四翅濱藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其應用的製作方法

2023-05-21 22:19:36 1

四翅濱藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其應用的製作方法
【專利摘要】四翅濱藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其應用屬植物基因工程【技術領域】，一種植物抗逆相關蛋白AcCysP1由序列表中SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；所述植物抗逆性相關蛋白AcCysP1的編碼基因AcCysP1的編碼序列為下列之一:1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5』端第190-1122位脫氧核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質序列的核苷酸分子；一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關蛋白AcCysP1的編碼基因AcCysP1；一種重組菌，含有植物抗逆性相關蛋白AcCysP1的編碼基因AcCysP1；在本源植物四翅濱藜中通過qRT-PCR檢測，該基因在NaCl和PEG脅迫下上調表達。同時，將AcCysP1導入釀酒酵母得到轉基因釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，進行脅迫處理，結果亦可表明AcCysP1可以提升酵母耐乾旱(山梨醇)和耐鹽(NaCl)的能力。
【專利說明】四翅濱藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其應用

【技術領域】
[0001 ] 本發明屬植物基因工程【技術領域】，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表達與植物抗逆（具體為鹽和乾旱）相關的蛋白AcCysPl,同時採 用實時螢光定量PCR (實時PCR，Real-Time-PCR，）的方法來研究該基因對非生物脅迫NaCl 和PEG的功能。

【背景技術】
[0002] 目前農業生產中逆境脅迫是影響糧食產量最重要的因素和挑戰之一。農作物在 整個生長季節中，會受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲害等及非生物脅迫的鹽、 鹼、高溫、低溫、乾旱等，這些脅迫限制了植物的生長發育，最終會導致作物產量降低，品質 下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴重影響作物生產的逆境因子中，極端溫度、 乾旱、高鹽、營養失調（包括礦物質中毒和礦物質缺乏）是影響作物產量的主要限制因子， 每年直接從鹽、鹼、乾旱、低溫脅迫等逆境造成的農作物減產仍然超過總產量的20%，而幹 旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關的基因並將其導入作物進 行分子育種引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過基因工程的方法進行逆境相關基因的克 隆及其功能的解析能夠為植物抗逆育種提供有價值的信息和材料。然而，從直接解決農業 生產中關鍵問題的角度來看，在農業生產上能起顯著作用的轉基因作物種類還不多，人類 對植物逆境適應性分子機理的研究還遠遠不夠，遠不能滿足植物分子育種的需求，同世界 發達國家相比，我國擁有自主智慧財產權和具有重要利用價值的基因相對較少。同時，目前的 研究也主要集中在草本植物，而對木本植物及其耐鹽和乾旱的分子遺傳研究也相對較少。 然而，草本和木本植物在結構、生長、發育、生理、及在應對生物和非生物脅迫等方面存在較 大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關的基因並進行研究，能夠為通過基因工程提 高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。
[0003] 四翅濱藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類上為藜科， 濱藜屬，普遍存在於乾旱、半乾旱地區，具有較強的耐乾旱、抗鹽鹼、耐寒冷和耐重金屬的特 性，尤其是耐乾旱和鹽特性。四翅濱藜在每年降雨量> 180_的乾旱半乾旱地區，年平均氣 溫僅為5°C左右的低溫地區，甚至在極端低溫為-40°C地區以及鹽鹼地等惡劣環境下依然 生長良好，同時在海拔2000米左右的地區也適合生長，根據已有報導，四翅濱藜被有些國 家稱為"生物脫鹽器"，它一年時間就可以從6. 07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽分，灌木 生物量也能達到15t/hm2,枝葉中的粗蛋白含量在12%以上，高產優質、富含營養，相關科學 家們認為，四翅濱藜有及其豐富的營養價值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、半荒漠幹 旱地區非常有價值的優良飼料灌木樹種。同時，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因此在美國 也廣泛用於水土保持和路坡固定，但牧場改良仍然是其主要用途。近年來，四翅濱藜先後在 中國的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過大量研究，充分體現了四翅濱藜較強的 抗鹽，鹼，乾旱，低溫，貧瘠等優良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優良樹種。
[0004] 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系統，是二倍體，它在 蛋白翻譯後加工過程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白摺疊等特徵，使得其基因表達 模式更加接近於真核植物中的表達模式，它還具有生長快速、遺傳操作簡便和易於培養等 的優點，所以在對植物功能基因的相關研究中，用酵母表達系統篩選具有原核表達系統不 可替代的優勢性。釀酒酵母菌株INVScl (基因型為MATa his3Dlleu2trpl-289ura3-52)是 經過人工改造後的尿嘧啶營養缺陷型菌株，該菌株的酵母轉化子運用SC-U缺培養基篩選 時，假陽性低，轉化效率高，因此是理想的酵母表達菌株。利用酵母營養缺陷型菌株對植物 cDNA文庫的研究和挖掘，在植物中受到越來越多關注。Frommer等和Hsu等（1993年）在篩 選擬南芥cDNA文庫中克隆到胺基酸透過酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補酵母的氨基 酸轉運缺陷突變體；酵母系統研究植物耐鹽性表達基因的功能研究也被廣泛應用，Yamada 等（2002年）就利用酵母轉化子來驗證丙二烯環化氧化酶（AOC)基因可以大大提高抗鹽 性，進一步推測到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等（2007年）利用酵母 研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測SALI3-2 基因所具有的抗逆能力。由此可見，利用酵母表達外源蛋白並研究其功能已經受到廣泛應 用。
[0005] Real-Time PCR(RT-PCR)是一種目前應用普遍的檢測基因表達的技術，它通過 添加螢光基團，並利用螢光信號累積來實時監測整個PCR的進程，最後通過標準曲線對未 知模板進行定量分析，該方法能夠避免傳統PCR定量終產物時產生的偏差，從而使實驗的 重複性得到提高，該技術現已被廣泛用於監測細胞mRNA的表達量變化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，該法靈敏度高，通用性好，方法簡單等優點而被國內外科 研中普遍使用。
[0006] 半胱氨酸蛋白酶（Cysteine proteases)是一類廣泛分布於動物、植物、微生物等 有機體內的蛋白水解酶。該類蛋白酶的分子量約為20, 000?30, 000,最佳pH範圍為4? 6. 5,親核的半胱氨酸殘基分布於催化活性部位。植物半胱氨酸蛋白酶是對植物正常生長非 常重要的一大類植物蛋白水解酶，其對蛋白加工有雙重功能，在種子成熟時，半胱氨酸蛋白 酶通過水解加工初級多肽幫助貯藏器官（如液泡、胚乳）完成蛋白沉積，而在種子萌發及 幼苗生長過程中，該蛋白酶又動員降解貯藏蛋白從而為種子萌發和幼苗生長提供胺基酸。 同時，植物半胱氨酸蛋白酶直接參與種子的萌發、組織器官的分化、植株生長發育、植物抗 逆應答、細胞程序化死亡（P⑶）及植物衰老等生理過程，所以也是目前研究較為深入的一 大類植物水解蛋白。在植物中，該家族蛋白分為：木瓜蛋白酶Cl亞族（papain Cl),大部分 植物半胱氨酸蛋白酶屬於這個亞族；鈣依賴半胱氨酸蛋白酶C2亞家族（calpain C2);豆類 天冬氨酸蛋白內切酶C13亞家族（legumain C13);天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶C14 亞家族（caspase C14);泛素類半胱氨酸蛋白酶C12和蛋白酶體C19是最近發現的催化蛋 白去泛素化的植物半胱氨酸蛋白酶。在非生物逆境脅迫（乾旱、高鹽、低溫等）和生物脅迫 (病原菌侵染）下，植物半胱氨酸蛋白酶mRNA水平更顯著升高，一般認為植物半胱氨酸蛋白 酶會降解逆境條件下受損或變性的蛋白，並為新蛋白的合成提供肽段或游離的胺基酸。受 到生物脅迫後，植物與病原物互作的過程中該類蛋白酶會誘導植物細胞程序化死亡從而避 免入侵病原菌的蔓延進而增強植物自身對生物脅迫的耐受力。然而在目前的眾多研究中， 還無有關四翅濱藜AcCysPl基因在抗逆等生理功能方面的研究報導。


【發明內容】

[0007] 本發明通過構建四翅濱藜（Atriplex canescens)的低溫（-10 °C )及鹽脅迫 (400mM NaCl)全長cDNA文庫，並利用Gateway技術將cDNA文庫LR重組到酵母表達載 體（PYES-DEST52)中，混合質粒載體經轉化到酵母菌株INVScl中，並通過模擬逆境脅迫 (NaCl、山梨醇）篩選出與逆境脅迫相關的基因，同時利用RT-PCR技術檢測該基因在逆境 脅迫（NaCl，PEG6000)條件下的表達量變化，以初步研究該基因在四翅濱藜中逆境脅迫 的相應作用。本發明不僅對四翅濱藜的耐乾旱和耐鹽分子機制的研究提供新的依據，同 時為獲得具有抗逆能力的轉基因農作物和林木（耐鹽、乾旱）奠定基礎。本發明中，轉 pYES-AcCysPl的重組酵母轉化子表現出了明顯的抗乾旱和抗鹽脅迫的能力。同時在本源植 物四翅濱藜中，AcCysPl基因的表達也對鹽脅迫和旱脅迫表現出了明顯的響應。
[0008] 本發明提供了四翅濱藜中一種含半胱氨酸蛋白酶功能域的與植物抗逆（鹽和旱） 相關的蛋白及其編碼基因序列，通過利用酵母系統進行功能驗證，並在本源植物中通過 RT-PCR檢測的方法對該基因進行進一步解析及其在植物抗逆中的應用：
[0009] 本發明提供的半胱氨酸蛋白酶基因，名稱為AcCysPl,為序列表中SEQ ID NO :1所 示的核苷酸序列。通過四翅濱藜全長cDNA文庫測序得到AcCysPl基因。該基因共由1454 個鹼基組成，完整的開放閱讀框含有930bp，同時還含有5'非翻譯區和3'非翻譯區序列，開 放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。
[0010] 本發明所提供的蛋白耐乾旱和鹽脅迫，名稱為AcCysPl,來源於鹽生灌木四翅濱 藜，植物抗逆相關蛋白AcCysPl由序列表中SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列組成的蛋白質。
[0011] 所述植物抗逆性相關蛋白AcCysPl的編碼基因 AcCysPl的編碼序列為下列之一：
[0012] 1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第190-1122位脫氧核 苷酸；
[0013] 2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質序列的核苷酸分子。
[0014] 一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關蛋白AcCysPl的編碼基因 AcCysPl。
[0015] 一種重組菌，含有植物抗逆性相關蛋白AcCysPl的編碼基因 AcCysPl。
[0016] 序列表中的序列2根據DNAMN分析，蛋白由310個胺基酸組成，等電點7. 09,蛋白 總量34KDa。一般情況下，蛋白二級結構含190個捲曲，40個螺旋，81個摺疊，有10個抗原 肽段。蛋白含127個親水胺基酸，184個疏水胺基酸，具有弱親水性，根據Expasy protscale 的Hphob. /Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面區域在N端。PSORT Prediction預測 蛋白最可能定位到細胞質和線粒體基質中。
[0017] 本發明涉及的酵母表達載體pYES-DEST52(購自Invitrogen公司）與AcCysPl 基因重組為pYES-AcCysPl，且該重組酵母表達載體轉化的宿主感受態細胞為釀酒酵母 INVScl。該酵母表達載體除了含有AcCysPl的編碼DNA序列外，還攜帶有GALl啟動子、T7 啟動子、URA3基因、氨苄青黴素抗性標記基因、CYCl終止轉錄信號、LR重組位點attRl和 attR2、用於逆向篩選的致死基因 ccdB，蛋白純化的6xHis Tag,蛋白表達檢測的V5epitope 等外源基因蛋白在酵母中高效表達所需的各種調控元件。
[0018] 本發明通過RT-PCR方法檢測了該基因在對於乾旱和鹽脅迫的響應（PEG，NaCl處 理），基因在兩種脅迫處理下表現出了基因上調，進一步推測該基因在植物參與逆境響應尤 其是乾旱和鹽脅迫中起重要作用，該基因的上調表達有助於提高四翅濱藜的抗乾旱和抗鹽 的能力。
[0019] 本發明在通過酵母（NaCl，山梨醇）及RT-PCR(NaCl，PEG)關於乾旱和鹽的研究 後，AcCysPl基因在逆境方面的應用：該基因過量表達可能提高植物的抗逆性，所述植物抗 逆性具體可為對非生物脅迫和生物脅迫的抗逆性，非生物脅迫如乾旱、極端溫度、鹽鹼等， 特別是植物的抗乾旱和鹽脅迫的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為四翅濱藜總RNA提取圖片
[0021] 圖 2 為 IKb Plus DNA Ladder
[0022] 圖3為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0023] 圖4為為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0024] 圖 5 為 IKb Plus DNA Ladder
[0025] 圖6為pYES-AcCysPl重組質粒PCR擴增凝膠電泳圖
[0026] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :擴增 片段
[0027] 圖7為AcCysPl在NCBI中功能域比對分析結果
[0028] 圖8為AcCysPl與其它物種的同源蛋白系統進化分析
[0029] 圖9為pYES-AcCysPl陽性重組酵母轉化子PCR凝膠電泳圖
[0030] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :陽性 酵母轉化子PCR電泳鑑定
[0031] 圖10為重組酵母pYES-AcCysPl和pYES-DEST52非脅迫下的結果
[0032] 圖11為重組酵母pYES-AcCysPl和pYES-DEST52在3M山梨醇脅迫下的結果
[0033] 圖12為重組酵母pYES-AcCysPl和pYES-DEST52在2MNaCl脅迫下的結果
[0034] 圖10-12中：pYES-AcCysPl酵母轉化在對2MNaCl和3M山梨醇的抗逆能力明顯 強於空載體PYES-DEST52酵母轉化子。
[0035] 圖13為AcCysPl基因在400mM NaCl脅迫處理後的表達量變化圖
[0036] 圖14為為AcCysPl基因在20% PEG6000脅迫處理後的表達量變化圖
[0037] 圖13和14中：AcCysPl基因在NaCl處理6h後開始上調表達；同時，在PEG處理 6h後該基因開始上調表達。

【具體實施方式】
[0038] 實施例一：AcCysPl基因全長cDNA的獲得及序列分析
[0039] 1.脅迫處理四翅濱藜：
[0040] -KTC條件下生長三個月的四翅濱藜植株移栽到人工氣候培養箱，正常培養10天 後，待植株復甦存活，發出新葉，生長健壯。將植株轉移到含有營養的水培條件下，正常生長 兩天後，用500mL的含NaC1400mM的鹽液水培處理四翅濱藜植株，脅迫處理4天後，採摘葉 片，嫩莖部和幼根清洗乾淨並液氮速凍，_80°C凍存，以備建庫。
[0041] 2.構建 cDNA 文庫：
[0042] 將NaCl處理4天後的四翅濱藜樣品（葉片、嫩莖和幼根）提取總RNA (圖1、圖2)， 然後使用Invitrogen公司的'cap antibody module'將含有完整帽子結構的單鏈cDNA進 行富集，並按照Superscript? Full-Length cDNA Library Construction Kit 試劑盒構建 全長cDNA文庫，並通過Gateway技術將該cDNA文庫LR重組到酵母表達載體pYES-DEST52 中，隨機對cDNA文庫進行PCR檢測（圖3、圖4、圖5)，將長度500bp以上的片段進行測序， 利用NCBI的BlastX進行功能域的比對及相關生物信息學分析，獲得了四翅濱藜鹽脅迫的 表達序列標籤（ESTs)。
[0043] 2. 1四翅濱藜總RNA提取的方法：
[0044] 2. I. 1取IOOmg植物樣品，在預冷的研缽中用液氮迅速研成粉末，快速轉移到遇冷 的2mL離心管中。（保證全過程在通風廚中，防止RNA降解。）
[0045] 2. 1. 2加入Iml Trizol試劑，劇烈振蕩混勻15s，靜置IOmin充分裂解細胞。
[0046] 2. 1.3加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），迅速震蕩混勻15s，靜置5min。
[0047] 2. 1. 4 高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 15min。
[0048] 2. I. 5將上清小心轉移到新的I. 5mL離心管，加0. 5mL異丙醇，顛倒混勻，靜置 IOmin0
[0049] 2. 1. 6 再次高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 10min。
[0050] 2. 1. 7去除上清，加0. 5mL75%的乙醇，7, 500rpm低溫離心5min以洗漆沉澱。
[0051] 2. 1. 8重複步驟2. 1. 7 -次，進一步洗漆沉澱，去除離子。
[0052] 2. 1. 9小心吸取上清，並通風廚中乾燥RNA沉澱，並用50 μ L的DEPC水溶解RNA。
[0053] 3.篩選AcCysPl基因片段的克隆：
[0054] 根據測序分析，獲得四翅濱藜ESTs，從中獲得了一個編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNA 全序列AcCysPL將LR重組得到的酵母表達載體pYES-AcCysPl轉化至大腸桿菌感受態細胞 中（DH5 α )，過夜培養後，挑取單菌落，並於LB (含100mg/L的Amp)液體培養基過夜培養，通 過質粒提取試劑盒（鼎國公司）提取質粒。並根據載體上的通用序列PCR引物，並進行質 粒PCR擴增驗證，以鑑定獲得的cDNA序列。
[0055] 上遊（T7) :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[0056] 下遊（R) :5, -AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3，
[0057] PCR 反應體系（25 μ L) :Buffer2· 5 μ L、上下遊引物（T7、R)各 0· 5 μ L、Tag 酶 0· 5 μ UdNTPO. 5 μ L、模板 0· 2 μ L、ddH2020. 8 μ L。PCR 反應的條件：在 94°C預變性 5 分鐘； 94 °C變性30秒；迅速冷卻至58 °C退火30秒；72 °C延伸2分鐘，30個循環；72 °C延伸10分 鍾；4°C冷卻保存。擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在大約1454bp的位置上有特異 性的目的條帶（圖6)。
[0058] 實施例二：AcCysPl基因的序列分析
[0059] 經測序分析後，AcCysPl基因的全長cDNA序列全長為1454bp，包含930bp的開 放閱讀框，根據DNAMN分析，蛋白由310個胺基酸組成，等電點7. 09,蛋白總量34KDa。一 般情況下，蛋白二級結構含190個捲曲，40個螺旋，81個摺疊，有10個抗原肽段。蛋白含 127個親水胺基酸，184個疏水胺基酸，具有弱親水性，根據Expasy protscale的Hphob. / Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面區域在N端。PSORT Prediction預測蛋白最可 能定位到細胞質和線粒體基質中，這是半胱氨酸蛋白酶家族的主要特徵。通過分析表明，獲 得了 AcCysPl基因的全長cDNA序列，並且在GenBank上的登錄號為KJ027049。
[0060]利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對該編 碼基因進行保守區域分析（圖7)，該基因編碼的蛋白屬於半胱氨酸蛋白酶家族蛋白。通 過NCBI對AcCysPl基因編碼的胺基酸序列進行BLASTX，通過與已確定功能的其它物種的 胺基酸序列進行同源性分析和系統進化分析，利用MEGA4軟體進行進化樹分析，結果表明： AcCysPl與其它已知物種中的半胱氨酸蛋白酶基因編碼的胺基酸進化關係較遠。（圖8)。 [0061] 實施例三：重組酵母的轉化及檢測
[0062] 釀酒酵母菌株INVScl為尿氨酸營養缺陷型（UraO的模式菌株，在缺乏尿氨酸 的酵母基本培養基（SC-UraO上，該酵母菌株幾乎不能生長和繁殖。而酵母表達載體 (PYES2-DEST52)上含有URA3基因，且該基因的表達可以使酵母轉化子在SC-Ura-培養基 上正常生長。因此，SC-Urf選擇培養基可以進行陽性和非陽性酵母轉化子的篩選。通過醋 酸鋰法將載體質粒PYES-AcCysPl和pYES-DEST52分別轉化到酵母感受態菌株INVScl中， 將轉化酵母菌液塗在SC-Urf固體選擇培養基上，以未轉化的酵母做對照，進行培養，2d後 除了空酵母完全不長外，轉化兩種質粒的酵母均可以生長並有菌落長出，說明酵母轉化成 功，挑取酵母單菌落，過夜培養後進行破除細胞壁，並通過菌液PCR方法進行陽性轉化子的 進一步鑑定。
[0063] 1.運用醋酸鋰化學轉化法轉化釀酒酵母INVScl，其具體轉化步驟：
[0064] I. 1將一個酵母菌株單克隆（INVScI)加入到IOmL YH)液體培養基中，30°C過夜搖 培。
[0065] 1. 2檢測酵母菌液的OD6c?值，利用50mL YH)液體培養基將過夜培養的酵母菌液稀 釋至OD6tltl為0· 4, 30°C繼續搖培2-4h。
[0066] 1. 3低溫離心（4°C，2500rpm)5min後，去除上清收集菌體，用40mLlxTE緩衝液重懸 菌體。
[0067] L 4再次低溫離心（4°C，2500rpm)5min後，收集菌體，用2mLlxLiAc/0. 5xTE緩衝液 重懸菌體。
[0068] 1. 5將獲得的重懸菌體按照每管100 μ L的體系分裝到I. 5mL離心管。
[0069] 1. 6將分裝的酵母細胞置於室溫孵育lOmin。
[0070] 1. 7在每個轉化體系（100 μ L)中，加入1 μ g質粒DNA，100 μ g變性鮭魚精DNA，混 勻。
[0071] 1. 8 每個體系中加入 700μ LlxLiAc/40% PEG-3350/lxTE，混勻。
[0072] I. 930°C孵育步驟1. 8中的混合液30min。
[0073] 1. 10在每個體系中再加入88μ L的DMS0,混勻後，42°C條件下水浴熱擊7min。
[0074] I. 115000rpm低溫離心lmin，去除上清。
[0075] 1. 12用備好的ImLlxTE的緩衝液重懸菌體，5000rpm低溫離心Imin,進一步去除上 清。
[0076] 1. 13用IOOyLlxTE的緩衝液將菌體重懸，並塗於酵母選擇培養基上，30°C培養 24h。
[0077] 2.陽性轉化子的鑑定
[0078] 從酵母選擇培養基上隨機挑取5個酵母轉化子（pYES2-AcCysPl)的單菌落，30°C 振蕩培養過夜（200rpm)，收集過夜培養菌體，沸水煮5min，迅速置於冰上5min以破碎細胞， 重複幾次，以細胞破碎液離心濃縮樣品作為模板進行菌液PCR，以引物T7和R進行PCR擴 增，PCR 反應體系為（25yL) :Buffer2.5yL、上下遊引物（T7、R)各 0.5 4 1^、了&8酶0.5 4 1^、 dNTPO. 5 μ L、模板 5 μ L、ddH2015. 5 μ L。
[0079] PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，擴增片段大小為1454bp，與目標長度吻 合（圖9)。證明重組質粒pYES2-AcCysPl已經轉化到酵母菌株中。
[0080] 實施例四：陽性轉化酵母逆境脅迫處理
[0081] L逆境脅迫處理前準備
[0082] 取適量陽性酵母轉化子（pYES-DEST52, pYES2-AcCysPl)菌液，接種到含2%葡萄 糖的SC-U液體培養基中，30°C條件下200rpm振蕩培養24h，測OD 6c?值，並用SC-U液體培養 基（2%葡萄糖）將菌液006(|(|統一調整為0.4，總體積511^，8000印111離心11^11，吸取上清液， 力口 2mL含2%半乳糖的酵母誘導培養基重懸菌體，以1:50的比例接到5mL的誘導培養基中 擴大培養，30°C振蕩培養 24h，檢測酵母 INVScl (pYES-DEST52)和 INVScl (pYES2-AcCysPl) 的OD6c?值，並統一調整到OD6c?值為2,備用。對這兩種酵母轉化子進行不同的非生物脅迫 處理，比較兩種酵母轉化子抗鹽和乾旱脅迫能力，實驗重複3次。
[0083] 2.模擬逆境脅迫處理
[0084] 存在於自然界中的植物面對各種生物和非生物逆境，非生物脅迫中最主要的是鹽 脅迫（NaCl、KCl等）和乾旱脅迫。
[0085] 在實驗室條件下進行鹽和乾旱的模擬，用2M NaCl模擬鹽脅迫，3M的山梨醇模擬 乾旱脅迫。運用以上兩種模擬條件處理酵母轉化子，通過酵母的生長情況對比，從而評價該 基因在酵母中誘導表達後對酵母抗逆性的影響，以對該基因在酵母中的抗逆功能進行初探 (圖 10、圖 11、圖 12)。
[0086] 2. INaCl處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、10000倍的菌 體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養基上，30°C培養兩天後，比較兩種酵 母轉化菌的菌落生長狀態。
[0087] 2. 23M山梨醇乾旱模擬處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、 10000倍的菌體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養基上，30°C培養兩天 後，比較兩種酵母轉化菌的菌落生長狀態。
[0088] 實施例五：AcCysPl基因在四翅濱藜PEG和NaCl脅迫下的應答
[0089] 1.四翅濱藜脅迫處理：
[0090] 將四翅濱藜種子種在營養土中，正常條件生長50天後，選取生長良好的四翅濱 藜，轉移到MS營養液中進行水培，每天更換營養液，水培3天待四翅濱藜生長健壯後，分別 用400mM NaCl和20% PEG6000處理，並在0、6、12、24、48h後取根莖葉，液氮速凍，-80°C保 存。
[0091] 2. RNA提取及反轉錄：
[0092] 採用Trizol法提取總RNA (如實施例一，2. 1)，利用Takara公司的PrimeScriptt RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉錄以製備 cDNA，用 於 quantity Real-timePCR 分析。
[0093] 3.螢光定量PCR分析：
[0094] 利用SYBR =(gj GreenReagent試劑盒，使用7500螢光定量系統檢測AcCysPl基因 (F: GCAACAGTTGGTGGACTGTG ; R: ACGTTCAATACCACCGGCTT)在不同處理下隨時間變化的表達 量差異。真核延伸生長因子（EFl-α)作為內參基因（F:5' -CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3' ； R5' -TGGTGGGAACCATCTTCACG-3'）。反應條件為：95°C預變性 30 秒；95°C變性 5 秒，60°C退 火延伸34秒，進行40個循環；95°C變性15秒，60°C退火延伸1分鐘，95°C變性15秒；60°C 延伸15秒。採用2-法分析表達量差異（圖13、圖14)。
【權利要求】
1. 一種植物抗逆相關蛋白AcCysPl，其特徵在於由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基 酸序列組成的蛋白質。
2. 按權利要求1所述植物抗逆性相關蛋白AcCysPl的編碼基因AcCysPl，其特徵在於 所述編碼基因AcCysPl的編碼序列為下列之一： 1) 編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第190-1122位脫氧核苷 酸； 2) 編碼序列表中SEQ ID N0:2蛋白質序列的核苷酸分子。
3. -種重組表達載體，其特徵在於含有權利要求2所述植物抗逆性相關蛋白AcCysPl 的編碼基因AcCysPl。
4. 一種重組菌，其特徵在於含有權利要求2所述植物抗逆性相關蛋白AcCysPl的編碼 基因 AcCysPl。
【文檔編號】C12N1/19GK104371991SQ201410497324
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】潘洪玉, 餘剛, 李敬濤, 孫新華, 賈承國, 劉金亮, 張祥輝 申請人:吉林大學