酶功能改變方法及其突變體的製作方法

2023-05-22 02:09:11

酶功能改變方法及其突變體的製作方法
【專利摘要】本發明的課題為提供變換中鏈脫氫酶/還原酶（MDR）家族酶的輔酶依賴性的酶改變方法。此外，本發明的課題為提供通過該改變方法轉換輔酶依賴性的MDR家族酶突變體，以及提供應用該酶來以酶法製造光學活性醇的方法。本發明開發新的變換MDR家族酶的輔酶依賴性的酶改變方法，通過該酶改變方法，從將NADH作為輔酶利用的有用的MDR家族酶，合理地設計了將NADPH作為輔酶利用的酶突變體，並提供實際上具有這樣的功能的突變體。
【專利說明】酶功能改變方法及其突變體
【技術領域】
[0001]本發明涉及醇脫氫酶的輔酶依賴性的改變方法，特別是中鏈脫氫酶/還原酶(MDR:Medium-chain Dehyrdrogenase/Reductase)的輔酶依賴性的改變方法。
【背景技術】
[0002]一般而言，在使用了氧化還原酶的光學活性醇類的製造中輔酶是必要的，因此為了避免因反應進行而引起的輔酶枯竭，與氧化還原並行而進行輔酶的有效率的再生是重要的課題。作為光學活性醇類的製造中必要的輔酶，可舉出還原型β_煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，其中，將氧化型記為NADP+)或者還原型β -煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，其中，將氧化型記為NAD+)等的吡啶核苷酸輔酶。作為將這些輔酶再生的方法，例如，周知使用葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)等的方法。
[0003]以往，儘管存在具有優異的物性(穩定性、耐溶劑性、耐氧化性)、比活性的醇脫氫酶，但是其輔酶依賴性未被最優化，即使將NADPH或者NADH中的任一個再生，光學活性醇類的生產率也受到限制。考慮如果能夠將醇脫氫酶的輔酶依賴性最優化為輔酶再生酶的輔酶依賴性，即NADPH型或NADH型中的任一個，則在光學活性醇等的製造中的工藝最優化會變得容易，能夠提供更有效率的製造方法。
[0004]通過突變篩選取得輔酶依賴性被轉換的酶是需要龐大的勞力的，因此進行了考慮酶的立體結構信息來合理地設計輔酶依賴性被轉換的酶突變體的嘗試(專利文獻1、非專利文獻I)。
[0005]醇脫氫酶(ADH)也可以說是通過該邏輯設計來取得輔酶依賴性被轉換的突變體的代表性酶家族。其中，關於胺基酸殘基數是250左右的短鏈脫氫酶/還原酶(SDR:Short-chain Dehydrogenase/Reductase)家族的酶,近年已報導了成功地進行輔酶依賴性的轉換的例子(非專利文獻2、非專利`文獻3)。但是，關於胺基酸殘基數為350左右的中鏈脫氫酶/還原酶(MDR)家族，沒有相同的報告例。
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:國際公開第03/004653號小冊子
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻I =Penning T.M.等著，「Chem.Rev.」，2001 年，第 101 卷，第 3027-3046頁
[0010]非專利文獻2:Machielsen R.等著，「Eng.Life Sc1.」, 2008 年，第 9 卷，第 38-44頁
[0011]非專利文獻3:Zhang R.等著,「Appl.Environ.Microbiol., 2009 年，第 2176-2183頁

【發明內容】

[0012]本發明的課題為將醇脫氫酶對NADPH或NADH中的任一個的依賴性最優化，提高使輔酶再生系統共同作用時的光學活性醇類的生產率。
[0013]但是，不可能將種類、同源性不同的酶的邏輯設計直接適應於MDR。進一步地，作為醇脫氫酶，使用由約350個胺基酸殘基構成的MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶的情況下，導入突變的位置的候補即使在導入I個突變的情況下也存在350處，在導入多個突變的情況下會存在龐大數量的候補。進一步地，在各自的位置中，能夠向至少19種胺基酸進行置換，從這些無數的候補中鑑別使對輔酶的依賴性轉換而成的突變體是非常困難的。
[0014]本發明人等為了解決上述課題而進行了深入研究，結果開發了新的變換屬於MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族的酶的輔酶依賴性的酶改變方法，成功地將導入突變的位置從多達350處的候補縮小成4處，且從19種存在的天然胺基酸中確定了最優的胺基酸來作為突變後的胺基酸。由此，成功地從NADH/NAD+依賴性MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶取得的NADPH/NADP+依賴性酶突變體，並從NADPH/NADP+依賴性MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶取得NADH/NAD+依賴性酶突變體。
[0015]gp，本發明涉及:
[0016][I] 一種蛋白質,屬於中鏈氧化還原酶家族,並具有選自下述的(a)~(d)中的至少一種氣基酸殘基:
[0017]Ca)與序列號I的Asp-201在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ala或Ser，
[0018](b)與序列號I的Lys-202在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Arg，
[0019](c)與序列號I的Lys-203在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ser,以及，
[0020](d)與序列號I的Ala-206在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys;
[0021][2]根據[I]所述的蛋白質，其由與序列號I所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同源性的胺基酸序列構成；
[0022][3]根據[I]或[2]所述的蛋白質，其中，由在序列號I所示的胺基酸序列中導入有選自下述的(e)~(h)中的至少一種突變的胺基酸序列構成:
[0023](e)將 Asp-201 置換為 Ala 或 Ser，
[0024](f )將 Lys-202 置換為 Arg,
[0025](g)將 Lys-203 置換為 Ser，以及，
[0026](h)將 Ala-206 置換為 Lys;
[0027][4]根據[I]~[3]中任一項所述的蛋白質，其由序列號2~8中任一項所述的胺基酸序列構成；
[0028][5]由編碼[I]~[4]中任一項所述的蛋白質的鹼基序列構成的DNA;
[0029][6] 一種 DNA，選自以下(A)、(B)以及(C):
[0030](A)由序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列構成的DNA，
[0031](B)與包含與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA在嚴格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA，
[0032](C)與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列具有85%以上的序列同源性、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA;
[0033][7] 一種載體，包含[6]所述的DNA;
[0034][8] 一種轉化體，是用[7]所述的載體轉換宿主細胞而得到的；
[0035][9] [8]所述的轉化體的培養物；[0036][10] 一種氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，包括如下工序:用
[I]~[5]中任一項所述的蛋白質，使還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸進行變換，得到氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
[0037][11] 一種還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，包括如下工序:用[I]或[2]所述的蛋白質，變換氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，得到還原型煙醯胺腺嘌呤
二核苷酸磷酸；
[0038][12] 一種還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，通過使還原酶作用於由[10]所述的方法得到的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進行；
[0039][13] 一種氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，通過使氧化酶作用於由
[II]所述的方法得到的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進行；
[0040][14]根據[10]~[13]中任一項所述的製造方法，其特徵在於，利用權利要求8所述的轉化體或權利要求9所述的培養物；
[0041][15]通過[10]~[14]中任一項所述的製造方法製造的化合物。
[0042]由於醇脫氫酶(ADH)，特別是中鏈脫氫酶/還原酶(MDR)家族的輔酶依賴性得到最優化，因此能夠提高使輔酶再生系統共同作用時的光學活性醇類的生產率。
[0043]作為NADP+還原酶，近年發現物性優異的源自乳酸菌的⑶H (國際公開第09/041415號小冊子)。但是，源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的MDR家族酶RMA由於野生型是NADH依賴性的，因此難以將作為NADP+還原酶的源自乳酸菌的GDH用作輔酶再生酶。與此相對，如果是通過輔酶依賴性的轉換而得到的本發明的蛋白質，則能夠將源自乳酸菌的作為NADP+還原酶的GDH用作輔酶再生酶，製造工藝構建上的優點極其大。
[0044]此外，在將利用NADPH/NADP+依賴性酶的反應和利用NADH/NAD+依賴性酶的反應在一個反應溶液中實施的多階段反應的情況下，能夠改變輔酶依賴性，因此本技術達到反應工藝最優化的優點很大。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為本發明的實施例4涉及的反應示意圖。
[0046]圖2為示出本發明的實施例4涉及的反應中的光學活性醇的變換率和光學純度的分析結果的圖。
【具體實施方式】
[0047]本說明書中，「蛋白質」這一術語是包含具有多肽結構的所有分子的物質，被片段化或通過肽鍵連接的多肽鏈也被包含在「蛋白質」這一術語中。
[0048]本發明的蛋白質是通過對屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族的蛋白質導入胺基酸置換突變而得到的。中鏈脫氫酶/還原酶(Medium-chain Dehydrogenase/Reductase,MDR)家族是屬於醇脫氫酶(ADH，ECl.1.1.1.)的家族之一，由350~375個殘基構成，基本都含有鋅(Zn)。中鏈脫氫酶/還原酶家族由各種生物信息學資料庫(Bioinformatics database)進行了登記?分類?定義。例如，與 PfamChttp://pfam.sanger.ac.uk/)的家族 ID「PF00107」相關聯的酶全部屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族，在2011年4月這一時間點，超過20000個的序列得到登記。屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族的酶參與醇發酵、醛解毒、木質素的生物合成、脂肪酸的生物合成或免於氧化損傷的保護等廣泛的生理功能。
[0049]就屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族的蛋白質而言，作為輔酶的吡啶核苷酸是必要的。所謂吡啶核苷酸是指煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(將還原型記為NADPH，將氧化型記為NADP+)或β -煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(將還原型記為NADH，將氧化型記為NAD+)。
[0050]此外，即使是新發現的未登記的序列，如果與中鏈脫氫酶/還原酶家族酶的序列同源性高，則也被分類為中鏈脫氫酶/還原酶家族酶。「序列同源性」是能夠通過前述的使用了 PROGRAM BLAST的胺基酸序列同源性解析來確定的。在BLAST分析中評價同源性時，可使用E-value這一統計值，同源性越高，該數值越無限接近於O。從序列同源性判斷是否是MDR家族酶時，相對於公知的MDR家族酶，E-value優選為I X 10_5以下，更優選為I X 10,以下，進一步優選為I X IO45以下。用於實施BLAST分析的軟體可通過National Centerfor Biotechnology Information (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)進行利用。
[0051]作為成為導入胺基酸置換突變的對象的中鏈脫氫酶/還原酶家族酶，優選為蛋白質序列資料庫UniProtKB (http://www.uniprot.0rg/)收載的酶。作為能夠應用變換成NADPH/NADP+依賴性的技術的NADH/NAD+依賴性中鏈脫氫酶/還原酶家族酶，例如可舉出源自酵母的ADHl (P00330)、源自芽孢桿菌的ADH-HT (P42328)以及源自人的ADHl β (Ρ00325)等。同樣地，作為能夠應用變換成NADH/NAD+依賴性的技術的NADPH/NADP+依賴性MDR家族酶，例如可舉出源自酵母的ADH6 (Q04894)、源自美國白楊的芥子(sinapyl) ADH (Q94G59)以及源自人的PIG3 (Q53FA7)等。應予說明，括號內是前述資料庫中的編碼號碼。
[0052]突變導入前的蛋白質優選為由相對於源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的被包含在MDR家族中的酶(國際公開第08/066018號小冊子，以下簡寫為RMA)，具有高的序列同源性的胺基酸序列構成的蛋白質。「序列同源性」是在相同的區域中完全一致的胺基酸殘基數所佔的比例，可通過前述的BLAST分析求出，由「Identities」標記。
[0053]突變導入前的蛋白·質相對於序列號I的胺基酸序列的序列同源性優選為85%以上，更優選為90%以上，進一步優選為95%以上。突變導入前的蛋白質最優選為由序列號I的胺基酸序列構成的蛋白質，該蛋白質是源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的MDR家族酶(國際公開第08/066018號小冊子，以下簡寫為RMA)。RMA例如將NADH作為輔酶，將酮還原，催化生成光學活性醇的反應。在由序列號I的胺基酸序列構成的蛋白質(RMA)中導入胺基酸置換突變而設計本發明的蛋白質的情況下，能夠將輔酶依賴性從NADH依賴性轉換為NADPH依賴性。本發明是通過利用該RMA (序列號I)的模擬立體結構而實現的。
[0054]在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是指，基於胺基酸序列信息來預測突變導入前的蛋白質的立體結構，與由序列號I的胺基酸序列構成的蛋白質的立體結構進行比較時，與由序列號I的胺基酸序列構成的蛋白質中同等的位置存在的胺基酸殘基。
[0055]以下，例示使用序列號I作為突變導入前的蛋白質時的胺基酸置換突變的邏輯設計方法。RMA的立體結構的邏輯設計可通過利用RMA的模擬立體結構來實現。應予說明，關於由序列號I所示的野生型RMA，未進行以X射線晶體結構分析為首的結構解析等實驗，其立體結構是未知的。
[0056]基於RMA的胺基酸序列信息，利用Program ClustalX (Thompson、J.D.等著，「Nucleic Acid Res.」，1994年，第22卷，第4673-80頁)，完成與具有胺基酸序列同源性且立體結構被登記在蛋白質資料庫(Protein Data Bank, PDB)的酶的多重胺基酸序列比對。與RiA具有胺基酸序列同源性的蛋白質能夠通過如下方式進行選擇，即，以被登記在PDB的蛋白質的胺基酸序列為對象,使用PROGRAM BLAST (Altschul, S.F.等著，「NucleicAcid Res.」 1997 年，第 25 卷，第 3389-3402 頁)或 PS1-BLAST (Shaffer A.A.等著，「Bioinfomatics」，2000年，第164卷，第88-489頁)進行胺基酸序列同源性的檢索。
[0057]接下來，這些立體結構已知的蛋白質的三元立體結構比對可通過Swiss-PDBViewer (Guex N.等著，「Electrophoresis」，1997 年，第 18 卷，2714-2723)等的三維繪圖程序、VAST Search (Gibrat J.F.等著，「Curr.0pin.Struct.Biol.」，1996 年，第6卷，377-)等的立體結構比較.類似結構檢索伺服器進行。首先將僅由胺基酸序列得到的多重比對，基於立體結構的類似性進行修正，將以得到的序列比對為基礎被推定為立體結構的類似性高的蛋白質的立體結構(PDB編碼:1LLU)作為分子模擬的模板蛋白質進行選擇。使該模板蛋白質由Program Swiss PDB-Viewer表示,按照序列比對，以適於RMA的胺基酸序列(序列號I)的方式進行胺基酸殘基的置換。關於插入、缺失部位，從PDB檢索最優的類似部分結構，置換為該部分結構，從而構建立體結構模型。
[0058]以該立體結構模型為基礎，以輔酶結合口袋周圍為中心，確定被預測為對與輔酶的結合產生較大影響、且對輔酶結合性以外的功能幾乎沒有影響的被預測部位(殘基)。接下來，通過使NADH以及NADPH虛擬對接的立體結構的模型構建、以及利用了該對接結構的計算化學方法進行的自由能計算，設計對NADH的親和性降低且對NADPH的親和性變高的突變。一般而言，關於酶(蛋白質)和輔酶(底物)複合體的穩定性，能夠根據自由能進行討論(A.R.Leach著，「分子模擬概論」，2004年，第11章)。
[0059]若利用分子模擬結構(主鏈的骨架)，則能夠通過利用了分子力場法的分子模擬計算(能量極小化計算)來算出輔酶不結合的狀態(apo)與輔酶結合的狀態(holo)的自由能差分值。該邏輯的詳細情況可以說是設計與目標蛋白質結合的藥物的方法的應用。LBDD配體?基的自由能差與野生型相比，在NADH的情況下對apo有利,且在NADPH的情況下對holo有利這一趨勢特別強的突變可以說對轉換輔酶依賴性是有用的。具體地，通過使用ProgramShrike(日本特許公開第2001-184381號公報)的計算機篩選，進行胺基酸突變候補的縮小。
[0060]通過上述方法，能夠提取在由350個左右殘基構成的MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶中的對輔酶的識別重要的部位，且能夠發現為了獲得作為目標的輔酶依賴性而最優的各部位的胺基酸的種類(及其組合)。在MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶中，容易確定與序列號I的第20 1位、第202位、第203位或第206位在立體結構上同等的位置。利用前述的VAST Search等立體結構比較.類似結構檢索伺服器，進行立體結構已知的胺基酸序列(例如，本次發明中使用的PDB編碼:1LLU的胺基酸序列)與以立體結構為基礎的胺基酸序列的比對，從而能夠容易地鑑定在立體結構上同等的位置。該VAST Search也能夠通過美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)進行利用。
[0061]本發明的蛋白質優選屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族，並具有選自下述(a)~(d)中的至少一種胺基酸殘基:
[0062](a)與序列號I的Asp-201在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ala或Ser，
[0063](b)與序列號I的Lys-202在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Arg，
[0064](c)與序列號I的Lys-203在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ser,以及，
[0065]Cd)與序列號I的Ala-206在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys。[0066]進一步地，更優選屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族，並包含下述(e)~(g)中的全部
氣基酸殘基:
[0067](e)與序列號I的Asp-201在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ser，
[0068](f)與序列號I的Lys-202在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Arg，以及，
[0069](g)與序列號I的Ala-206在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys。
[0070]通過上述(a)~(d)或(e)~(g)的突變導入，能夠將輔酶依賴性是NADH (或NAD+)依賴性的醇脫氫酶轉換為NADPH (或NADP+)依賴性。
[0071]突變導入後的蛋白質相對於序列號I的胺基酸序列的序列同源性優選為85%以上，更優選為90%以上，進一步優選為95%以上。具體而言，突變導入後的蛋白質優選具有序列號2~8所示的胺基酸序列，更優選具有序列號2~3所示的胺基酸序列。
[0072]此外，本發明的蛋白質優選具有醇脫氫活性，並具有選自下述(i)~(I)中的至少
一種胺基酸殘基:
[0073](i)與序列號I的Asp-201在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Asp，
[0074](j)與序列號I的Lys-202在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys，
[0075](k)與序列號I的Lys-203在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys，以及，
[0076](I)與序列號I的Ala-206在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ala。
[0077]通過上述(i)~(I)的突變導入，能夠將輔酶依賴性是NADPH (或NADP+)依賴性的醇脫氫酶轉換為NADH (或NAD+)依賴性。
[0078]本發明的蛋白質優選相對於突變導入前顯示高氧化(或還原，以後簡寫為「氧化/還原」)活性的輔酶的氧化/還原活性降低。或者，優選相對於突變導入前顯示低的氧化/還原活性(或完全不顯示)的輔酶的氧化/還原活性提高。進一步地，本發明的蛋白質更優選具有這兩方的特徵。
[0079]所謂輔酶氧化/還原活性比是指，將突變導入後顯示依賴性的輔酶的氧化/還原活性，用突變導入前顯示依賴性的其他的輔酶的氧化/還原活性去除而得的值。例如，RMA的情況下，輔酶氧化/還原活性比由氧化活性比(NADPH/NADH)表示。輔酶氧化/還原活性比優選為I以上，更優選為5以上，進一步優選為10以上。在希望僅將突變導入後顯示依賴性的輔酶有選擇地氧化/還原的情況下，可要求嚴密的輔酶選擇性，因此進一步更優選為20以上，在要求更嚴密的輔酶選擇性的情況下，最優選30以上。例如，同時進行利用煙醯胺輔酶依賴性的酶的兩個反應時，在相互的酶的輔酶依賴性不同的情況下，通常要求嚴密的選擇性。應予說明，突變導入前的輔酶氧化/還原活性比即使很高，也為0.1左右，如果大於該值，則原本就是在兩方顯示依賴性的酶。
[0080]輔酶氧化/還原活性，在RMA的情況下，是將在I分鐘內將I μ mo I的NADPH (或NADH)氧化為NADP+(NAD+)的酶活性定義為I個單位而算出的。在突變導入前後，為了算出輔酶氧化/還原活性的反應液組成、酶濃度設為相同條件。輔酶氧化/還原活性的測定條件，在RMA的情況下，優選為pH4.0~10.0、溫度為4°C~80°C的一定溫度下，一定時間的通氣攪拌處理的條件，但是也可以考慮組合的輔酶再生酶的物性來進行設定，並不受到這些條件的限制。本發明的蛋白質若除去輔酶依賴性被轉換的特徵，則維持例如底物特異性等本來的功能。
[0081]本發明的DNA是由編碼本發明的蛋白質的鹼基序列構成。只要是按照後述的方法，在被導入的宿主細胞內能表達本發明的蛋白質的DNA，就可以為任意的DNA，也可以包含任意的非翻譯區域。只要能夠設計蛋白質，就能夠通過由作為導入突變前的蛋白質的起源的生物，按照本領域技術人員公知的方法取得導入突變前的DNA並導入突變，從而取得本發明的DNA。
[0082]向編碼野生型MDR家族酶的DNA進行的部位特異性突變的導入，能夠使用重組DNA技術、PCR法等進行。利用重組DNA技術的突變的導入，在野生型酶基因中的希望導入突變的目標部位的兩側存在適當的限制酶識別序列的情況下，能夠通過盒式突變法進行，所述盒式突變法為用前述制限酶切斷此處，將包含希望導入突變的部位的區域除去後，利用化學合成等僅在目標部位插入導入突變的DNA片段。此外，利用PCR進行的部位特異性突變的導入是通過如下方式進行的，即，用在野生型編碼基因中的希望導入突變的目標部位導入了目標突變的突變引物和不具有包含前述基因的一個末端部位的序列的突變的擴增用引物來擴增前述基因的單側，用具有相對於前述突變用引物互補的序列的突變用引物和不具有包含前述基因的另一個末端部位的序列的突變的擴增用引物來擴增另一側，將得到的兩個擴增片段進行退火操作，然後進一步地用前述2種擴增用引物進行PCR操作。除了這些重組DNA技術、PCR法之外，也可以通過化學合成來取得編碼導入了突變的胺基酸序列的DNA。
[0083]作為這樣得到的編碼本發明的蛋白質的DNA，例如，可舉出由序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列構成的DNA。
[0084]此外，作為本發明的DNA，可舉出與包含與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA在嚴格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA。
[0085]此外，作為本發明的DNA，可舉出與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列具有85%以上的序列同源性、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA。
[0086]此處，「與包含與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA在嚴格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA」是通過將包含與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA作為探針，在嚴格條件下使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或者SOUTHERN雜交法等而得到的DNA，且是指編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的DNA。
[0087]雜交可按照 Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)等中記載的方法進行。此處嚴格條件下雜交的DNA」可舉出，例如通過如下方法取得的DNA，即，通過使用將源自菌落或者噬菌斑的DNA進行了固定化的過濾器，在0.7~1.0M的NaCl存在的條件下、65°C時進行雜交之後，使用2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成由150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉構成)，65°C的條件下，清洗過濾器而取得DNA。優選65°C時以0.5倍濃度的SSC溶液清洗，更優選65°C時以0.2倍濃度的SSC溶液清洗，進一步優選65 °C時以0.1倍濃度的SSC溶液清洗而取得的 DNA。
[0088]雖然記在了以上這樣的雜交條件，但是本發明並不特別局限於這些條件。作為對雜交的嚴格性造成影響的要素，可考慮溫度、鹽濃度等多個要素，只要是本領域技術人員，就能夠對這些要素進行適宜選擇來實現最優的嚴格性。[0089]作為通過上述條件能夠雜交的DNA，可舉出與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列的序列同源性是85%以上，優選90%以上，更優選95%以上的DNA，被編碼的多肽只要具有氧化還原酶活性，就被包括在上述DNA中。
[0090]此處，「序列同源性(％)」是由使被對比的兩個DNA進行最優地比對排列，將核酸鹼基(例如、A、T、C、G、U或I)在兩個序列中一致的位置的數量用比較鹼基的總數去除，然後將該結果乘以100而得到的數值表示。
[0091]本發明的載體可以通過將本發明的DNA插入適當的載體而得到。用於插入DNA的空載體，只要在宿主細胞中能夠進行自主複製，就無特別限制，可將質粒DNA或噬菌體DNA作為載體使用。例如，在使用大腸桿菌作為宿主細胞的情況下，可使用pBR322、pUC18、pBluescriptll等質粒DNA、EMBL3、M13、λ gtll等噬菌體DNA等。在使用酵母作為宿主細胞的情況下，可使用YEpl3、YCp50等。在使用植物細胞作為宿主細胞的情況下，可使用pBI121、pBI101等，在使用動物細胞作為宿主細胞的情況下，可使用pcDNAI等作為載體。
[0092]本發明的轉化體可通過使用上述載體轉化宿主細胞而得到。宿主生物，只要是能夠由包含編碼DNA的表達載體進行轉化，將導入的DNA編碼的蛋白質進行表達的生物，就無特別限制。作為能夠利用的微生物，例如，可舉出大腸埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及乳桿菌屬(Lactobacillus)等宿主載體系統中被開發的細菌；紅球菌屬(Rhodococcus)以及鏈黴菌屬(Streptomyces)等宿主載體系統中被開發的放線菌；酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)屬、耶氏酵母屬(Yarrowia)、絲抱酵母屬(Trichosporon)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、畢赤酵母屬(Pichia)以及假絲酵母屬(Candida)等宿主載體系統中被開發的酵母；脈孢菌屬(Neurospora)、麴黴屬(Aspergillus)、頭孢菌屬(Cephalosporium)以及木黴屬(Trichoderma)等宿主載體系統中被開發的黴菌等。此外，除了微生物以外，植物、動物中各種宿主.載體系統也正被開發，特別是在使用了蠶的昆蟲或菜籽、玉米、土豆等植物中大量開發表達不同種類蛋白質的系統，能夠合適地利用。其中，從導入以及表達效率的觀點出發，優`選細菌，更優選大腸桿菌。
[0093]作為轉化的方法，向細菌導入重組體DNA的情況下，例如可舉出使用鈣離子的方法、電穿孔法等。作為向酵母的導入重組體DNA的方法，例如，可舉出電穿孔法、原生質體法、醋酸鋰法等。作為向植物細胞導入重組體DNA的方法，可舉出農桿菌(Agrobacterium)感染法、基因槍(particle gun)法、聚乙二醇法等。作為向動物細胞導入重組體DNA的方法，例如，可舉出電穿孔法、磷酸鈣法等。
[0094]本發明的培養物可通過將上述轉化體在培養基中培養而得到。將轉化體在培養基中培養，使蛋白質在培養菌體中或培養上清中生成蓄積，採集前述酶突變體，從而能夠得到包含本發明的蛋白質的培養物。
[0095]轉化體的培養，按照在宿主培養中使用的常規方法進行。作為培養以大腸桿菌等細菌為宿主而得到的轉換細胞的培養基，可舉出完全培養基或合成培養基，例如，可舉出LB培養基、TB培養基、M9培養基等。此外，通過在培養溫度20~40°C下進行有氧培養，使本發明的酶突變體在菌體內蓄積並進行回收。酶突變體的精製可通過如下方式進行，即，將通過前述的養法得到的培養物進行離心分離並回收，對細胞用超聲波儀等進行破碎，將親和色譜法、陽離子或陰離子交換色譜法、凝膠過濾等單獨或適當組合，從而進行酶突變體的精製。得到的精製物質是目標酶的確認可通過常規方法，例如SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、Western印跡法等進行。轉化體的培養物的精製處理是指在不損失酶活性的情況下，將目標酶以外的雜質去除；精製處理物是通過前述處理而得到的含酶物。作為精製處理物，例如可舉出通過破碎細胞而得到的無細胞提取液、精製得到的酶溶液、或者酶溶液的冷凍乾燥物。
[0096]將在具有醇脫氫酶活性的蛋白質導入選自上述(a)~(d)中至少一種的胺基酸置換突變而得到的蛋白質，與置換突變導入前的蛋白質相比較，對NADPH的依賴性提高，對NADH的依賴性降低。因此，使用該蛋白質，能夠變換還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，得到氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。
[0097]此外，由於該反應是平衡反應，因此使用該蛋白質，也能夠變換氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，得到還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
[0098]將具有醇脫氫酶活性的蛋白質導入選自上述(i)~(1)中的至少一種的胺基酸置換突變而得到的蛋白質，與置換突變導入前的蛋白質相比較，對NADH的依賴性提高，對NADPH的依賴性降低。因此，使用本發明的蛋白質能夠變換還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH ),得到氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。
[0099]此外，由於該反應是平衡反應，因此使用該蛋白質，也能夠變換氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，得到還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。
[0100]在本發明的蛋白質的反應系統中通過使輔酶再生系統共同作用，能夠提高光學活性醇的生產率。
[0101]使用本發明的蛋白質製造的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，通過與輔酶再生系統作用，能夠製造還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。這樣的輔酶再生系統是具有還原氧化型輔酶的活性的酶，作為具體例，可舉出葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)、乳酸脫氫酶(LDH)以及蘋果酸脫氫酶(MDH)。
[0102]此外，使用本發明的蛋白質製造的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，通過使輔酶再生系統起作用，能夠製造氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。這樣的輔酶再生系統是具有將還原型輔酶進行氧化的活性的酶，作為具體例，可舉出葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)、乳酸脫氫酶(LDH)以及蘋果酸脫氫酶(MDH)。
[0103]這些還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、或者氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的製造，可使用上述的轉化體及其培養物進行。
[0104]實施例
[0105]關於置換胺基酸的突變的標記，進行如下標記:在置換位置的序號之前，附上野生型或非突變型的胺基酸，在置換位置序號之後，附上突變的胺基酸。例如，將201位的Asp置換為Ala的突變記為D201A。
[0106](實施例1)包含RMA突變體基因的重組載體的製作以及重組大腸桿菌的製作
[0107]為了使源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的MDR (中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶(國際公開第08/066018號小冊子，以下簡寫為RMA)的突變體在大腸桿菌中表達，使用該文獻中記載的PNCM載體(RMA野生型表達質粒)，製備各種突變體的表達質粒。
[0108]關於突變的導入，將pNCM載體作為模板，通過使用以在意圖的部位能夠導入突變的方式而設計的2種合成引物的Quick Change法，得到包含各種RMA突變體基因的重組質粒。關於 Quick Change 法，使用 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制),按照添加的程序進行。首先，將pNCM (序列號9)作為模板DNA,應用使用序列號10~11所示的2種合成引物，實施Quick Change法,製備導入突變A206K的RMA突變體表達質粒。得到的表達質粒的編碼DNA序列如序列號12所示。應予說明，Quick Change法是轉化也包含在實驗方案中的突變導入法,本實施例中，轉化大腸桿菌HBlOl (Takara公司制)，製作重組大腸桿菌。將包含序列號9 (野生型)或序列號12 (突變體K206R)的編碼DNA的表達質粒作為模板，將序列號13~22的合成引物實施通過與上述同樣的方法僅利用了 2種的Quick Change法,製備編碼序列號2~8的胺基酸序列的各個表達質粒，以及轉化的重組大腸桿菌(各個表達質粒的編碼DNA序列由序列號25~31示出)。在該實驗中，各種突變體表達質粒的胺基酸/編碼DNA序列、以及製備時使用的模板DNA質粒/突變導入引物的序列號的對應關係匯總於表1。
[0109]突變體表達質粒序列號對應表
[0110][表1]
【權利要求】
1.一種蛋白質，屬於中鏈脫氫酶/還原酶家族，並具有選自下述的(a)~(d)中的至少一種氣基酸殘基: Ca)與序列號I的Asp-201在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ala或Ser， (b)與序列號I的Lys-202在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Arg， (c)與序列號I的Lys-203在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Ser，以及， Cd)與序列號I的Ala-206在立體結構上同等位置的胺基酸殘基是Lys。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其由與序列號I所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同源性的胺基酸序列構成。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白質，其中，由在序列號I所示的胺基酸序列中導入有選自下述的(e)~(h)中的至少一種突變的胺基酸序列構成: Ce)將 Asp-201 置換為 Ala 或 Ser, (f)將Lys-202 置換為 Arg， (g)將Lys-203置換為Ser，以及， (h)將Ala-206 置換為 Lys。
4.根據權利要求1~3 中任一項所述的蛋白質，其由序列號2~8中任一項所述的胺基酸序列構成。
5.由編碼權利要求1~4中任一項所述的蛋白質的鹼基序列構成的DNA。
6.一種DNA，選自以下(A)、(B)以及(C): (A)由序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列構成的DNA， (B)與包含與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA在嚴格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA， (C)與序列號25~31中的任一個所述的鹼基序列具有85%以上的序列同源性、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質的鹼基序列構成的DNA。
7.—種載體,包含權利要求5或6所述的DNA。
8.一種轉化體，是用權利要求7所述的載體轉化宿主細胞而得到的。
9.權利要求8所述的轉化體的培養物。
10.一種氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，包括如下工序:用權利要求1~4中任一項所述的蛋白質，使還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸進行變換，得到氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
11.一種還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，包括如下工序:用權利要求1或2所述的蛋白質，使氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸進行變換，得到還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
12.—種還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，通過使還原酶作用於由權利要求10所述的方法得到的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進行。
13.一種氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的製造方法，通過使氧化酶作用於由權利要求11所述的方法得到的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進行。
14.根據權利要求10~13中任一項所述的製造方法，其特徵在於，利用權利要求8所述的轉化體或權利要求9所述的培養物。
15.通過權利要求10~14中任一項所述的製造方法製造的化合物。
【文檔編號】C12N1/21GK103717734SQ201280030627
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年6月27日 優先權日:2011年6月28日
【發明者】吉田慎一, 平良俊一, 西八條正克, 野尻增俊, 川野茂 申請人:株式會社鍾化