入拌樣矽膠，空白矽膠∶拌樣矽膠＝2～4∶1(w/w)，然後用環己烷-丙酮的10～30∶90～70(v/v)混合液洗脫，最後用丙酮洗脫；丙酮洗脫液減壓濃縮，所得粘稠膏狀物用1～3倍量(w/w)矽膠拌樣吸，在分離柱中先加入空白矽膠，後加入拌樣矽膠，空白矽膠∶拌樣矽膠＝2～4∶1，然後用氯仿-甲醇的70～90∶30～10(v/v)混合液洗脫，最後用氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合液洗脫，氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合洗脫液中即為精製DGDG；或將燕麥麩皮用二氧化碳超臨界萃取進行脫脂，脫脂後的燕麥麩皮用丙酮提取，浸提液減壓濃縮，用1～3倍量(w/w)矽膠拌樣吸附。在分離柱中先加入空白矽膠，後加入拌樣矽膠，空白矽膠∶拌樣矽膠＝2～4∶1(w/w)，然後用氯仿-甲醇的70～90∶30～10(v/v)混合液洗脫，最後用氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合液洗脫，氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合洗脫液中即為精製DGDG。
2. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於二氧化碳超臨界萃取釜壓力為29. 0 31. 2MPa，萃取釜溫度為35 45。C，分離器一溫度為40 60。C，分離器二溫度為20 40。C，系統流量為70 83Kg h—、
3. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於燕麥麩皮用丙酮提取中，所用丙酮用量為燕麥麩皮的2 4倍(v/V)，提取溫度為40 56t:，提取時間2 4小時，浸提3次，合併浸提液。
4. 根據權利要求l所述的製備方法，其特徵在於環己烷-丙酮的10 30 : 90 70(v/v)混合洗脫液用量為柱中矽膠總用量的2 4倍(v/w)。
5. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於丙酮洗脫液用量為柱中矽膠總用量的2. 5 5倍(v/w)。
6. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於氯仿-甲醇的70 90 : 30 10 (v/v)混合洗脫液用量為柱中總矽膠量的4 8倍；氯仿-甲醇的60 80 : 40 20 (v/v)混合洗脫液用量為柱中矽膠總用量的5 10倍(v/w)。
7. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所製備的雙半乳糖基二醯甘油酯可以和藥學上可接受的載體結合製成乳劑和類脂質體，其中含有0.01 30% (w/w)的雙半乳糖基二醯甘油酯，其餘為中藥活性物質、極性溶劑和其它輔料。
8. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所製備的雙半乳糖基二醯甘油酯的半乳糖殘基可作為配體，具有肝靶向性。
9. 根據權利要求7或8所述的製備方法，其特徵在於所製備的雙半乳糖基二醯甘油酯製成的乳劑和類脂質體中，其遞送途徑包括皮下、肌肉和靜脈。
全文摘要
本發明涉及一種藥用天然表面活性劑-雙半乳糖基二醯甘油酯(Digalactosyldiacylglycerol，DGDG)製備方法及其作為藥物載體的應用。其製備工藝是將燕麥麩皮用丙酮提取，浸提液濃縮後用矽膠吸附，分別以不同極性的洗脫液洗脫，最終洗脫液中即為精製DGDG。亦可先用二氧化碳超臨界對燕麥麩皮進行脫脂，然後用丙酮提取，提取液濃縮後用矽膠吸附，以不同極性洗脫液洗脫後可得精製DGDG。其親水親油平衡值為7.00～8.15，臨界膠束濃度約為2×10-3g·L-1。該製備方法原料廉價易得，所得DGDG為薄層層析純，無溶血性與刺激性。由於DGDG的兩親和在水中可自組裝形成雙層囊泡的性質，使其可作為藥物的載體。DGDG分子中的半乳糖殘基，可作為配體，特異性的識別肝實質細胞上的半乳糖受體，實現配體介導的主動肝靶向。
文檔編號C07H1/08GK101787059SQ201010139539
公開日2010年7月28日 申請日期2010年3月10日 優先權日2010年3月10日
發明者喬明曦, 李新剛, 胡海洋, 趙慶春, 趙秀麗, 陳大為 申請人:瀋陽藥科大學