一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾後的Cre融合蛋白的製作方法

2023-05-21 22:11:01 2

專利名稱：一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾後的Cre融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於重組功能檢測細胞技術領域，涉及一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾後的Cre融合蛋白。
背景技術：
Cre屬於重組酶家族，它是來源於Pl噬菌體，能夠作用於哺乳動物細胞引起DNA序列特異性重組蛋白(Nagy A:Cre recombinase: the universal reagent for genometailoring. Genesis 2000，26:99-109)，它是由Pl噬菌體編碼的大小為38kD的蛋白，能識別34bp大小的Ioxp位點。重組酶對底物的構形要求不嚴格，可以是超螺旋DNA，也可以是線性DNA。在Cre酶的作用下，兩個同向Ioxp位點之間的DNA片段將會被刪除；兩個反向 Ioxp 位點之間的 DNA 將會發生翻轉(Hoess R H, Abremski K. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre Iox site specific recombination system[J].MolBiol, 1985，181 (3) :351-362.)Cre酶介導的遺傳重組可進行定點、定時、定組織的特異性控制。該系統於1981年被首次發現，1993年被Gu等(Gu H, Zou Y R, RajewskyK.Independent control of immunoglobulin switch recombination at individualswitch regions evidenced through Cre-LoxP-mediated gene targeting[J].Cell, 1993，73 (6) : 1155-1164.)研究人員正式作為一種基因操作手段應用以來已廣泛地應用於基因克隆、基因捕獲、基因整合、基因刪除等研究領域並體現出巨大優勢。Cre重組酶通過對DNA進行準確切割和重新連接，能夠介導靶DNA發生包括倒位、易位、切離或整合等形式的重排，從而使得在染色體水平對真核生物基因組進行遺傳改造，以及對轉基因動物和植物中轉基因的表達進行有效的控制成為可能。該系統目前已成為在特定基因的刪除、基因功能的鑑定、外源基因的定點整合、基因捕獲以及染色體工程等方面進行研究的有力工具，並在轉基因的酵母、植物、昆蟲、哺乳動物的體內外DNA重組方面得到廣泛的應用。因此，有必要構建一種哺乳動物細胞檢測細胞系。目前用於構建的檢測cre/loxp系統效率的元件，多為將一個組成型啟動子和一種報告基因中間用多個順式串聯的轉錄終止子阻斷，終止子兩側有兩個同向LoxP，然後通過細胞轉染或者病毒轉導等方式，隨機整合(或其他方法)或定點打靶到哺乳動物細胞基因組上。但是，這種隨機整合(或其他方法)可能產生以下情況1.插入突變病毒載體介導的整合容易導致插入突變引起細胞建系失敗；2.基因沉默而非病毒載體的隨機整合也容易整合到異染色質區，引起轉基因沉默，使得新建立的細胞系無法正常表達報告基因，而不能正常指示ere切割效率；3.非單拷貝整合在排除前兩種情況的前提下，假定非病毒載體隨機整合位點均位於轉錄活躍區，如果發生了非單拷貝整合，除了可能影響細胞正常生長外，多餘的LoxP序列也會影響到Cre重組酶功能的驗證。而在哺乳動物細胞中，鏈黴菌噬菌體c31整合酶被證明是可以與基因組DNA中特異性序列(即假attP位點)進行反應的整合酶，它可以將外源基因穩定地整合到哺乳動物細胞基因組的那些特定的序列上，其偏向於以單拷貝整合到基因組轉錄活躍區，從而極大降低了外源基因隨機插入造成的基因突變風險。已被發現的c31整合酶識別的細胞基因組特異性位點有一百多個，對整合位點的生物信息學分析表明它們有較好的安全性(T. ff. Chalberg, et al.Integration specificity of phiC31 integrase in the humangenome. J Mol Biol. 2006. 357. 28-48)，提示其作為在哺乳動物細胞中進行基因操作和基因治療的一個有用的工具，適合用於驗證Cre穿膜肽效率細胞系的構建，即介導含有驗證元件的載體以單拷貝的形式整合到哺乳動物基因組轉錄活躍區，從而正常行使其驗證Cre融合蛋白穿膜能力和生物學活性的功能。

發明內容
本發明解決的問題在於一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾後的Cre融合蛋白，以驗證Cre融合蛋白的穿膜效率和生物活性，從而優化Cre融合蛋白在相關基因工程領域的應用。本發明是通過以下技術方案來實現 —種Cre融合蛋白功能檢測載體,包括Pcmv IE啟動子,在Pcmv IE啟動子的上遊設有attB序列，Pcmv IE啟動子的下遊設有兩個同向的Loxp序列,兩個同向的Loxp序列之間依次設有BGH終止子、BGH終止子和SV40A終止子，Loxp序列的下遊設有螢光標記基因及抗生素篩選基因；當Loxp序列及其之間的三個終止子在Cre重組酶作用下剪切後，PcmvIE啟動子和螢光標記基因拼接，啟動螢光標記基因的表達。所述的載體為pAcmv-stop-EGFP,包括以下元件及連接順序attB序列-Pcmv IE啟動子-Loxp序列-BGH終止子-BGH終止子-SV40A終止子-Loxp序列-螢光標記基因-抗生素篩選基因；所述的螢光標記基因為EGFP基因閱讀框，抗生素篩選基因為neo，該載體稱為載體。所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。一種Cre融合蛋白功能檢測細胞，宿主細胞為HEK293細胞，將pAcmv-stop-EGFP載體和phiC31整合酶表達載體pCMVint共轉染宿主細胞；利用G418抗性篩選陽性轉染的重組細胞，並篩選其中attB-CMV-stop-EGFP表達載體以單拷貝的形式整合入宿主細胞假attP位點的細胞。所述的Cre融合蛋白功能檢測細胞在檢測Cre融合蛋白剪切活性中的應用。所述的Cre融合蛋白是具有蛋白轉導功能的穿膜肽和核定位信號修飾的Cre融合蛋白。一種經TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白，從N端開始分別為6XHis區域、NLS多肽區域、TAT多肽區域和Cre酶區域；其中NLS多肽區域的胺基酸殘基的序列為Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, AT 多肽區域的胺基酸殘基的序列為Tyr-Gly-Arg-Lys_Lys—Arg-Arg-Gln—Arg-Arg-Argο所述的TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白的製備方法，具體步驟如下I) PCR擴增得到帶有SacI和XhoI識別序列的Cre核苷酸序列，將擴增產物經過SacI和XhoI酶切後，回收連接到同樣經過SacI和XhoI酶切的原核表達載體pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重組質粒；2)由引物退火產生帶有NdeI和SacI識別序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，並將其連接到經過NdeI和SacI酶切的pET28a_Cre重組質粒，得到pET28a_HNTC重組質粒;3)將pET28a_HNTC重組質粒轉化到大腸桿菌BL21菌株中，挑選5_8個陽性的菌落接種在卡那黴素抗性的LB培養基中，在16 22°C用O. 2mM IPTG誘導表達Cre融合蛋白；4)誘導表達蛋白的細菌經過超聲波破碎菌體，釋放出融合蛋白後，經過Ni離子螯合的親和層吸柱純化，得到純化後的蛋白。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果

本發明提供的Cre融合蛋白功能檢測載體及細胞排除了 1.插入突變病毒載體介導的整合容易導致插入突變引起細胞建系失敗；2.基因沉默而非病毒載體的隨機整合也容易整合到異染色質區，引起轉基因沉默，使得新建立的細胞系無法正常表達報告基因，而不能正常指示ere切割效率；3.非單拷貝整合在排除前兩種情況的前提下，假定非病毒載體隨機整合位點均位於轉錄活躍區，如果發生了非單拷貝整合，除了可能影響細胞正常生長外，多餘的LoxP序列也會影響到Cre重組酶功能的驗證。本發明提供的篩選得到的經TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白HNTC，其穿膜效率高、生物活性好，可有效地作為哺乳動物細胞染色體水平上基因操作的工具。


圖I是Cre重組酶功能驗證細胞系構建示意圖及其工作原理；圖2是在細胞水平上驗證載體pACMV-stop-EGFP功能；圖3-1為平均Ct值對樣品拷貝數的對數(Iog2N)作圖得到絕對定量標準曲線；圖3-2為特異性擴增引物TGFP的溶解曲線分析結果；圖4-1 4-2為對檢測細胞系293-C31-L2GFP功能驗證；圖5-1 5-5為Cre融合蛋白的表達純化。其中圖5_1為TAT和NLS修飾的不同組合的Cre融合蛋白示意圖；圖5-2為製備不同修飾的Cre融合蛋白原核表達載體酶切鑑定圖；圖5-3為以融合蛋白His-NLS-TAT-Cre (HNTC)為例的蛋白純化結果過程；圖5-4為各種ere融合蛋白的SDS-PAGE檢測結果；圖5_5為利用ere重組酶的專一性抗體的免疫印跡結果。圖6-1為顯微鏡觀察不同修飾Cre重組蛋白對細胞系293_C31_L2GFP作用表達螢光情況；圖6-2為流式細胞術定量檢測不同修飾Cre融合蛋白的重組效率。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I. Cre重組酶功能驗證細胞系293-C31-L2GFP的建立及功能驗證I. I 載體 pACMV-stop-EGFP 的構建用於建立檢測ere重組酶活性細胞系的載體pACMV_stop_EGFP構建過程如下
以載體pcdna3. I ( + ) (Invitrogen公司)為模板,通過PCR方法擴增得到兩段BGH終止子序列，其中一段帶有AscI和SpeI酶切位點的片段P1，其擴增引物為上遊引物TTGGCGCGCCACCCGCTGATCAG；下遊引物CCGGACTAGTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGCC；另一段帶有SpeI和AflII酶切位點的片段P2，其擴增引物為上遊引物GGACTAGTACCCGCTGATCAGCC；下遊引物AGACTTAAGTGGTTCTTTCCGCCTC；以載體pEGFP-Cl為模板，通過PCR方法擴增得兩端為AflII和NotI酶切位點的SV40A終止子序列P3，其擴增引物為 上遊引物CCATCTTAAGTGATCATAATCAGCCATACCAC；下遊引物AGACTGCGGCCGCTAAGATACATTG。將以上所擴增的三個終止子同向順次克隆入載體PAttB-LoxP2-eGFP中兩個同向LoxP序列間的相應多克隆位點,得到載體pACMV-stop-EGFP。其質粒圖譜如圖I所示,attB序列位於Pcmv啟動子的上遊，Pcmv啟動子的下遊設有兩個同向的Loxp序列，兩個同向的Loxp序列之間依次設有BGH終止子、BGH終止子和SV40A終止子，Loxp序列的下遊設有螢光標記基因EGFP及抗生素篩選基因neo。元件連接順序為attB序列-Pcmv IE-Loxp序列-BGH終止子-BGH終止子-SV40A終止子-Loxp序列，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。I. 2 載體 pACMV-stop-EGFP 功能驗證按表I分組轉染HEK293細胞(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)，從細胞水平上驗證載體pACMV-stop-EGFP螢光報告功能。表I不同載體的分組轉染
權利要求
1.一種Cre融合蛋白功能檢測載體,其特徵在於,包括Pcmv IE啟動子,在Pcmv IE啟動子的上遊設有attB序列,Pcmv IE啟動子的下遊設有兩個同向的Loxp序列,兩個同向的Loxp序列之間依次設有BGH終止子、BGH終止子和SV40A終止子，Loxp序列的下遊設有螢光標記基因及抗生素篩選基因；當Loxp序列及其之間的三個終止子在Cre重組酶作用下剪切後，Pcmv IE啟動子和螢光標記基因拼接，啟動螢光標記基因的表達。
2.如權利要求I所述的Cre融合蛋白功能檢測載體，其特徵在於，所述的載體為pAcmv-stop-EGFP,包括以下元件及連接順序attB序列-Pcmv IE啟動子-Loxp序列-BGH終止子-BGH終止子-SV40A終止子-Loxp序列-螢光標記基因-抗生素篩選基因； 所述的螢光標記基因為EGFP基因閱讀框，抗生素篩選基因為neo，該載體稱為載體。
3.如權利要求I所述的Cre融合蛋白功能檢測載體，其特徵在於，所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
4.一種Cre融合蛋白功能檢測細胞，其特徵在於，宿主細胞為HEK293細胞，將pAcmv-stop-EGFP載體和phiC31整合酶表達載體pCMVint共轉染宿主細胞；利用G418抗性篩選陽性轉染的重組細胞，並篩選其中attB-CMV-stop-EGFP表達載體以單拷貝的形式整合入宿主細胞假attP位點的細胞。
5.權利要求4所述的Cre融合蛋白功能檢測細胞在檢測Cre融合蛋白剪切活性中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的Cre融合蛋白是具有蛋白轉導功能的穿膜肽和核定位信號修飾的Cre融合蛋白。
7.—種經TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白，其特徵在於，從N端開始分別為6 XHis區域、NLS多肽區域、TAT多肽區域和Cre酶區域；其中NLS多肽區域的胺基酸殘基的序列為Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, AT 多肽區域的胺基酸殘基的序列為Tyr_Gly-Arg-Lys_Lys—Arg-Arg-Gln—Arg-Arg-Argο
8.—種權利要求7所述的TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下 1)PCR擴增得到帶有SacI和XhoI識別序列的Cre核苷酸序列，將擴增產物經過SacI和XhoI酶切後，回收連接到同樣經過SacI和XhoI酶切的原核表達載體pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重組質粒； 2)由引物退火產生帶有NdeI和SacI識別序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，並將其連接到經過NdeI和SacI酶切的pET28a_Cre重組質粒，得到pET28a_HNTC重組質粒； 3)將pET28a-HNTC重組質粒轉化到大腸桿菌BL21菌株中，挑選5_8個陽性的菌落接種在卡那黴素抗性的LB培養基中，在16 22°C用O. 2mM IPTG誘導表達Cre融合蛋白； 4)誘導表達蛋白的細菌經過超聲波破碎菌體，釋放出融合蛋白後，經過Ni離子螯合的親和層吸柱純化，得到純化後的蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾後的Cre融合蛋白。Cre融合蛋白功能檢測細胞，宿主細胞為HEK293細胞，將pAcmv-stop-EGFP載體和phiC31整合酶共轉染宿主細胞。通過phiC31整合酶的作用，使得攜帶檢測Cre重組酶功能的LoxP元件的載體以單拷貝的形式整合到HEK293細胞系的假attP位點，為研究Cre融合蛋白穿膜效率和生物活性提供穩定可靠的細胞模型。經TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白HNTC，其穿膜效率高、生物活性好，可有效地作為哺乳動物細胞染色體水平上基因操作的工具。
文檔編號C12Q1/48GK102827873SQ20121027166
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者餘源, 張湧, 王勇勝, 劉軍, 權富生, 田進海, 王易之, 李仲夏 申請人:西北農林科技大學, 楊凌科元克隆股份有限公司