一種新型病原體識別分子的抗病毒作用的製作方法

2023-05-22 04:43:06

專利名稱：一種新型病原體識別分子的抗病毒作用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及富亮氨酸重複相互作用蛋白 Lrrfip 1 [leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 1]在病毒感染性疾病中的效應、作用機制、實施方法和用途。
背景技術：
病毒是由一種以核酸(核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA)為核心，以蛋白質為外殼(衣殼capsid)而組成的微小顆粒，其核酸可分為單股或雙股，線形或球形。病毒是最小的生物病原體，從20nm到300nm不等其中最大的是痘類病毒，例如痘苗病毒為 300nmX200nm，在普通光學顯微鏡下勉強可見；中等大小的病毒(如流行性感冒病)，直徑為80 IOOnm ；小型病毒(如流行性乙型腦炎病毒)，直徑為20nm，必須在電子顯微鏡下才能見到基礎病毒學，莽克強等著，化學工業出版社，2005年第一版；分子病毒學，黃文林等著，人民衛生出版社，2001年第一版。隨著病毒學和免疫學研究的進展，人們對病毒性疾病(Viral diseases)的認識也逐漸發展。最常用的病毒分類方式是根據核酸的性質(RNA或DNA)來對病毒進行分類，一般將病毒分為DNA病毒和RNA病毒。常見的致病性DNA病毒主要有人乳頭狀瘤病毒(HPV)、 B肝病毒(HBV)、EB病毒等，常見的致病性RNA病毒包括流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)、嚴重急性呼吸症候群(SARQ病毒以及流感病毒等基礎病毒學，莽克強等著，化學工業出版社，2005年第一版；分子病毒學，黃文林等著，人民衛生出版社，2001年第一版。病毒性疾病根據臨床表現及傳染方式，可以分為呼吸道病毒、蟲媒病毒、出疹性病毒、腸道病毒所致感染等。病毒性疾病往往引起比較嚴重的臨床表現，每每引起暴發流行。病毒感染後，除了短期內引起感染所引起的局部炎症外，長期的病毒感染可以導致腫瘤以及器官功能衰竭等嚴重的疾病，如HPV感染引起的宮頸癌、HBV感染引起的肝癌、肝硬化和肝功能衰竭、EB病毒引起的鼻咽癌、HIV引起的免疫功能缺陷和卡波濟氏肉瘤、SARS引起的呼吸功能衰竭以及流感病毒引起的呼吸功能障礙等基礎病毒學，莽克強等著，化學工業出版社，2005年第一版；分子病毒學，黃文林等著，人民衛生出版社，2001年第一版。我國是一個病毒性疾病高發的大國，如我國HBV感染患者估計有感染者1. 2億，是世界上最多的HBV大國；不能忘記的是2002年SARS在我國的大流行；另外，HIV以及可能的流感病毒爆發也時刻威脅著國民的身體健康。每一種流行性病毒感染都可以造成極大的人體健康和國民經濟的損失，然而至今對抗病毒尚無特效藥，臨床治療重點就在對症和保守治療，因此病毒性疾病的發病的分子和免疫學機理的研究和治療策略的研究具有重大的科學意義和顯示意義。幹擾素(interferon，IFN)是一組體內存在的、有廣泛生物活性的微量調節蛋白， 具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節活性，已被廣泛用於臨床。幹擾素是病毒感染後宿主細胞釋放的具有抗病毒特性的糖蛋白。根據其生物學、生物化學、基因特徵及細胞來源，可分為四種類型，S卩α、β、Y、ω型幹擾素，分別來源於白細胞(單核/巨噬細胞)、成纖維細胞、淋巴細胞(T-cell和滋養層細胞)。幹擾素具有抗病毒、抗增殖和免疫調節3種功能。其中α、β型IFN又稱為I型幹擾素，在病毒性疾病的治療中具有重要地位。幹擾素已經廣泛應用於病毒性疾病的治療，如帶狀皰疹、皰疹性口咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、愛滋病、尖銳溼疣、SARS等，可以抑制病毒的複製並調節病毒特異性免疫反應的產生，是目前已經得以證明並商業化應用於臨床病毒性治療的有效生物製劑。多種病毒及非病毒病原誘導I型幹擾素的產生，是機體天然免疫反應抗感染中的核心環節。宿主抗原識別受體(PRRs)能夠識別病原微生物固有元件介導I型幹擾素產生。 大多數的外源菌誘導I型幹擾素是通過胞膜關聯的toll樣受體途徑。例如，革蘭氏陰性菌脂多糖(LPQ能被Toll樣受體4識別，從而募集接頭蛋白TRIF活化下遊激酶TBKl和 IKK ε，然後活化轉錄因子NF-K B和IRF3觸發I型幹擾素基因轉錄。病原雙鏈RNA是在天然免疫反應中誘導I型幹擾素產生中一類潛在的活化物。 哺乳動物細胞中許多病原識別受體途徑的活化產生於識別病源雙鏈RNA。Toll樣受體 3 (TLR3)是第一個識別病毒雙鏈RNA的病原識別受體。TLR3識別雙鏈RNA並介導I型幹擾素產生是通過TRIF依賴的信號途徑。胞內核酸識別體含RNA螺旋酶蛋白RIG-I (視黃酸誘導基因I)和Mda5(黑色素瘤分化相關基因幻是胞內識別雙鏈RNA的主要病原識別受體。 RIG-I和Mda5激活I型幹擾素基因表達通過MAVS (IPS-1/Cardif/VISA)依賴的信號途徑， 活化IRF3和NF- κ B介導I型幹擾素表達。除了識別含5-三磷酸組分的單鏈RNA(ssRNA) 外，RIG-I還能識別水泡性口炎病毒(VSV)等病毒來源的短片端雙鏈RNA。與此不同的是， Mda5識別腦心肌炎病毒(EMCV)等來源的長片端雙鏈RNA。是否還有一些未知的病原識別受體參與了胞內雙鏈RNA的識別仍有待於進一步研究。能否誘導I型幹擾素的產生以及能否抑制病毒的複製和擴增是檢驗藥物治療病毒性疾病的非常有效的標準。富亮氨酸重複相互作用蛋白Lrrfipl (匪008515)最初鑑定為是一種能與哺乳動物細胞中果蠅Fli-I同源基因相互作用的蛋白。作為凝溶膠蛋白(gelsolin)家族成員， Lrrfipl在果蠅胚胎發育和肌肉形成過程中肌動蛋白的協調起重要作用。Lrrfipl主要分布於胞漿，能夠直接結合雙鏈RNA和富含GC雙鏈DNA。雖然已有的研究揭示了 Lrrfipl在調節細胞生長、分化發育等方面的作用，但是對於其免疫功能尤其是在病毒感染抵抗中的作用研究尚未見報導。綜上所述，本領域迫切需要開發出一種可有效抵抗病毒感染、抑制炎性因子產生的免疫學活性物質。

發明內容
本發明的主要目的正是提供了 Lrrfipl蛋白或其編碼序列在有效抵抗病毒感染、 抑制病毒複製、促進I型幹擾素產生中的新用途。在本發明的第一方面中，提供了 Lrrfipl蛋白及其編碼序列在製備用於預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀的藥物中的用途。在本發明的一個實施方式中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、B肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒或流感病毒。在另一優選例中，所述病毒感染發生在選自下組的器官肝臟、脾臟、腦、腎臟或皮膚。在本發明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白選自(a) SEQ ID NO 2 的胺基酸序列；(b)與SEQ ID NO :2胺基酸序列同源，且具有抑制病毒感染相關疾病和/或徵狀的活性的多肽；以及(c) (a)或(b)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的、 且具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質或多肽。在一個優選例中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列來自選自下組的對象人、大鼠、小鼠、犬、兔或牛。在一個優選例中，Lrrfipl蛋白是天然純化的蛋白、化學合成的產物、或使用重組技術從原核或真核宿主中產生，優選為人或小鼠Lrrfipl。在一個優選例中，所述宿主選自細菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細胞。在本發明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀的分子；或(iii)與⑴或(ii)中的互補的分子。在本發明的另一個實施方式中，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂質體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法、複製缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質。在本發明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列通過誘導I型幹擾素的產生來預防和/或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀。在另一個優選例中，所述I型幹擾素選自IFN-α和IFN-β，優選為IFN-β。在本發明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。在一個優選例中，在給予本發明的藥物組合物之前、同時或之後，給予具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的其它活性物質。所述具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的其它活性物質選自臨床常用抗病毒藥物，優選為選自下組的一種或多種抗甲型流感病毒表面Μ2受體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發明的一個實施方式中，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列佔藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%o在一個優選例中，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列佔藥物組合物總重量的1 95wt%，優選為5 90wt%，更優選10 80wt%。
在本發明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列；(B)預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的其它活性物質；以及(C)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。在一個優選例中，所述具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的其它活性物質選自臨床常用抗病毒藥物，優選為選自下組的一種或多種包括抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗 HIV逆轉錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發明的第四方面中，提供了一種預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀的方法，所述方法包括給予需要預防或治療的對象有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列。在一個優選例中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、B肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒或流感病毒。在另一優選例中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列誘導I型幹擾素的產生，從而預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀。在另一個優選例中，所述I型幹擾素選自IFN- α和IFN- β，優選為IFN- β。在另一優選例中，所述病毒感染發生在選自下組的器官中皮膚、肝臟、腎臟、腦、 肺或脾臟。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1 :Lrrfipl增強水泡性口炎病毒(VSV)誘導的巨噬細胞IFN-β產生。圖2 =Lrrfipl增強雙鏈RNA(dsRNA)誘導巨噬細胞IFN-β產生。圖3 :Lrrfipl介導VSV誘導的β-連環蛋白(β-catenin)活化。圖4 β-連環蛋白促進VSV誘導的巨噬細胞IFN-β產生，延長VSV感染小鼠的生存期。實施方式本發明人通過大量的研究和動物模型試驗，發現Lrrfipl在病毒感染性疾病中， 具有促進I型幹擾素的產生、抑制病毒的複製以及病毒在體內複製導致的器官功能損傷的功能。在此，基礎上本發明人完成了本發明。具體而言，針對IFN調節相關基因進行應用研究是病毒分子生物學和細胞生物學研究的熱點，將IFN促進基因的核苷酸和蛋白質應用於病毒性疾病的預防和治療是人工幹預病毒性感染的有效技術，因此無論是在功能基因組研究，還是病毒相關地基因治療方面均具有廣闊地應用前景。本發明針對具有抗病毒作用的新型抗病毒分子Lrrfipl，對免疫細胞中巨噬細胞在微生物成分作用下的幹擾素的產生進行了研究。實驗顯示1)幹擾Lrrfipl可以抑制VSV 病毒誘導巨噬細胞IFN-β的產生；2)幹擾Lrrfipl可以抑制病毒核酸模擬物dsRNA誘導巨噬細胞IFN-β的產生；3)幹擾Lrrfipl可抑制VSV誘導的β-連環蛋白活化，而β-連環蛋白缺陷可抑制VSV誘導的巨噬細胞IFN-β產生，縮短VSV感染小鼠的生存期。通過上述試驗，本發明人證明了 Lrrfipl可促進病毒感染後I型幹擾素的產生，從而延長病毒感染個體的生存期或治療病毒感染相關的疾病。本發明針對Lrrfipl基因的不同的核苷酸和蛋白質產物，用以促進I型IFN的表達，延長病毒感染後實驗動物生存期。這些發明證實Lrrfipl的相關產物可望成為治療和預防病毒性疾病的有效手段。Lrrfipl 蛋白(多肽)如本文所用，術語「 Lrrf ip 1蛋白(多肽)」、「 Lrrfipl 」、可互換使用，是指SEQ ID NO 1的序列所編碼的蛋白質或這些蛋白質具有抗病毒作用的變異或修飾形式。例如，所述 Lrrfipl蛋白可選自(a) SEQ ID NO 2的胺基酸序列；或(b)與(a)限定的胺基酸序列同源，並具有抑制病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的蛋白本發明的蛋白質或多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發明中Lrrfipl蛋白或多肽優選由人Lrrfipl基因或其同源基因或家族基因編碼。本發明蛋白質或多肽的變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質或多肽的功能，例如本發明的Lrrfipl 蛋白或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有抑制炎性因子的活性。可採用輻射或暴露於誘變劑下來產生隨機誘變，也可通過定點誘變法或其它已知的分子生物學技術來獲得上述(b)中的蛋白質或多肽。可利用編碼所述蛋白質或多肽的編碼序列來構建轉基因動物，並觀察該轉基因動物對炎症的抗性是否有所改良來篩選和鑑別所得蛋白質或多肽。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的蛋白質或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。該術語還包括Lrrfipl蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與Lrrfipl蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、 以及利用抗Lrrfipl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還可使用其它多肽，如包含Lrrfipl蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 Lrrfil蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有Lrrfipl蛋白序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。Lrrfipl蛋白編碼基因如本文所用，術語「Lrrfipl基因」或「Lrrfipl蛋白編碼序列」可互換使用，均是指一種編碼本發明所述的Lrrfipl蛋白或多肽的序列，其可為SEQ ID N0:1的序列、在嚴格條件下與SEQ ID NO :1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達對IFN-β的產生和影響具有一定的抑制作用。本發明的Lrrfipl基因可選自(i)SEQ ID NO 1的序列；或(ii)在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，術語「嚴格條件」是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲醯胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補序列。本發明的Lrrfipl基因核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR 擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。應理解，本發明的Lrrfipl基因優選獲自人，獲自其它動物的與人Lrrfipl基因高度同源(如具有50%以上，優選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80% 以上，更優選85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本發明優選考慮的等同範圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，如BLAST。載體、宿主及轉基因動物本發明還涉及包含Lrrfipl基因的載體，以及用該載體經基因工程產生的宿主細胞，以及通過轉基因獲得高表達Lrrfipl的轉基因動物。通過常規的重組DNA技術(kience，1984 ；224 1431)，可利用本發明的編碼序列可用來表達或生產重組的Lrrfipl蛋白。一般來說有以下步驟(1)用本發明的編碼Lrrfipl蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養的宿主細胞；和(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質或多肽。本發明中，術語「載體」與「重組表達載體」可互換使用，指本領域熟知的細菌質粒、 噬菌體、酵母質粒、動物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含Lrrfipl編碼序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質或多肽。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；動物細胞等。在本發明中，優選採用大腸桿菌細菌細胞、小鼠巨噬細胞作為宿主細胞。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。本發明中術語「轉基因動物」、或「轉化動物」可互換使用，均指通過常規轉基因的方法獲得的轉入本發明Lrrfipl基因並穩定高表達Lrrfipl蛋白或多肽的細胞、器官、組織或個體。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
I=I O藥物組合物或疫苗本發明還提供了一種藥物組合物或疫苗，所述的組合物或疫苗含有有效量的本發明的Lrrfipl蛋白或其編碼序列，以及藥學上或免疫學上可接受的載體。病毒感染可由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、B肝病毒、EB 病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒、流感病毒。如本文所用，術語「含有」或「包括」包括了「包含」、「基本上由……構成」、和 「由……構成」。如本文所用，術語「藥學上/免疫學上可接受的」成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，術語「有效量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。如本文所用，術語「藥學上/免疫學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體， 包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分， 且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》(Remington，s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤溼劑或乳化劑、矯味劑、PH緩衝物質等。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發明的組合物中Lrrfipl蛋白或其編碼序列有效成分佔組合物總重量的 0. 001 99. 9wt% ；優選為組合物總重量的1 95wt%，較優選為5 90wt%，更優選10 80wt%。餘量為藥學上可接受的載體以及其它添加劑等物質。如本文所用，術語「單位劑型」是指為了服用方便，將本發明的組合物製備成單次服用所需的劑型，包括但不限於各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發明的另一優選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中 Lrrfipl蛋白或其編碼序列的含量為0. 01 2000mg/劑，優選0. 1 1500mg/劑，更優選 1 IOOOmg/劑。在本發明的另一個優選例中，每天施用1 6劑本發明的組合物，優選施用1 3劑；最優選的，每天服用的劑量為1齊U。應理解，所用Lrrfipl蛋白或其編碼序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴重程度而變化。具體情況根據對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達到的效果)來決定，這在熟練醫師可以判斷的範圍內。本發明的組合物，可以為固態(如顆粒劑、片劑、凍乾粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(如口服液)或其它合適的形狀。可採用(包括但不限於)如下的給藥途徑來給予本發明的活性物質或組合物(1)直接裸DNA或者蛋白質注射法；(2)將Lrrfipl的cDNA、mRNA和蛋白質與轉鐵蛋白/多聚L-賴氨酸複合物連接， 以增強其生物效應；(3)cDNA、mRNA和蛋白質與帶正電荷的脂類形成複合物，以克服磷酸骨架負電荷所致的穿越細胞膜的困難；(4)用脂質體包裹cDNA、mRNA和蛋白質後介導進入細胞，既有利於大分子的順利進入又免受細胞外各種酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白質與膽固醇結合使其胞漿保持時間增加10倍；(6)用免疫脂質體轉運cDNA、mRNA和蛋白質可使其特異性轉運至靶組織和靶細胞；(7)將cDNA、mRNA和蛋白質體外轉染給轉載細胞(如成纖維細胞)也可較好地將 Lrrfipl相關藥物載入靶細胞內；或(8)電打孔(electroporation)，即藉助於電流將cDNA、mRNA和蛋白質導入靶細胞。此外，本發明的組合物中還可含有用於改善和治療病毒感染性疾病的其它活性物質，所述的其它活性物質選自下組臨床常用抗病毒藥物(包括抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一種或多種。本發明的Lrrfipl相關的核苷酸和蛋白質藥物相互間可以聯合應用，還可以與其它藥物和治療手段聯合，用於病毒感染性疾病的預防和治療。本發明的優點1.本發明揭示了 Lrrfipl及其編碼序列的新功能，即有效促進病毒感染後I型 IFN的產生，並延長個體生存期；2.本發明提供了一種可有效促進病毒感染後I型IFN的產生，並延長個體生存期的新型抗病毒感染性疾病藥物。
實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1 :Lrrfipl增強水泡性口炎病毒(VSV)誘導的巨噬細胞IFN-β產生小鼠(C57品系，雌性，4-6周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買)腹腔注射肉湯(購自Sigma) Iml/只，三天後，以PBS衝洗腹腔獲得原代腹腔巨噬細胞。以30nM LrrfiplsiRNA或對照siRNA(由上海吉凱公司合成)轉染所獲得的小鼠原代腹腔巨噬細胞(細胞密度為2X IO6個/孔)，轉染試劑為INTERFERin試劑(購自法國 Polyplus公司，按廠商說明書操作)。轉染後48小時，以VSV(購自中國典型培養物保藏中心CCTCC，MOI為10)感染細胞18小時。用ELISA法檢測細胞培養上清中的IFN-β含量(所用試劑盒購自R&D公司)。LrrfiplsiRNA 5' -GGACCAGATTCAGGATGTAdTdT-3『，SEQ ID NO. 3對照siRNA :5' -TTCTCCGAACGTGTCACGTdTdT-3『，SEQ ID NO. 4IFN-β的ELISA分析的結果如圖1所示。結果顯示，siRNA介導的Lrrfipl缺失能夠抑制腹腔巨噬細胞中VSV誘導的IFN-β的表達(**，P < 0. 01)。該結果表明，Lrrfipl可增強VSV誘導的巨噬細胞IFN-β產生。實施例2 =Lrrfipl增強雙鏈RNA(dsRNA)誘導巨噬細胞IFN-β產生在7巨噬細胞系(購自ATCC)中，轉染雙鏈病毒核酸模擬物(雙鏈 RNA, dsRNA)能顯著誘導幹擾素-PmRNA的表達。小鼠巨噬細胞系7細胞以 LrrfiplsiRNA轉染(如實施例1所述)。轉染後M 小時，以 5. Ομ g/ml poly (I C) (dsRNA，購自 Amersham 公司)處理 4 小時，實時定量PCR檢測細胞內IFN- β mRNA表達水平(所用試劑盒購自日本Τ0Υ0Β0公司)。 IFN-β 引物參照文獻An，H.等，Nat Immunol. 2008 ;9 :542-550。PCR 參數為94°C， 30Sec ；58°C,30Sec ；72°C,30Sec ；共30循環。以對照siRNA(如實施例1所述)轉染細胞中IFN- β mRNA表達水平作為1。IFN-β mRNA表達水平的實時定量PCR檢測結果如圖2所示。結果顯示，siRNA介導的Lrrfipl缺失能抑制dsRNA誘導的IFN-β mRNA的表達(**，P < 0. 01)。結果表明， Lrrfipl的存在可促進雙鏈病毒核酸模擬物誘導的IFN-β的表達。實施例3 =Lrrfipl介導VSV誘導的β -連環蛋白活化連環蛋白是一種參與多種基因轉錄共活化的多功能蛋白。為了研究連環蛋白是否作為Lrrfipl介導IFN-β表達的下遊途徑，以LrrfiplsiRNA轉染小鼠原代腹腔巨噬細胞(如實施例1所述)。轉染後48小時，以VSV感染細胞(Μ0Ι為50)。採用Western印跡法檢測細胞內 β-連環蛋白磷酸化活化水平，並以總β-連環蛋白含量作為上樣對照。所用Western印跡化學發光檢測試劑盒購自Pierce公司；所用β -連環蛋白抗體購自Santa Cruz公司；所用磷酸化β-連環蛋白(Ser552)抗體購自Cell SignalingTechnology公司。磷酸化β-連環蛋白的Wfestern印跡分析結果如圖3所示，結果顯示Lrrfipl缺失抑制VSV感染引起的β -連環蛋白第552位絲氨酸的磷酸化。因此，結果表明Lrrfipl促進VSV誘導的IFN-β的產生可能是通過促進β -連環蛋白活化來完成的。實施例4 β-連環蛋白促進VSV誘導的巨噬細胞IFN-β產生，延長VSV感染小鼠的生存期β_連環蛋白基因缺陷小鼠的製備將表達IFN誘導性Mx啟動子調控的Cre重組酶的轉基因小鼠(Mx_Cre，購自美國 Jackson實驗室)與含有IoxP側翼序列β-連環蛋白基因的小鼠(β _連環蛋白lMp/1°xp，購自美國Jackson實驗室)雜交得到Mx-Cre χ β-連環蛋白1μρΛ°χρ小鼠。將250 yg poly(I: C)(購自Amersham公司)腹腔內注射到β-連環蛋白loxp/loxp 和Mx-Cre χ β _連環蛋白lrap/1°xp小鼠中，每2天一次，共5次，以誘導β -連環蛋白缺陷 [Cobas, Μ.等，J Exp Med. 2004 ； 199 221-229]0末次注射後4天，小鼠腹腔注射巰基乙酸鹽(thioglycolate)提取腹腔巨噬細胞，或用VSV感染(Μ0Ι為10)。PCR檢測確認Mx-Cre χ β -連環蛋白1μρΛ°χρ小鼠基因組中β -連環蛋白基因缺失 [Cobas,Μ.等，J Exp Med. 2004 ； 199 :221_229。因此將poly(I:C)處理的Mx-Cre χ β-連環蛋白1ΜΡ/1°ΧΡ小鼠命名為β-連環蛋白K°。poly (I: C)處理的β-連環蛋白1μρΛ°χρ小鼠則作為連環蛋白基因正常表達的對照小鼠。小鼠VSV感染後血清IFN-β含量的測定小鼠的VSV感染方法參照文獻Wang，C.等，Nat Immunol. 2009 ；10 :744_752。最後一次poly(I:C)處理後4天，β-連環蛋白^或β-連環蛋白1—小鼠靜脈內注射VSV 或紫外線滅活的VSV(VSV-UV) (lxl06PFU/g)。感染後6小時，ELISA檢測血清中的IFN-β含量(所用試劑盒購自R&D公司)。小鼠VSV感染後生存期的測定最後一次poly (I: C)處理後4天，β -連環蛋白κ°或β -連環蛋白lrapA°xp小鼠(每組10隻小鼠)靜脈內注射VSV(lxl07PFU/g)。感染後檢測小鼠的生存期。血清IFN-β含量的ELISA檢測結果如圖4A所示。結果顯示β -連環蛋白敲除的腹腔巨噬細胞中VSV誘導的IFN-β產生均顯著減少。這些結果表明β-連環蛋白調控了巨噬細胞中I型幹擾素的表達。小鼠VSV感染後生存期的測定結果如圖4Β所示。結果顯示，與對照組在VSV注射M小時後80%生存率相比，β-連環蛋白缺陷小鼠的生存率僅20%。這些結果表明中 β-連環蛋白信號途徑可促進天然抗病毒免疫反應。結合實施例3中Lrrfipl可促進β -連環蛋白活化的結論，Lrrfipl可通過β -連環蛋白信號途徑促進天然抗病毒免疫反應，從而達到抗病毒的目的。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.富亮氨酸重複相互作用蛋白Lrrfipl及其編碼序列在製備用於預防和/或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀的藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、B肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人 獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒或流感病毒。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述Lrrfipl蛋白選自(a)SEQ ID NO: 2的胺基酸序列；(b)與SEQID NO :2胺基酸序列同源，且具有抑制病毒感染相關疾病和/或徵狀的活性的多肽；以及(c)(a)或(b)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的、且具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質或多肽。
4.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述Lrrfipl蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；( )在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交、且具有預防或治療病毒感染相關疾病和/ 或徵狀的分子；或(iii)與⑴或( )中的互補的分子。
5.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述富亮氨酸重複相互作用蛋白Lrrfipl及其編碼序列來自選自下組的對象人、小鼠、大鼠、犬、兔或牛。
6.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂質體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法、 複製缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質。
7.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述預防和/或治療病毒感染相關疾病和/ 或徵狀是通過促進I型幹擾素的產生實現的。
8.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白和/或其編碼序列；以及(B)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列佔藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%。
10.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白和/或其編碼序列；(B)預防或治療病毒感染相關疾病和/或徵狀活性的其它活性物質；以及(C)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發明提供了一種新型病原體識別分子的抗病毒作用。具體而言，本發明涉及一種新型病原體識別分子Lrrfip1(富亮氨酸重複相互作用蛋白)的抗病毒作用、實施方法及用途。本發明提供這種分子在抗病毒感染過程中的應用方法及相應的免疫學原理，公開了這種分子在抗病毒感染中的用途和策略，特別是應用於病毒感染導致的相關疾病的預防和治療。Lrrfip1分子可以促進I型幹擾素的產生，並且延長病毒感染後個體生存期，從而用於抗病毒治療。
文檔編號A61P31/14GK102247605SQ201010177059
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者安華章, 曹雪濤, 李楠, 楊鵬遠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學