利用以rna病毒或dna病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒載體將基因導入呼吸道上皮幹細胞的製作方法

2023-05-21 18:19:41

專利名稱：利用以rna病毒或dna病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒載體將基因導入呼吸道上皮幹細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種將基因導入呼吸道上皮幹細胞的慢病毒載體，該載體 用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化。
背景技術：
嚢性纖維症(Cystic Fibrosis : CF )是白種人中最常見的致死性常染色 體隱性疾病，此病的原因由嚢性纖維症跨膜轉導調節因子(CF transmembrane conductance regulator : CFTR)基因發生異變引起,由於離子 不能跨越呼吸道上皮移動，使黏膜增厚，細菌附著，最終導致發病。因此， 呼吸道上皮細胞成為基因治療的重要靶的。
為使導入基因得以長期表達，重要的是要將基因導入到包括幹細胞在 內的呼吸道上皮細胞前體細胞。所謂幹細胞是指具有多分化功能和自我復 制能力的未分化細胞。呼吸道的幹細胞存在於粘液下腺組織(sub-mucosal gland )的導管上皮(ductal epitherium)周圍,或基底膜(basement membrane ) 的基底細胞(basal cells)周圍，氣管上皮及基底細胞可以阻斷外部毒素及 有害物的侵入(參考非專利文獻1及2 )。另外，有報告說，該細胞也散在 於小鼠氣管的軟骨組織中(參考非專利文獻l )。 一般來說，上皮細胞的幹 細胞非常少，存在於粘液下腺組織(sub-mucosal gland )中被隔離的部位， 基因導入等方案很困難。包括幹細胞在內的呼吸道上皮細胞，由於存在粘 蛋白層及粘液，是難以基因導入的組織。
呼吸道上皮細胞具有極性，將接觸外部空氣側稱之為頂側(apical side)、 體腔側稱之為基底外側(basolateral side)。由於呼吸道上皮細胞的頂側表面沒 有病毒受體，幾乎沒有載體可以有效轉導到無傷的呼吸道上皮中。以腺病 毒為首，很多病毒受體在基底外側，EGTA及表面活性劑等前處理 (pre-conditioning )要在臨基因導入前進行。水皰性口內炎病毒糖蛋白質 (VSV-G)假型化慢病毒載體，例如，為有效轉導必須用洗滌劑將上皮表面
做前處理。但這些化學處理不可臨床應用。
嚢性纖維症等呼吸系統障害性遺傳疾病中已開發出了基因治療載體及 給藥方法。為將基因導入呼吸道上皮細胞，需要通過粘蛋白層及粘液由上 皮細胞頂側進行導入。對於從基底外側感染的病毒載體，存在於上皮細胞
之間的緊密連接阻礙了這些載體的進入。因此，採取鈣絡合劑EGTA，或其 與各種表面活性劑並用的給藥方法，打破緊密連接。然而在人體臨床上， 這種方法(pre-conditioning)還是不被看好。
一般用於假型化的VSV-G受體位於呼吸道上皮細胞基底外側，所以基 因導入時需要用溶血磷脂膽鹼(LPC;表面活性劑的一種)進行處理。LPC處 理後將VSV-G假型化HIV載體(搭載基因；LacZ)感染到小鼠鼻腔，導入 基因的表達至少持續了 92天(參照非專利文獻3 )。這個結果啟示我們因 為上皮細胞的壽命為3個月，所以基因導入幹細胞是可能的。沒有前處理 的慢病毒載體的假型化，有報告舉為，伊波拉病毒.薩伊抹的包膜蛋白質 (參照非專利文獻4 )。並且在小鼠呼吸道組織中觀察到了搭載LacZ基因 可持續表達63天。雖然該實驗的實施期間沒有達到上皮細胞的壽命，但仍 能確認基因導入到了據說有幹細胞存在的黏膜下腺中。
另外還有以下公開的文獻。
非專利文獻1Borthwick等著、Am J. Respir. Cell Mol. Biol.、 Vol. 24、 pp662-670、 2001年
非專利文獻2Engelhardt著、Am J. Respir. Cell Mol. Biol.、 Vol. 24、 pp649-652、 2001年
非專利文獻3Limberis等著、Human Gene Therapy、 Vol. 13、 ppl961-1970、 2002年
非專利文獻4Kobinger等著、Nature Biotechnology、 Vol. 19、 pp225-230、 2001年
非專利文獻5Alberto Auricchio等著、The Journal of Clinical Investigation、 Vol. 110、 Number 4、 pp.499畫504、 2002年
非專利文獻6John F. Engelhardt著、The Journal of Clinical Investigation Vol. 110、 Number 4、 pp.429畫432、 2002年
發明內容本發明要解決的課題
本發明以提供一種可將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的慢病毒載體為
課題。該載體為RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白假型化載體。解決課題的手段
本發明者們為解決上述課題不斷進行研究。為開發將基因導入呼吸道 上皮幹細胞的載體，本發明者們用RNA病毒之一的仙臺病毒刺突蛋白的包 膜糖蛋白F、 HN將慢病毒之一的猴免疫缺陷病毒(simian immunodificiency virus; SIV)載體進行假型化。
由於呼吸道上皮被粘液覆蓋，以往的技術很難將基因導入。在對這些 細胞進行基因導入時，曾嘗試洗淨並物理去除粘液等細胞外基質的方法。 但這一方法很複雜，容易劃傷組織。
本發明者們注意到呼吸道感染病毒的仙臺病毒具有從頂側有效轉導未 進行前處理的呼吸道上皮細胞這一功能，開發了用仙臺病毒的包膜糖蛋白 F、 HN將猴免疫缺陷病毒載體假型化的載體，並首次發明使用該載體同時
猴免疫缺陷病毒載體等慢病毒載體通過整合酶的作用可將攜帶基因整 合到宿主基因組。所以，如能將仙臺病毒的糖蛋白假型化的猴免疫缺陷病 毒載體基因導入到幹細胞的話，對於呼吸系統遺傳性疾病，例如嚢性纖維 症的治療是有益的。
於是，本發明者們開發了用感染呼吸道的仙臺病毒刺突蛋白的糖蛋白 F、 HN將猴免疫缺陷病毒載體假型化的載體，和使用該載體從頂側穿透無 前處理的粘液層有效地將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的方法。將感染呼 吸道的病毒糖蛋白作為包膜蛋白使用，可以與呼吸道上皮細胞一起基因導 入到包含前體細胞在內的幹細胞中。通過本發明的載體基因導入幹細胞技 術，可大大地超越上皮細胞的壽命，使基因穩定持續表達。
即本發明涉及一種用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白假型化的慢病 毒載體。該載體可將基因導入到呼吸道上皮幹細胞。具體為
〔1 〕一種用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒 載體，該載體可將基因導入到呼吸道上皮幹細胞。
〔2 〕 〔 1 〕的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是感染呼吸道組織
的RNA病毒
〔3 〕 〔 1 〕的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是負鏈RNA病毒。
〔3〕的慢病毒載體，其中所述負鏈RNA病毒是副粘病毒。
〔4〕的慢病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
〔3〕的慢病毒載體，其中所述負鏈RNA病毒是正粘病毒。
〔6〕的慢病毒載體，其中所述正粘病毒是流感病毒。
〔3〕的慢病毒栽體，其中所述負鏈RNA病毒是纖維病毒(filovirus)。
〔8〕的慢病毒載體，其中所述纖維病毒是伊波拉出血熱病毒。
〔10〕 〔 1 〕的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是正鏈RNA病毒。
c i n
毒(coronavirus) 〔12〕毒。
〔13〕 的DNA病毒。
〔14〕 (baculovirus)。
〔15〕 〔 1 〕 - 〔 1 4 〕慢病毒載體中的任一慢病毒載體，其是 重組猴免疫缺陷病毒載體。
〔16〕 〔15〕的慢病毒載體，其中所述重組猴免疫缺陷病毒載體 來源於agm才朱。
〔17〕 〔15〕或〔16〕的慢病毒載體，其中所述重組猴免疫缺 陷病毒載體為自失活型。
〔18〕 〔 1 〕 - 〔 1 4 〕的慢病毒載體中的任一慢病毒載體，其 是馬傳染性貧血病毒載體、人免疫缺陷病毒1及2載體、或貓免疫缺陷病 毒載體。
〔19〕 〔 1 〕 - 〔 1 8 〕的慢病毒載體中的任一慢病毒載體，其 以可表達的狀態保持外源基因。
〔20〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼從綠焚光 蛋白質、|3-半乳糖苷酶及螢光素酶中選出的蛋白的基因。
〔1 0〕的慢病毒栽體，其中所述正鏈RNA病毒是冠狀病 〔11〕的慢病毒載體，其中所述冠狀病毒是SARS冠狀病 〔1 〕的慢病毒載體，其中所述DNA病毒是感染呼吸系統 〔13〕的慢病毒載體，其中所述DNA病毒是杆狀病毒 〔21〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後 天機能缺陷蛋白質的基因。
〔22〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後 天機能缺陷的嚢性纖維症(CF)原因因子的基因。
〔23〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後 天機能缺陷的CFTR(嚢性纖維症化跨膜轉導調節因子)蛋白質的基因。
〔24〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼對嚢性纖 維症有治療效果的蛋白質的基因。
〔25〕 〔19〕的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼因遺傳性 疾病造成機能缺陷的蛋白質的基因。
〔26〕 〔25〕的慢病毒載體，其中所述由於遺傳性疾病造成的機 能缺陷蛋白質是編碼CFTR的基因。
〔27〕 一種將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的方法，該方法包含 使〔1 〕 - 〔26〕任一項的慢病毒載體接觸到呼吸道上皮細胞的步驟。
〔28〕導入了 〔 1 〕 - 〔26〕中的任一項的慢病毒載體的呼吸道 上皮幹細胞。
〔29〕 包含〔1 〕 - 〔 2 6 〕中的任一項的慢病毒載體作為有效 成分的呼吸道上皮幹細胞用基因導入劑。
〔30〕 〔29〕的呼吸道上皮幹細胞用基因導入劑，其特徵為， 以肺為生產組織，供給疾病治療所需蛋白。
〔31〕一種遺傳性呼吸系統疾病的治療劑，該治療劑包含〔1 〕 -〔26〕的任一項的慢病毒載體作為有效成分。
〔32〕 〔31〕的治療劑，其中所述遺傳性呼吸系統疾病為嚢性 纖維症。
進而，本發明還涉及一種預防或治療遺傳性呼吸道系統疾病的方法。 該方法包含將本發明所述的慢病毒載體給藥到個體的步驟。本發明還涉及 上述遺傳性呼吸道系統疾病之一的嚢性纖維症的預防或治療方法。進而本 發明還涉及該慢病毒載體在遺傳性呼吸道系統疾病治療劑的製備中的使 用。本發明還涉及其在上述遺傳性呼吸道系統疾病為嚢性纖維症的治療劑 的製備中的使用。


圖1為細胞質側域置換型HN表達質粒所編碼的蛋白質的SIV細 胞質側域(斜體下劃線部分)和HN蛋白跨膜區(斜體)的邊界部分的氨基 酸序列(序列號1 )。
圖2為SIV細胞質側域附加型HN表達質粒所編碼的蛋白質的細 胞質側域(斜體下劃線部分)和HN蛋白跨膜區(標準字體)的邊界部分的 胺基酸序列(序列號2 )。
圖3為細胞質側域F缺失型表達質粒所編碼的蛋白質的F蛋白跨 膜區(斜體)和F蛋白細胞質側域(標準字體)的邊界部分的胺基酸序列 (序列號3 ~ 5 )。
圖4為附加SIV細胞質側區域的細胞質側F缺失型表達質粒所編 碼的蛋白質的F蛋白跨膜區(無下劃線的斜體字)及F蛋白細胞質側域(標 準字體)和SIV細胞質側域11胺基酸(SIVell )(斜體下劃線)的邊界部分 的胺基酸序列(序列號6 ~ 8 )。
圖5為利用本發明F/HN假型SIV栽體在小鼠鼻腔長期基因表達 的照片。表示第3天到第360天的結果。括弧內的數值(x/x)表示可見基 因表達的小鼠數/供試的小鼠數。數值分為左右時，左側表示強GFP表達 的小鼠數，右側為各天數用於解析的小鼠數。標尺線(scale bar)表示5mm。
圖6為利用本發明的F/HN假型SIV載體特異性地基因導入小鼠 鼻腔上皮的照片。第36天及第50天的結果。標尺線表示0.5mm。
圖7為圖6的繼續。表明超過細胞壽命，在第160天及第220天 及第360天仍可表達。標尺線為0.5mm。
圖8圖8為幹細胞存在於小生境(右)及幹細胞散在於上皮細胞 基底膜周圍(左)時，分化的細胞在上皮組織中的移動的示意圖。SMG是 黏膜下腺(submucosal gland)的略稱。下段的4張平面圖為呼吸道上皮的頂表 面。下面的2張平面圖為幹細胞分裂2個周期後(約180天後)的示意圖。 幹細胞達到一定比例後，分化的細胞快速移動到邊側。且每隔3個月細胞 再生。圖中、條線(斜線)圓為幹細胞、白圓為呼吸道上皮前體細胞、灰 圓為正在分化的呼吸道上皮細胞、黑圓為分化完了的呼吸道上皮細胞。
實施發明的最佳形態
本發明者們在所期待的作為基因治療載體的慢病毒中與以往基因治療
領域慣用的人免疫缺陷病毒(HIV)進行了比較，於是採用了具有安全性高 等優勢的猴免疫缺陷病毒(SIV)構築了用負鏈RNA病毒刺突蛋白質假型 化的載體。如以下實施例所示，構建了負鏈RNA病毒之一的仙臺病毒F、 HN蛋白質假型化的猴免疫缺陷病毒載體。進而使用該載體成功地將外源基 因導入到了小鼠鼻腔的幹細胞中。
即本發明提供一種旨在將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的慢病毒載體 (以下本說明書記述為"假型化慢病毒載體"、或"載體")。該載體是用RNA 病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化的載體。
本發明的"慢病毒載體"是一種包含來源於慢病毒的病毒基因組、缺失 自我複製功能、具有將核酸分子導入宿主內能力的病毒粒子。即載體指的 是具有慢病毒的骨架。所謂"具有慢病毒骨架，，指的是，構成該載體的病毒粒 子所含有的核酸分子來源於慢病毒基因組。例如，病毒粒子中包含的核酸 分子具有慢病毒基因組來源的包裝信號序列的載體包含在本發明的慢病毒 載體中。本發明的所謂"重組"病毒載體，指的是基因重組技術構建的病毒載 體。使用編碼病毒基因組的DNA和包裝細胞構建的病毒載體稱為重組病毒 載體。
所謂慢病毒指的是屬於慢病毒亞科(Lentivirus)的逆轉錄病毒。例如
下列病毒包含在慢病毒內。
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus; HIV ); (例如HIV1或HIV2 )、 猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus; SIV )、 貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus ; FIV )、 類梅迪-維斯納病毒(Maedi-Visna-like virus ; EV1 )、 馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus ; EIAV )、 山羊關節炎月滷炎病毒(caprine arthritis encephalitis virus ;CAEV ) 本發明可以使用任意林以及亞型來源的慢病毒。例如，HIV-1包含全
部的主要(M)亞型(包含A到J )、 N以及outlier ( O ) (Hu， D. J. et al., JAMA
1996; 275: 210-216; Zhu, T. et al., Nature 1998, 5; 391(6667): 594-7; Simon, F.
et al.， Nat. Med. 1998, 4(9): 1032-7 )。
所謂"用RNA病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒載體"指的是具有 RNA病毒刺突蛋白質的慢病毒載體。也可以說是具有1個或多個RNA病毒 的刺突蛋白質的慢病毒載體。這是該慢病毒載體的天然型所不具備的。
所謂"DNA病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒載體"指的是具有DNA 病毒的刺突蛋白質的慢病毒載體，或具有該慢病毒載體的天然型不具備的 1個或多個DNA病毒的刺突蛋白質的慢病毒載體。
另外，本發明基因導入對象的所謂"呼吸道上皮幹細胞"指的是存在於 呼吸道上皮組織的幹細胞(stem cell)。所謂幹細胞是指具有多分化能力和 自我複製能力的未分化細胞。已知有以下3種，造血幹細胞、骨髓幹細胞 (bone marrow stroma cells: D丄Prockop, Science, 276, 71-74， 1997 )、及各髒 器組織內的幹細胞。所謂呼吸道上皮組織指的是，例如，鼻、鼻腔、咽頭、 喉頭、氣管、支氣管、肺等組織。本發明優選的呼吸道上皮組織是鼻腔、
(sub-mucosal gland )內的千細胞。即，所謂呼吸道上皮幹細胞的定義為所 有呼吸道上皮組織中可分化的造血幹細胞、骨髓幹細胞、各臟器組織內幹 細胞。
本發明的假型化慢病毒載體具有將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的機 能。即，本發明用於假型化的RNA病毒或DNA病毒優選具有呼吸道上皮 組織感染機能的病毒。
本發明的所謂"RNA病毒"是攜帶RNA基因組的病毒。本發明中的RNA 病毒優選病毒的生命周期中以RNA為模板，合成的RNA病毒。RNA病毒 可以是在呼吸道上皮細胞中複製RNA基因組的所需RNA病毒、或是野生 型病毒、也可以是弱毒型病毒及溫度敏感性病毒等變異型病毒。可以是天 然病毒(自然產生的病毒)、也可以是重組病毒。RNA病毒包含單鏈RNA 病毒(包含正鏈RNA病毒及負鏈RNA病毒)、及雙鏈RNA病毒。還包含 有包膜的病毒(包膜病毒；enveloped viruses)及無包膜的病毒(非包膜病 毒；non-enveloped viruses),優選使用包膜病毒。本發明的RNA病毒具體 包含以下科屬的病毒。
拉薩熱病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae )
流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae )
SARS冠狀病毒等的冠狀病毒科(Coronaviridae )
風滲病毒等的披蓋病毒科(Togaviridae )
流行性腮腺炎病毒、麻滲病毒、仙臺病毒、RS病毒等的副粘病毒科 (Paramyxoviridae )
小核糖核酸病毒、克沙奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae )
馬爾堡病毒、伊波拉出血熱病毒等的纖維病毒科(Filoviridae )
黃熱病病毒、登革熱病毒、C型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黃病毒 科(Flaviviridae )
本雅病毒科(Bunyaviridae )
狂犬病病毒等彈狀病毒科(Rhabdoviridae )
呼腸孤病毒科(Reoviridae)
本發明的所謂"正鏈RNA病毒，，是包含正鏈RNA作為基因組的病毒。 本發明優選使用其中的冠狀病毒科的SARS冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome virus (重症急性呼吸系統症候群病毒、SARS病毒)、 新型冠狀病毒)。本發明中的正鏈RNA病毒包含以下病毒。
SARS病毒等的冠4犬病毒一牛(Coronaviridae )
獐病毒等的杯4犬病毒牙牛(Caliciviridae )
微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae )
星狀病毒等的星狀病毒科(Astroviridae )
披蓋病毒科(Togaviridae)
黃病毒科(Flaviviridae )
人免疫缺陷病毒等的逆轉錄病毒科(Retroviridae ) 本雅病毒科(Bunyaviridae )
本發明的，，負鏈RNA病毒，，是以負鏈RNA (與編碼病毒蛋白的有義鏈互 補的反義鏈)為基因組的病毒。負鏈RNA也可稱為陰性鏈RNA。本發明中 所使用的負鏈RNA病毒優選單鏈負鏈RNA病毒(也可稱非分節型 (non-segmented)負鏈RNA病毒)。所謂單鏈負鏈RNA病毒指的是以一條負 鏈RNA為基因組的病毒。
上述負鏈RNA病毒包括以下病毒科的病毒屬於副粘病毒科 (Paramyxoviridae; 包含副粘病毒屬(Paramyxovirus),麻滲病毒屬 (Morbillivirus)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus),及肺病毒屬(Pneumovirus)等)、彈
狀病毒科(Rhabdoviridae; 包括水泡性病毒屬(Vesiculovirus),萊薩病毒屬 (Lyssavirus)，及短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)屬等)、包含伊波拉出血熱病毒 在內的纖維病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae;包含曱 型、乙型、丙型流感病毒,及類索哥託病毒(Thogoto-likeviruses)等)、本雅病 毒牙牛(Bunyaviridae;包4舌本雅病毒屬(Bunyavirus)，漢坦病毒屬(Hantavirus),(內 羅病毒屬Nairovirus)，及白蟲令病毒屬(Phlebovirus等)、沙衝立病毒(Arenaviridae ) 科的病毒。
本發明中尤其優選的負鏈RNA病毒的具體舉例為，包括例如屬於副粘 病毒一+(Paramyxoviridae)的仙臺病毒(Sendai virus)、 新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻滲病毒、RS病毒(Respiratory syncytial virus)、牛痕病毒(rinderpest virus)、痕熱病毒(distemper virus)、《吳副 流感病毒(SV5)，人副流感病毒1, 2, 3型；屬於正粘病毒科的流感病毒 (Influenza virus); 屬於彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus);屬於纖維病毒科的埃 博拉出血熱病毒(Ebola virus )等。其中，本發明優選使用仙臺病毒、流感 病毒、或;矣t專4i出血熱病毒。
仙臺病毒包含野生抹、突變林、實驗室傳代林及人工構建抹等。DI粒 子(J. Virol. 68, 8413-8417(1994))等不完全病毒及合成的寡核苷酸等也可以 作為製備本發明的假型化慢病毒載體的材料使用。
本發明中的所謂"刺突蛋白質"也可稱為包膜蛋白質。具體"刺突蛋白質" 指的是排列於病毒的包膜表面的突起狀蛋白質，是病毒糖蛋白，也可作為 多聚體存在。其對具有包膜的病毒吸附侵入宿主細胞發揮著必要的作用。 例如，仙臺病毒中有由血凝素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白和融合糖蛋白(F) 組成的2種刺突蛋白質。流感病毒中有血凝素(三聚體)(HA)和神經氨酸 酶(四聚體)(NA) 2種刺突蛋白質。SARS病毒中的刺突糖蛋白質作為刺 突蛋白質存在。伊波拉出血熱病毒薩伊抹長約10nm的突起狀的EboZ包 膜蛋白質作為刺突蛋白質存在。
本發明中的刺突蛋白質不只是上述的HN、 F、 HA、 NA、 EboZ等刺突 蛋白質，例如其他的RNA病毒或DNA病毒中，名稱不同的相當於上述刺 突蛋白質的蛋白質，也包含在本發明中。這些刺突蛋白質只要維持原本的 蛋白質機能，也可以置換、缺失、插入、及/或附加天然蛋白質的1個或
多個胺基酸加以改變。被改變的胺基酸數沒有特別限制， 一般來說50個氨 基酸以內、優選30個胺基酸以內、更優選10個胺基酸以內(例如5個氨 基酸以內、3個胺基酸以內)。胺基酸的改變優選保守置換。如此被改變了 的胺基酸所組成的蛋白質假型化的慢病毒載體也包含在本發明中。
本發明的假型化慢病毒載體可以通過在產生病毒時與刺突蛋白質共存 來製備。例如，通過刺突表達載體的轉染及被宿主染色體DNA包吞的刺突 基因的誘導表達，使刺突在包裝細胞內表達，從這個細胞產生的病毒粒子 被用刺突蛋白質進行假型化。
本發明涉及一種假型化慢病毒載體，其中RNA病毒是副粘病毒。 例如編碼副粘病毒的病毒蛋白的基因為已知的NP、 P、 M、 F、 HN、 及L基因。所謂"NP、 P、 M、 F、 HN、及L基因，，指的是分別編碼核衣殼、 磷酸化(phospho-)、基質、融合、血凝素、神經氨酸酶、及大蛋白的基因。 分類於副粘病毒亞科的病毒的基因一般概述如下。通常NP基因表示為，，N 基因"。
副粘病毒屬NP P/C/V M F HN-L 膽4泉炎病毒屬NP P/V M F HN(SH)L 麻滲病毒屬NP P/C/V M F H-L
例^口副粘病毒^牛(Paramyxoviridae )的副粘病毒屬(Paramyxovirus)的 仙臺病毒的基因的鹼基序列的資料庫的登錄號分別為NP基因為M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、 P基因為 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、 M 基因為D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F基因為D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN基因為D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、 L基因為 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886。
例如，副粘病毒的包膜蛋白質假型化的慢病毒載體的例如可以這樣制 備製備失活副粘病毒、或具有副粘病毒包膜蛋白的病毒體，並將該病毒 體融合到慢病毒中。也可以通過使表達副粘病毒的包膜蛋白的表達載體在 慢病毒的包裝細胞內表達進行製備。
本發明涉及一種副粘病毒為仙臺病毒的假型化慢病毒載體。
本發明涉及一種負鏈RNA病毒為正粘病毒的假型化慢病毒載體。
正粘病毒科(Orthomyxoviridae )病毒包含曱型流感病毒屬(Genus: Infleuenzavirus A )、 乙型5危感病毒屬(Genus: Infleuenzavims B )、丙型力乾感 病毒屬(Genus: Infleuenzavirus C )、及索哥託病毒屬(Genus: Thogotovirus )。 曱型流感病毒屬有曱型流感病毒(Infleuenza A virus (FLUAV))、乙型流感毒 屬有乙型流感病毒(Infleuenza B virus (FLUBV))、丙型流感病毒屬有丙型流 感病毒(Infleuenza C virus (FLUCV))、索哥託病毒屬有索哥託病毒(Thogoto virus, THOV)、多裡病毒(Dhori virus, DHOV)等。
例如編碼正粘病毒的病毒蛋白的基因為已知的HA、 NA、及Ml基因。 所謂"HA、 NA、及M1基因"指的是分別編碼血凝素、神經氨酸酶、基質(膜) 蛋白的基因。屬於正粘病毒科病毒的基因一般表示為以下。通常HA基因表 示為H， NA基因表示為N。
曱型流感病毒屬 PB2. PB1, PA. HA. NP. NA' M1+M2-NS1+NS2
乙型流感病毒屬 PB2' PB1' PA' ■ HA' NP. NA+NB' M1+M2 ■ NS1+NS2
丙型流感病毒屬 PB2. PB1. P3 (PA)' HE (HA) ■ NP ■ M-NS1+NS2
索哥託病毒屬 PB2' PBl' PA. GP-75(THOV)' GP-64 (DHOV)-NP' M
例如分類於正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的曱型流感病毒屬的曱型 流感病毒的包膜基因的鹼基序列資料庫的登錄號為HA基因為NC-002017、 NA基因為NC-002018。
分類於乙流感病毒屬的乙型流感病毒的包膜基因的鹼基序列資料庫登 錄號為HA基因為NC —002207、 NA基因為NC — 002209。
分類於丙型流感病毒屬的丙型流感病毒的包膜基因的鹼基序列資料庫 登錄號為HE (hemagglutinin-esterase precursor)基因為NC — 006310。
分類於索哥託病毒屬的索哥託病毒的包膜基因的鹼基序列的資料庫登 錄號為GP-64基因為NC —006506。
本發明涉及一種正粘病毒為流感病毒的假型化慢病毒載體。
本發明還涉及一種負鏈RNA病毒為纖維病毒的假型化慢病毒載體。
纖維病毒科(Filoviridae )包含類馬爾堡病毒屬(Genus: Marburg-like viruses )、類^矣十專4立病毒屬(Genus: Ebola-like viruses )。類馬爾堡病毒屬可 舉例有類馬爾堡病毒(Marburg virus )等。類伊波拉病毒屬可舉例如薩伊 型伊波拉出血熱病毒、Reston型伊波拉出血熱病毒、蘇丹型伊波拉出血熱 病毒等。本發明中的伊波拉出血熱病毒可以使用以上任何一種，但優選使 用薩伊型伊波拉出血熱病毒。
例如編碼伊波拉出血熱各病毒蛋白的基因的鹼基序列的資料庫的登錄 號為，NC — 002549, L11365, AF086833, AF272001, U28077, U31033, AY142960。
本發明涉及一種纖維病毒為伊波拉出血熱病毒的假型化慢病毒載體。 本發明還涉及一種正鏈RNA病毒為冠狀病毒的假型化慢病毒載體。 冠狀病毒科(Coronaviridae )包含冠狀病毒屬(Genus: Coronavirus )、 曲狀病毒屬(Genus: Toro virus )。冠狀病毒屬可舉例為SARS病毒、傳染性 支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus )、人冠狀病毒(Human coronavirus )、 小鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus )等，曲狀病毒屬可例舉為馬曲狀病毒 (Equine torovirus )、 人曲狀病毒(Human torovirus )等。
例如編碼SARS病毒的各病毒蛋白的基因的鹼基序列資料庫的登錄號 為，NC-004718、刺突蛋白為NP —828851。
本發明涉及一種冠狀病毒為SARS病毒的假型化慢病毒載體。 本發明涉及一種DNA病毒為杆狀病毒(Baculovirus )的假型化慢病毒 載體。杆狀病毒的突蛋白質具有與索哥託(Thogoto)等丁型流感病毒的刺 突蛋白質類似的構造，可感染到呼吸道上皮(Sinn,RL., Burnight，E.R.， Hickey,M.A.， Blissard,G.W., and McCray,RB.，Jr. Persistent gene expression in mouse nasal epithelia following feline immunodeficiency virus-based vector gene transfer. J.Viro1.(2005) 79:12818-12827 )。本發明中的杆狀病毒可例舉為 苜蓿4艮紋夜蛾核多角體病毒(Autographa califomica )。
本發明的用RNA病毒或DNA病毒刺突蛋白假型化的慢病毒載體例如 在負鏈RNA病毒為副粘病毒的情況下，優選還包含HN蛋白質及F蛋白質 的病毒。在負鏈RNA病毒為正粘病毒的情況下，優選不僅包含HA蛋白、 而且包含NA蛋白質、或GP88蛋白質、HE的病毒。在RNA病毒為冠狀病 毒的情況下，優選含有S蛋白質的病毒。在RNA病毒為纖維病毒的情況下
優選包含包膜蛋白質。
試驗證明本發明的仙臺病毒的HN及F蛋白的假型化猴免疫缺陷病毒 載體對呼吸道上皮幹細胞顯示出基因導入的高效率。即本發明的慢病毒載
體包含含有該F及HN蛋白質的假型化猴免疫缺陷病毒載體。另外，本發 明的假型猴免疫缺陷病毒載體還可以包含副粘病毒的M蛋白質。
猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV )是在f美類動物 中發現的類似HIV的病毒，並與HIV —起構成靈長類慢病毒類群(井戶榮 治，速水正憲，猴免疫缺陷病毒基因和感染，病原性.蛋白質核酸酵素: Vol.39， No.8. pl425， 1994 )。這個類群進一步大致分類為4類
1) HIV-l:包含HIV-1和黑猩猩分離的SIVcpz。為人後天性免疫缺陷綜 合徵(acquired immune deficiency syndrome, AIDS )致因。
2) HIV-2:由烏黑白眉猴(Cercocebus atys)分離的SIVsmm和由普通獼猴 (Macaca mulatta )分離的SIVmac、及對人顯示出輕度病原性的HIV-2 ( Jaffar, S. et al" J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol" 16(5)， 327-32， 1997 )。
3) SIVagm:以非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)分離的SIVagm為代表。
4) SIVmnd:以山魈(Papio sphinx)分離的SIVmnd為代表。
本發明的SIV包含SIV的所有抹及亞型。SIV分離抹可例舉為SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac、 SIVmnd、 SIVsm、 SIVsnm、 SIVsyk等。
其中，沒有報告指出SIVagm及SIVmnd在自然宿主中的病原性(Ohta， Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22， 1988; Miura, T. et al.， J. Med. Primatol" 18(3-4)， 255-9， 1989;速水正憲，日本臨床，47, 1, 1989 ),但有報告指出，尤 其是SIVagm中一種的TYO-1株即使在自然宿主，感染實驗並未顯示對食 蟹猴(Macaca facicularis)、獼猴(Macaca mulatta)的病原性(Ali， M. et al, Gene Therapy, l(6)，:367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol.， 19(1)， 9-20， 1990)。目前尚未出現有關SIVagm的對人感染、發病的報告，對人的病原 性仍屬未知階段， 一般來說在靈長類中慢病毒的特異性較高，很少從自然 宿主感染、發病到異種，即使發病其發病率也很低且進展很慢(Novembre,F. J. et al" J. Virol" 71(5)， 4086-91， 1997 )。所以，本發明優選使用來源於agm 林的SIV。以SIVagm TYO-1抹為基礎製備的病毒載體，其安全性比HIV-1
及其他慢病毒為基礎的載體要高。是本發明的優選載體。
本發明的假型化猴免疫缺陷病毒載體可以還包含來源於其他病毒的包 膜蛋白。例如，該蛋白質是感染人細胞的病毒來源的包膜蛋白。該蛋白質 沒有特別限制，可舉例為逆轉錄病毒的雙嗜性包膜蛋白質。逆轉錄病毒的
雙嗜性包膜蛋白可使用例如，小鼠白血病病毒(MuLV) 4070A林來源的包 膜蛋白質獲得。也可用MuMLV 10A1來源的包膜蛋白質(例如 pCL-10Al(Imgenex) (Naviaux， R. K. et al.， J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。其 他還可舉例為伊波拉出血熱病毒的薩伊林的包膜糖蛋白質(GP)及被鑑 定為新型冠狀病毒的重症急性呼吸系統症候群(SARS)病毒的刺突包膜蛋 白質(S蛋白質)。此外還可例舉出單純皰滲病毒的gB、 gD、 gH、 gp85蛋 白質、EB病毒的gp350、 gp220蛋白質等。肝炎病毒科的蛋白質還可例舉 B型肝炎病毒的S蛋白質等。
本發明的猴免疫缺陷病毒載體可包含其他的逆轉錄病毒基因組RNA 序列的一部分。例如人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus; HIV )、 貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus, FIV ) ( Poeschla， E. M. et al., Nature Medicine, 4(3)， 354-7, 1998 )、山羊關節炎腦炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus, CAEV )(Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol" 143(4), 681-95: 1998)等的其它慢病毒基因組序列的一部分與猴免疫缺陷病毒基因組部分 置換的嵌合序列載體也包含在本發明的猴免疫缺陷病毒載體中。
上述逆轉錄病毒可以在LTR (長末端重複序列，long terminal repeat) 中進行改變。LTR是逆轉錄病毒中的特徵序列，存在於病毒基因組的兩端。 5'LTR作為啟動子促進原病毒的mRNA轉錄。所以、將基因轉移載體(gene transfer vector)的具有5'LTR的啟動子活性的部分與其他強力啟動子置換的 話，可增大轉基因載體的mRNA轉錄量，提高包裝效率及載體效價。例如 慢病毒，5'LTR通過病毒蛋白tat增強轉錄活性。所以可以將5'LTR置換為 不依賴tat蛋白的啟動子，從包裝載體中去除tat。感染並侵入細胞內的病毒 RNA^皮逆轉錄後，兩端的LTR相結合形成環狀構造，結合部位和病毒整合 酶(Integrase)共同作用，整合到細胞的染色體內。原病毒轉錄的mRNA為從 5'LTR內轉錄起始點下遊到3'LTR的polyA序列。5'LTR的啟動子部分在病 毒內不被包裝。所以，即使置換啟動子，插入靶細胞的染色體部分不會發 生變化。綜上，置換5'LTR啟動子，關係到製備的載體的較高效價和安全性。所以置換轉基因載體的5'側啟動子，可提高包裝載體效價。
另外、本發明的重組猴免疫缺陷病毒載體可部分去除3'LTR的序列， 製備自失活載體(Self Inactivating Vector: SIN載體)以防從靶細胞轉錄全 長的載體mRNA,提高安全性。侵入靶細胞染色體的慢病毒的原病毒形成 將3'LTR的U3部分結合到5'端的形狀。所以轉基因載體在靶細胞染色體中， U3配置在5'端，由此轉基因載體全長RNA被轉錄。假如靶細胞內存在慢 病毒或類似蛋白的話，轉基因載體再次被包裝，有可能再次感染其它細胞。 同時位於病毒基因組3'側的宿主來源基因有可能通過3'LTR啟動子被表達 (Rosenberg, N.， Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997 )。這一現象已經成為逆轉錄病 毒載體的難題，為迴避這一問題開發出了 SIN載體(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10)， 3194-8, 1986)。去除轉基因載體3'LTR的U3部分， 由於耙細胞內失去了 5'LTR及3'LTR的啟動子，所以不會引起全長RNA及 宿主基因的轉錄。並且，只轉錄內部啟動子的目的基因，可望成為安全性 高、表達水平高的載體。這種載體適合本發明。SIN載體的構建可參照公開 的方法
使用逆轉錄病毒載體等的基因組內包含LTR序列的病毒載體進行基因 治療的問題之一就是，導入基因的表達水平逐漸降低。這些載體整合到宿 主基因組後，宿主的機理反應，使LTR曱基化，導入基因的表達受到抑制， 是原因之一 (Challita, P. M. and Kohn, D. B.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567,1994)。自失活型載體(SIN)的長處是， 一旦整合到宿主基因組中， LTR序列的大部分會消失，因此不會受LTR曱基化的影響降低基因表達水 平。將轉基因載體3'LTR的U3區域置換成其它啟動子序列，將製備的自失 活型載體導入靈長類ES細胞後，表達可持續穩定2個月以上 (WO2002/101057 )。如此，通過改變LTRU3區域設計出的自失活載體SIN 尤其適合於本發明。
本發明的慢病毒載體除上述猴免疫缺陷病毒載體外還可以使用例如馬 傳染性貧血病毒(EIAV )載體、人免疫缺陷病毒(HIV、例如HIV1或HIV2 ) 載體、或貓免疫缺陷病毒(FIV)栽體。
有資料指出，以HIV載體為首的慢病毒載體在宿主基因組持有HIV原 病毒的情況下，外源載體和內源性原病毒之間發生重組，會產生複製病毒。
這的確是HIV感染患者實施載體HIV給藥的大問題。不過，本發明使用的 載體SIV幾乎沒有與HIV相同的序列。加上載體SIV是一種去除80.6 %以 上病毒來源序列的不可複製型病毒，所以，構成可複製病毒的危險性極小， 安全性比其它慢病毒載體高。即，本發明的這些慢病毒載體中，特別優選 使用猴免疫缺陷病毒(SIV)載體作為慢病毒載體。
通常50%以上、優選60%以上、更優選70%以上、更優選80%以上被去 除的不可複製型病毒。
在產生逆轉錄病毒過程中，在宿主細胞中轉錄具有包裝信號的轉基因 載體DNA，在gag、 pol蛋白以及包膜蛋白質的存在下形成病毒粒子。轉基 因載體DNA編碼的包裝信號序列優選儘可能長地整合，以保持該序列形成 的構造。同時，為減少該載體DNA上的包裝信號和供給gag、 pol蛋白的包 裝載體之間出現的重組後產生的野生型病毒的出現頻度，必須將這些栽體 間的序列重複限制在最小。所以，構築轉基因載體DNA,要兼顧到包裝效 率及安全性這兩方面，優選使用儘量短的序列，只要其包含包裝所必要的 序列。
例如，包裝載體為SIVagm來源時，HIV載體則不被包裝。因此，所用 包裝信號來源只被限制於SIV。不過在使用HIV來源的包裝載體時，SIV 來源的轉基因載體也被包裝。所以，要減低重組病毒的出現頻率，也可以 將不同的慢病毒來源的轉基因載體和包裝載體進行組合，使其形成載體粒 子。如此製備的SIV載體包含在本發明的載體中。此時，優選在靈長類的 慢病毒之間組合(例如、HIV和SIV )。
轉基因載體DNA中優選改變後不表達gag蛋白。病毒gag蛋白對活體 來說被識別為異物，有可能表現出抗原性。同時也有可能給細胞機能帶來 影響。為了不表達gag蛋白，可以在gag的起始編碼子的下遊附加或缺失鹼 基，導致移碼。此外，優選缺失gag蛋白編碼區域中的一部分。 一般來說病 毒的包裝，需要gag蛋白的編碼區域的5'側。所以，轉基因載體優選缺乏 gag蛋白C末端的編碼區域。在不嚴重影響包裝效率的情況下儘可能大範圍 地缺失gag編碼區域。同時，也優選將gag蛋白的起始編碼子(ATG)置換 到ATG以外的編碼子。置換的編碼子可選擇不太影響包裝效率的為好。將 如此構築的帶有包裝信號的轉基因載體DNA導入到適當的包裝細胞中，可
使其生產病毒載體。生產的病毒載體可從例如，包裝細胞的培養上清中回 收。
用於包裝細胞的細胞只要是一般病毒產生所使用的細胞林則沒有限 制。考慮到用於人體基因治療，最好使用來源於人或猴的細胞。包裝細胞
可使用的人細胞抹可以例如293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW480 細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、Molt-4細胞、 HeLa細胞、HT1080細胞、TE671細胞等。猴來源細胞抹可以例舉為，例 如COSl細胞、COS7細胞、CV-1糹田胞、BMT10細胞等。
對本發明的假型化慢病毒載體所持有的外源基因沒有特別限制，可以 是編碼蛋白質的核酸。例如，也可以是反義或核酶等不編碼蛋白的核酸。 基因可以是天然來源或人為設計的序列。人工蛋白可以是例如，與其它蛋 白的融合蛋白、顯性負性蛋白質(包含受體的可溶性分子或膜結合型顯性 負性受體)、缺失型細胞黏附分子及可溶型細胞表面分子等。
本發明者們確認到本發明的假型化慢病毒載體在包含呼吸道上皮幹細 胞、或呼吸道上皮前體細胞在內的呼吸道上皮細胞中可長時間表達外源基 因。即，本發明的假型化慢病毒載體是具有在呼吸道上皮細胞內至少90天 以上、更優選360天以上表達外源基因能力的特徵的載體。
本發明的外源基因可以是評價基因導入效率及表達穩定性等的標記基 因。標記基因可舉例為編碼綠色螢光蛋白質(以下簡稱為GFP)、 P-半乳糖 苷酶、螢光素酶等基因。尤其優選編碼GFP的基因。
另外，本發明的外源基因可以是編碼先天或後天機能缺陷蛋白質的基 因。這裡所謂的"先天機能缺陷"指的是先天遺傳因素造成的機能缺陷，所謂 "後天機能缺陷"指的是出生後環境因素造成的機能缺陷。
例如嚢性纖維症(CF )，編碼先天或後天^/L能缺陷的嚢性纖維症原因因 子(蛋白質)的基因，優選編碼先天或後天機能缺陷的CFTR ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)蛋白質的基因。
或本發明的外源基因可以例舉編碼對嚢性纖維症有療效的蛋白質的基因。
或本發明的外源基因可以是編碼遺傳性疾病造成機能缺陷的蛋白質的 基因。例如，編碼CFTR蛋白質的基因。
將本發明的假型化慢病毒載體純化到基本純。所謂"基本純"是指該假
型化慢病毒載體基本上沒有慢病毒以外的複製型病毒。純化方法包括過濾、 離心分離，以及層析柱純化等公知的純化分離方法。例如將載體溶液在
0.45pm的過濾器中過濾後，42500xg、 90分、4。C下離心後，可以沉澱、 濃縮載體。
本發明的假型化慢病毒載體可以根據需要與可藥用載體或賦形劑適當混合 成為上述疾病用治療劑。
"可藥用載體或賦形劑"是指可以與本發明載體一起給藥，是一種不明 顯抑制該載體的基因導入的材料。例如，該載體可以用無菌水、生理鹽水、 培養液或血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)等適當混合。進一步還可以含有其他穩 定劑和殺菌劑等。含有本發明的假型化慢病毒載體的組合物可用於試劑或 醫藥。例如，可使用本發明的組合物作為對呼吸道幹細胞的基因導入試劑 或作為遺傳性疾病等各種疾病的基因治療藥物。
通過使本發明的假型化慢病毒載體接觸到包含人類在內的靈長類呼吸 道上皮細胞，該載體含有的核酸可導入到呼吸道上皮幹細胞中。本發明涉 及將基因導入呼吸道上皮幹細胞的方法，該方法包含使本發明載體接觸到 呼吸道上皮細胞的步驟。本發明還涉及慢病毒載體在基因導入呼吸道上皮 幹細胞中的使用，該慢病毒載體用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假 型化。導入對象的呼吸道上皮幹細胞沒有特別限制，例如，可能分化到所 需的猴及人的呼吸道上皮的、包括骨髓幹細胞在內的骨髓來源幹細胞等， 也可作為呼吸道上皮幹細胞使用。
本發明的假型化慢病毒載體基因導入對象的猴來源的呼吸道上皮幹細 胞沒有特別限制，例如狨猴呼吸道上皮幹細胞、普通獼猴呼吸道上皮幹細 胞、食蟹猴呼吸道上皮幹細胞。
用本發明的假型化慢病毒載體進行基因導入呼吸道上皮幹細胞，其操 作可按照包含使該載體接觸呼吸道上皮細胞的步驟的方法進行。如以下實 施例所示，將該載體給藥到小鼠鼻腔可使其接觸。
本發明的假型化慢病毒載體的優勢還在於該載體接觸前即使不進行細 胞表面清洗等前處理，也可達到高效率的基因導入。
本發明涉及導入了本發明的RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型 化的慢病毒載體的呼吸道上皮幹細胞、及該細胞的增殖及/或分化生成的 細胞。
本發明的假型化慢病毒載體基因導入的呼吸道上皮千細胞、及該呼吸 道幹細胞分化的細胞、組織、臟器等可用於各種藥劑的試驗及篩選。例如， 通過基因導入呼吸道上皮幹細胞，可以評價、篩選進行組織或細胞、尤其 優選靈長類來源的組織或細胞的特異分化時使用的基因及藥劑等的效果。
本發明的假型化慢病毒載體所導入的呼吸道上皮幹細胞、及呼吸道上 皮幹細胞分化的分化細胞或分化組織也屬本發明範疇。分化細胞及分化組 織可通過上述組織或細胞中的特異標記的表達、形態特徵觀察鑑定。
使用本發明的假型化慢病毒載體可以長期高效地將基因導入呼吸道上 皮幹細胞並使其表達。即本發明涉及含有本發明的假型化慢病毒載體作為 有效成分的呼吸道上皮幹細胞用基因導入劑。例如，利用上述呼吸道上皮 幹細胞用基因導入劑，提供疾病治療所需的蛋白質、可以將肺等組織或髒 器作為生產組織。
如上所述本發明的假型化慢病毒載體可長期地將基因導入呼吸道上皮 幹細胞，因而可應用到包含人類在內的靈長類遺傳性呼吸系統疾病的基因 治療。即本發明涉及本發明的^f艮型病毒載體為有效成分的遺傳性呼吸系統 疾病的治療劑。
進而本發明涉及一種預防或治療遺傳性呼吸道疾病的方法，該方法將 包含本發明的假型化慢病毒載體給藥到個體(例如患者等)的步驟。本發 明的預防或治療方法中的"個體"可以是優選包含人類的靈長類，也可以是非 人動物。本發明中所謂"給藥到個體"可以通過例如使本發明的假型化慢病毒 載體接觸到呼吸道上皮細胞。如以下實施例所述，將該載體給藥到鼻腔以 實現接觸。
本發明涉及製備本發明的假型化慢病毒載體的遺傳性呼吸系統疾病治 療劑中的使用。對作為對象的遺傳性呼吸系統疾病沒有特別限制，可優選 嚢性纖維症。
由基因導入的呼吸道上皮幹細胞分化出的細胞、組織、臟器可用於疾 病治療。例如，對由於基因的缺失或不足導致的疾病、可將該基因導入到 呼吸道幹細胞的染色體，再移植到體內以補充缺失的基因、體循環酶、生 長因子等，進行補充治療。對此類疾病沒有特別限制。在臟器移植的基因 治療上，可以將人以外動物供體的組織相容性抗原改變為人類型。由此可 提高異種移植的成功率。
用本發明的假型化慢病毒載體基因導入的呼吸道上皮幹細胞如果是猴 來源的話，將該呼吸道上皮幹細胞移植到模型病猴體內，可為人類疾病治 療模型提供相關模型。已知有多種人類疾病的模型猴。例如可以人工製備 人類帕金森病的模型猴、飼養很多與人糖尿病近似的自然發病的糖尿病模
型猴、或將猴的SIV感染症作為人類HIV感染症的最接近模型。這些疾病 在用人呼吸道上皮幹細胞進行臨床應用前，作為臨床前試驗將猴呼吸道上 皮幹細胞移植到疾病模型猴中是非常有用的。
實施例
以下通過實施例對本發明做詳細說明，但本發明並不限於此實施例。 並且本說明書所引用的文獻全部納為本說明書的一部分。 〔實施例1 〕仙臺病毒包膜蛋白表達質粒的構建 (1)細胞質側域置換型HN表達質粒的構建
構建了將HN蛋白細胞質側域置換成SIV包膜蛋白的細胞質側域的HN 表達質粒(圖1 )。將3組合成寡核苦酸(Xho+Xma/Xma-Xho 、 Xma+131/135-Xma、 132+Bam/Bam-136)退火後按順序整合到了 pBluescript KS+ (Stratagene)的XhoI-BamHI位置。將上述重組質粒通過Xhol和DraIII 消化後的合成寡核苦酸連接片段的純化物以及將蛋白表達質粒 pCAGGS-HN通過DraIII和Bsu36IHN消化後的包含HN蛋白3'側片段的純 化物整合到了 pCAGGS (Gene， vo1.108， pp.193-200, 1991)的XhoI-Bsu361位 置。以上方法所得質粒作為SIV細胞質側域置換型HN表達質粒 pCAGGS國SIVct應。
(2 ) SIV細胞質側域附加型HN表達質粒的構建
構建了將SIV包膜蛋白的細胞質側域附加在HN蛋白上的HN表達質 粒(圖2 )。將上述細胞質側域置換型HN表達質粒為模板，通過FSIVhn 及RhnSIV引物的PCR進行了包含SIV包膜蛋白的細胞質側和部分HN蛋 白的區域的擴增。將擴增片段用Xhol及Accl消化後、裝入到整合了上述 (1 )製備的3組合成寡核苷酸的pBluescript KS+( Stratagene )的Xhol-Accl 位置、並與含有SIV包膜的細胞質側域片段進行了置換。將此重組質粒用 Xhol和DraIII消化後的合成寡核苷酸連接片段的純化物，及用DraIII和 Bsu361將HN蛋白表達質粒pCAGGS-HN消化後含有HN蛋白3'側片段整合到了 pCAGGS ( Gene,vol.l08,pp. 193-200,1991 )的XhoI國Bsu361位置。以 上方法所得質粒作為SIV細胞質側域附加型HN表達質粒 pCAGGS畫SIVct+HN。
(3)細胞質側域缺失型F蛋白表達質粒的構建 從5'側起留下27、 14及4個F蛋白細胞質側域的胺基酸，構建了分別 缺失15、 28及38個胺基酸的F蛋白表達質粒(圖3 )。將F蛋白的全部區 i或整合到pBluescript KS+ (Stratagene)的Smal 4立置的質4立pBluescript &8+/81^1/ 作為模板，將15、28及38個胺基酸缺失型分別通過使用了 XhFF 和NotF1650、 NotF1611及NotF1581引物的PCR進行了擴增。用Xhol及 Notl消化擴增片段後，裝入在pCAGGS (Gene, vo1.108， pp.l93-200， 1991)的 EcoRI位置整合了 XhoI/Notl連接序列的質粒的Xhol-Notl位點中，構建了 質粒(15個胺基酸缺失型pCAGGS-Fct27 、 28個胺基酸缺失型 pCAGGS-Fct14及38個胺基酸缺失型pCAGGS-Fct4)。將pCAGGS-Fct4 應用到了假型SIV載體中。
(4 )附加了 SIV細胞質側域的細胞質側域缺失型F蛋白表達質粒的
構建
在細胞質側域缺失型F蛋白(F蛋白細胞質側域的胺基酸數與(3 )制 備的質粒一樣)構建了由SIV細胞質側域5'側附加了 11個胺基酸(SIVctll) 的質粒(圖4 )。將F蛋白的全部區域整合到pBluescript KS+(Stratagene)的 Smal部位的質粒pBluescript KS+/SmaI/F為模板，並分別通過使用XhFF和 SA-F1650、 SA-F1611及SA-F1581的PCR進行了上述3種胺基酸缺失型附 加了 SIV細胞質側域的產物的擴增。擴增片段用XhoI及NotI消化後，裝入 到pCAGGS (Gene， vol.108, pp.l93-200， 1991)的EcoRI部位整合了 XhoI/NotI 連接序列的質粒的Xhol-Notl部位，構建了質粒(SIVctll附加15個胺基酸 缺失型pCAGGS-Fct27/SIVct11、 SIVctll附力。28個胺基酸缺失型 pCAGGS-Fctl4/SIVct11 及SIVctll 附力口 38個胺基酸缺失型 pCAGGS畫Fct4/SIVct11)。
以下為本實施例所用的各引物的鹼基序列。
FSIVhn: 5'畫GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG國3'(序 列號9 )
RhnSIV:5'畫AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCAC
CATCCCTAACCCTCTGTCCATAAAC-3'(序列號10)
XhFF: 5'國CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3'(序列號 1 1 )
NotF 1650:5'匿ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAAT GT-3'(序列號1 2 )
NotF1611:5'畫ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGTCATCTGGATTACCC AT-3'(序列號1 3 )
NotF 1581:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGC AC-3'(序列號1 4 )
SA-F1650:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATAT CCCTGCCTAACCCTTCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3'(序歹'J號15)
SA-F1611:5'畫ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATAT CCCTGCCTAACCCTACGGTCATCTGGATTACCCAT-3'(序列號16)
SA-F1581:5'國ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATAT CCCTGCCTAACCCTCCTTCTGAGTCTATAAAGCAC隱3'(序列號17)
結果，通過天然包膜蛋白質進行的SIV假型化是不可能的，但可通過 改變其細胞質域的融合(F)及血凝素-神經氨酸酶(HN)，有效地假型化。 將持有GFP基因的SeV-F/HN假型化SIV載體通過在293T細胞中瞬時轉染 而產生，關於VSG-G假型載體用通常使用的技法進行了離心濃縮。
〔實施例2 〕通過F/HN假型SIV載體進行的小鼠鼻腔上皮細胞的基 因導入
用細針將攜帶eGFP的F/HN假型化SIV載體(n = 3 、每隻4 x 10e8 TU; 100ul)給藥到小鼠鼻腔；左鼻孔無前處理。導入基因的表達期間為第3天 到第360天，小鼠鼻腔斷面的解剖學解析按Mery等(Mery et al. Toxicol. Pathol. Vol. 22， p353-372， 1994 )的方法進行。評價了小鼠距鼻骨先端1 ~ 4 mm(距離1,2, 3,4 mm的斷面)的鼻腔斷面的GFP表達。
其結果，確認至少160天內在未前處理狀態下呼吸道上皮細胞中，有 效的轉導及GFP持續表達。明顯證明eGFP的表達可持續至第220天或第 360天。小鼠鼻腔上皮細胞的壽命為90天以內(Borthwick et al. Am J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 24, pp662-670， 2001 )，所以間接證據提示基因導入鼻腔呼 吸道組織幹細胞成為可能(圖5 ~ 7 )。
如圖8所示，圖8右(黏膜下腺等小生境(niches)(適當位置)存在幹 細胞的情況)或圖8左(幹細胞散在於上皮細胞基底膜周圍的情況)的任 一情況下幹細胞局限在適當的小生境，分化的細胞可在上皮組織中側向移 動(lateral movement)以取代壽命終結的細胞(J. M. W. Slack Science Vol.. 287， pl431-1433，2000)。因此甚至在第160天、第220天和第360天都觀察到了 GFP陽性細胞散在整個鼻腔內。在分化的細胞不移動的情況下，應可觀察 到分化的上皮細胞集中在幹細胞周圍。實驗結果啟示為上述側向運動(lateral movement)的可能'I"生。
產業上利用的可能性
本發明者們提供了 一種基因導入呼吸道上皮幹細胞的重組猴免疫缺陷 病毒載體。該載體首次被負鏈RNA病毒的仙臺病毒包膜糖蛋白質F/HN假 型化。使用該載體，可長期且有效地將基因導入到呼吸道上皮幹細胞。該 載體在治療嚢性纖維症等遺傳性呼吸道疾病中非常有價值。例如作為外源 基因，將編碼先天或後天機能缺陷蛋白的基因(例如嚢性纖維症原因因子 等)、或編碼遺傳性疾病造成機能缺陷蛋白的基因在本發明的載體中維持表 達，在治療上述疾病中有著重要的意義。
權利要求
1.一種將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的慢病毒載體，該載體是用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化的載體。
2. 權利要求1的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是感染呼吸系統組 織的RNA病毒。
3. 權利要求l的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是負鏈RNA病毒。
4. 權利要求3的慢病毒載體，其中所述負鏈RNA病毒是副粘病毒。
5. 權利要求4的慢病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
6. 權利要求3的慢病毒載體，其中所述負鏈RNA病毒是正粘病毒。
7. 權利要求6的慢病毒載體，其中所述正粘病毒是流感病毒。
8. 權利要求3的慢病毒載體，其中所述負鏈RNA病毒是纖維病毒。
9. 權利要求8的慢病毒載體，其中所述纖維病毒是伊波拉出血熱病毒。
10. 權利要求l的慢病毒載體，其中所述RNA病毒是正鏈RNA病毒。
11. 權利要求l O的慢病毒載體，其中所述正鏈RNA病毒是冠狀病毒。
12. 權利要求l 1的慢病毒載體，其中所述冠狀病毒是SARS冠狀病毒。
13. 權利要求l的慢病毒載體，其中所述DNA病毒是感染呼吸道系統 組織的DNA病毒。
14. 權利要求l 3的慢病毒載體，其中所述DNA病毒是杆狀病毒。
15. 權利要求l - 1 4任一項的慢病毒載體，其中所述慢病毒載體是重 組猴免疫缺陷病毒載體。
16. 權利要求l 5的慢病毒載體，其中所述重組猴免疫缺陷病毒載體來 源於agm鬥朱。
17. 權利要求1 5或1 6的慢病毒載體，其中所述重組猴免疫缺陷病毒 載體是自失活型。
18. 權利要求l - 1 4的任一項的慢病毒載體，其中所述慢病毒載體是 馬傳染性貧血病毒載體、人免疫缺陷病毒l載體、人免疫缺陷病毒2載體、 或貓免疫缺陷病毒載體。
19. 權利要求l - 1 8的任一項的慢病毒載體，其以可表達的狀態攜帶 外源基因。
20. 權利要求l 9的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼從綠色螢光 蛋白質、(3-半乳糖苷酶及螢光素酶中選出的蛋白的基因。
21. 權利要求l 9的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後天 機能缺陷蛋白質的基因。
22. 權利要求l 9的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後天 機能缺陷的嚢性纖維症(CF)原因因子的基因。
23. 權利要求l 9的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼先天或後天 機能缺陷的CFTR蛋白質的基因。
24. 權利要求l 9的慢病毒栽體，其中所述外源基因是編碼對嚢性纖維 症有治療效果的蛋白質的基因。
25. 權利要求l 9的慢病毒載體，其中所述外源基因是編碼由於遺傳性 疾病造成的機能缺陷的蛋白質的基因。
26. 權利要求2 5的慢病毒載體，其中所述由於遺傳性疾病造成的機能 缺陷蛋白質是編碼CFTR的基因。
27. —種將基因導入到呼吸道上皮幹細胞的方法，該方法包含使權利要 求l - 2 6的任一項的慢病毒載體接觸到呼吸道上皮細胞的步驟。
28. 導入了權利要求1 - 2 6的任一項的慢病毒載體的呼吸道上皮幹細胞。
29. 含有權利要求1 - 2 6的任一項的慢病毒載體作為有效成分的呼吸 道上皮幹細胞用基因導入劑。
30. 權利要求2 9的呼吸道上皮幹細胞用基因導入劑，其特徵為，利用 肺作為生產組織來供給疾病治療所需蛋白質。
31. —種遺傳性呼吸系統疾病的治療劑，該治療劑以權利要求1 - 2 6 的任一項的慢病毒載體為有效成分。
32. 權利要求3 1的治療劑，其中所述遺傳性呼吸系統疾病為嚢性纖維症。
全文摘要
本發明者們通過仙臺病毒包膜糖蛋白F及HN假型化猴免疫缺陷病毒載體，成功地將基因導入了呼吸道上皮組織幹細胞。使用本發明的載體將基因導入到呼吸道上皮組織幹細胞可基因治療囊性纖維症等遺傳性呼吸系統疾病。另外，可選擇肺等呼吸器官作為供給遺傳性疾病所缺失的蛋白質的生產組織。
文檔編號A61K48/00GK101351557SQ20068005017
公開日2009年1月21日 申請日期2006年10月27日 優先權日2005年10月28日
發明者井上誠, 巖崎仁, 見供克之, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社