一段陰道加德納氏桿菌dna序列(5)特異性的確定及其應用的製作方法

2023-05-22 08:53:46 2

專利名稱：一段陰道加德納氏桿菌dna序列(5)特異性的確定及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)DNA序列(5)特異性的確定及其應用，屬於生物醫學技術領域。
背景技術：
陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)是一種婦女陰道經常感染的病原物，準確的診斷是進行即時而可靠的治療的依據，目前只能根據臨床指徵進行診斷。PCR和基因晶片診斷是一種快速而準確的檢測方法。而這一類的診斷方法依賴於獲得特異的核酸序列。

發明內容
本發明在於通過生物信息學和分子生物學技術，確定了一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異核苷酸序列及其PCR引物。該序列和相應的PCR引物可用於建立基因晶片和PCR方法進行陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的診斷。
本發明的技術方案為本發明利用現有的方法確定了長度為205bp的一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異DNA序列(5)及其PCR引物，用引物進行PCR擴增，其序列如下gccaaacaaa aagccactct agatgacttt ctactcgact atttaagaaa ttatttatta 60ttgaaattta ttgcaaaatg agtaaatcgc aatttacttg cacaaaacaa ctactattgt 120ggtagttatt tcactagttg cctcaacatt gccaataccc aaagttttag caatgtcttg 180tgcagcagca cgattttcat ctccc205引物序列為1.5』-gggagatgaaaatcgtgctg-3』2.5』-gccaaacaaaaagccactct-3』上述的陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異DNA序列(5)用於診斷陰道加德納氏桿菌的基因晶片的探針序列，並通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記後進行雜交檢測或直接用於PCR診斷。
用本發明建立的臨床檢測技術所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優點。


圖1為臨床標本的PCR擴增圖譜。
圖2、圖2續是測序圖。其中圖2是測定的序列、圖2續是原始測序圖譜。
圖3是用Blast軟體對PCR擴增產物的測序結果與預計序列的比較分析。
圖4、圖4續(1)、圖4續(2)是基因資料庫中Blast搜索結果。
圖5為基因晶片雜交結果。
具體實施例方式首先以陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)為關鍵詞，在基因資料庫中搜索陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的核苷酸序列。共獲得數條關係較密切的核苷酸序列，將這些核苷酸序列用NCBI網上的Blast在線使用軟體比對基因資料庫中的核苷酸序列(nr)，排出非特異性的核苷酸序列，獲得了1Kb特異性的核苷酸序列。以這段序列設計了20餘對PCR引物，以臨床標本提取DNA，進行PCR擴增，篩選到一對適合進行PCR擴增的序列及引物，PCR擴增獲得的產物與預計大小一致(見圖1，圖中序號1為標準分子量DNA，分子量大小從上至下分別為622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5為臨床陰性標本，沒有擴增產物；3為臨床陽性標本，擴增產物很純，大小200左右，與預計大小一致。圖譜結果顯示用本發明中的引物能特異的擴增臨床樣品)，然後用T-vector進行克隆，並測序(測序報告見圖2、圖2續，圖中從59位開始，到263位，共205bp為克隆序列，其餘序列為克隆載體序列)，序列為205bp，通過Blast軟體比對預計序列，顯示與預計的序列一致(見圖3，圖中除第22位由g改變成t，第24位和174位由t改變成c，第88位由c改變成a，第112位和172位由t改變成a，第153位由c改變成t外，其餘均與預計序列一致)，表明該序列可以被特異性的擴增，可用於陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)PCR檢測。序列用NCBI網站的Blast搜索基因資料庫的DNA(包含cDNA)序列，該序列只與陰道加德納氏桿菌(Gardnerellavaginalis)的序列一致，而與其它的物種序列沒有同源性見圖4、圖4續(1)、圖4續(2)，圖中搜尋結果表明，只有陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的質粒DNA序列與本序列同源，並且是完全配對，有一段約70bp的序列同源，也是陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的序列。而其它的序列只有40字符左右的短序列，由於這些序列沒有引物與此配對，故在檢測中不會被檢測到。用這一序列標記後作為探針與含有9種泌尿生殖道感染病原物的45個基因位點的基因晶片雜交，只有本發明序列與此有雜交信號，而其它所有序列與此無雜交信號(見圖5，圖中是4個重複，每個重複含9種泌尿生殖道感染性疾病病原物共45個不同的位點和4個對照位點。雜交結果表明只有本序列有特異信號，而其它均無雜交信號)，表明該序列為陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的特異序列。
本發明可用於PCR方法或基因晶片方法進行陰道加德納氏桿菌(Gardnerellavaginalis)的臨床檢測。用本發明提供的序列進行PCR擴增，根據PCR方法獲得產物是否出現和大小判斷是否為陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)感染。也可用本序列為探針，作為基因晶片中的一個檢測位點，然後用本發明中的PCR引物序列擴增臨床標本，並標記後進行雜交檢測。
說明書序列表110昆明寰基生物晶片開發有限公司120一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(5)特異性的確定140
141
16012101211205212DNA213陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)220
221gene222(1)…(205)4001gccaaacaaa aagccactct agatgacttt ctactcgact atttaagaaa ttatttatta 60ttgaaattta ttgcaaaatg agtaaatcgc aatttacttg cacaaaacaa ctactattgt 120ggtagttatt tcactagttg cctcaacatt gccaataccc aaagttttag caatgtcttg 180tgcagcagca cgattttcat ctccc20權利要求
1.一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(5)特異性的確定，其特徵在於該序列的長度為205bp，其序列及PCR引物如下gccaaacaaa aagccactct agatgacttt ctactcgact atttaagaaa ttatttatta 60ttgaaattta ttgcaaaatg agtaaatcgc aatttacttg cacaaaacaa ctactattgt 120ggtagttatt tcactagttg cctcaacatt gccaataccc aaagttttag caatgtcttg 180tgcagcagca cgattttcat ctccc205引物序列為1.5』-gggagatgaaaatcgtgctg-3』2.5』-gccaaacaaaaagccactct-3』
2.一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(5)特異性的應用，其特徵在於該序列用於診斷陰道加德納氏桿菌的基因晶片的探針序列，並通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記後進行雜交檢測或直接用於PCR診斷。
全文摘要
本發明涉及一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(5)特異性的確定及其應用，屬於生物醫學技術領域。本發明通過基因資料庫資料的搜尋和分析，確定了一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(5)的特異性及PCR擴增引物，該序列長度為205bp。通過對婦女生殖道陰道加德納氏桿菌感染標本的PCR擴增、克隆，獲得該序列，測序證明與預計序列一致。再經生物信息學方法分析，基因晶片雜交分析，結果證實了該序列對於陰道加德納氏桿菌的特異性。本發明作為基因晶片診斷的探針及PCR擴增檢測序列，用於陰道加德納氏桿菌的診斷。用本發明建立的臨床檢測技術所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優點。
文檔編號C12Q1/68GK1495264SQ0213340
公開日2004年5月12日 申請日期2002年7月2日 優先權日2002年7月2日
發明者譚德勇, 朱寶生 申請人:昆明寰基生物晶片開發有限公司