檢測ⅲ型登革病毒ns1抗原的免疫診斷試劑盒及其應用的製作方法
2023-05-22 07:33:06
專利名稱：檢測ⅲ型登革病毒ns1抗原的免疫診斷試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測登革病毒ns1抗原的酶聯免疫試劑盒，以及這
種試劑盒對登革熱作出早期分型診斷中的應用。
背景技術：
登革病毒屬於黃病毒科黃病毒屬，通過埃及伊蚊和白蚊伊蚊傳播，登
革病毒有4個血清型I型、II型、III型和IV型(簡稱dv1、 dv2、 dv3 和dv4)，任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床症狀，表現為 隱性感染、發熱、登革熱、或更為嚴重的登革出血熱和登革休克症候群。 登革病毒主要流行於熱帶和亞熱帶地區，近100多個國家、25億人口受 到威脅，在登革疫區中，多見4型登革病毒交替流行，更增加了不同型別 反覆感染的危險性。登革熱已成為一種嚴重危害人類健康的蚊媒病毒傳染 病。初次感染登革病毒所獲得的免疫力對於同型病毒的再次感染可產生終 身的免疫保護作用，但是對於其它型別登革病毒的再次感染僅能產生部分 而且短暫的免疫保護作用。由於存在抗體依賴的感染增強作用，異型登革 病毒再次感染是發生登革出血熱/登革休克症候群的主要危險因素。
目前，具有保護性的登革病毒疫苗尚未研製成功，臨床上對於登革病 毒的感染亦未有特異性的治療措施。但研究表明及早的臨床處理可以減少 dhf的發病率和致死率。由於多數登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床 表現，登革病毒感染確診依賴於實驗室診斷手段。目前，登革病毒的實驗室診斷方法主要包括病毒分離、血清學檢測和核酸檢測。由於4種登革病毒的血清型之間，以及與其它黃病毒成員間存在共同抗原表位，用傳統的
血清學方法如血凝抑制試驗、IgM和IgG抗體捕獲ELISA法等檢測時存在交叉反應，結果易出現假陽性，並且，血清學檢測方法也不能用於早期診斷。病毒分離是登革病毒感染診斷的金標準，並可進一步用於病毒血清型的鑑定，但是該方法費時而且對於實驗室的條件要求較高。RT-PCR敏感性高，並且可以鑑定病毒血清型，但因技術要求高、樣品易受汙染且價格昂貴而使其應用受到限制。
登革病毒中的非結構蛋白1 (nonstructural protein 1 ,NS1)是一種重
要的高度保守的糖蛋白，其抗原性很強，且研究發現在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環抗原，因此檢測急性期病人血清中的循環NS1抗原可用於早期診斷登革病毒感染。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種具有
高靈敏度和特異性的m型登革病毒NS1抗原的簡便快捷的免疫診斷試劑
盒，直接從血液標本中檢測出DV3NS1抗原，對登革熱作出早期分型診斷。
為了解決以上技術問題，本發明提供的檢測III型登革病毒的酶聯免疫試劑盒，包括包被有特異性抗體1D14A2A10的微孔反應板和標記有生物素的檢測抗體5D32A17。
其中，所述的單抗1D14A2A10和單抗5D32A17均屬IgGl類免疫球蛋白，能與m型登革病毒的非結構蛋白1 (nonstructural protein 1 ,NS1)結合，其中單抗1D14A2A10由保藏號為cctcc—c200819的雜交瘤細胞株1D14A2A10分泌，單抗5D32A17由由保藏號為cctcc—c200820的雜交瘤細胞株5D32A17分泌。雜交瘤細胞株1D14A2A10和5D32A17是用重組的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫小鼠，然後用免疫後的小鼠脾細胞和商品化的小鼠骨髓瘤細胞融合，最後用HAT篩選得到。標記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、膠體金、螢光素等，優選生物素。當本發明檢測抗體上結合的標記物為生物素時，本發明試劑盒還
含有標記有辣根過氧化物酶的親和素。親和素能與生物素以1 : 4的比例結合，起到放大檢測信號的作用，進一步提高敏感度。為了實際應用中更方便操作，所述試劑盒還包括濃縮洗液、陽性對照、陰性對照、顯色液和終止液。
本發明的檢測m型登革病毒nsi抗原的免疫診斷試劑盒可達成以下功效準確、快速地檢測出ni型登革病毒，而與其它i型、n型和iv型登革病毒以及乙型腦炎病毒、黃熱病毒無交叉反應，有利於對登革病毒感染作出早期分型診斷；此外，該試劑盒成本低，對樣品處理過程要求簡單，
能同時快速檢測大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，檢測方法簡便易行；具有高靈敏度、高特異性的特點。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。圖l是單抗1D14A2A10與DV1感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖2是單抗1D14A2A10與DV2感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖3是單抗lD14A2A10與DV3感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖4是單抗lD14A2A10與DV4感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖5是單抗5D32A17與DV1感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖6是單抗5D32A17與DV2感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖7是單抗5D32A17與DV3感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖8是單抗5D32A17與DV4感染C6/36細胞抗原片反應結果。圖9是單抗1D14A2A10與5D32A17與DV3 NS1蛋白結合的免疫印跡結果。
圖IO是檢測III型登革病毒NSI抗原的免疫診斷試劑盒的特異性分析結果圖。
具體實施例方式
本發明的檢測原理是將1D14A2A10作為包被原吸附於微孔反應板上，加入處理後的待測樣品後再依次加入標記有生物素的檢測抗體5D32A17和標記有辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶的親和素，顯色後終止，測定樣品吸光值，即可進行判斷。
本發明是基於雙抗體夾心ELISA方法的檢測試劑盒，其中所用的捕獲抗體1D14A2A10是從一組抗III型登革病毒的NS1蛋白的單克隆抗體中篩選出來的，能特異性結合III型登革病毒的NS1蛋白；檢測抗體5D32A17是一種與其它三型登革病毒具有交叉反應性的單抗，兩者分別結合不同的抗原表位。本發明試劑盒可以實現準確、快速地檢測出III型登革病毒，而
與其它i型、n型和iv型登革病毒以及乙型腦炎病毒、黃熱病毒無交叉反應，有利於對登革病毒感染作出早期分型診斷。
本發明的雜交瘤細胞株1D14A2A10和雜交瘤細胞株5D32A17已於2008年4月28號在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，並收到保藏登記號為CCTCC—C200819和CCTCC_C200820。
下面將通過具體的例子和實驗報告進一步闡明本發明的試劑盒1、單克隆抗體製備及鑑定
(1) 免疫原的製備
本發明用於製備單克隆抗體的免疫原為基因重組DV3 NS1蛋白和已滅活天然的病毒抗原。基因重組DV3 NS1蛋白是用攜帶DV3 NS1蛋白基因工程菌株為一種大腸桿菌菌株進行製備的，其製備按常規方法進行，經用高濃度變性劑反覆洗滌純化獲得NS1抗原，詳細的製備方法可參照使用手冊。將NS1蛋白純化後，以考馬斯亮藍(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE， Cat， No.ED62976)定量。Western blot對純化的重組蛋白鑑定結果顯示，重組NS1蛋白能與4型登革病毒交叉性單抗結合，在分子量約41KDa處出現特異性的反應條帶，與預測的DV3 NS1分子量大小一致。已滅活天然的病毒抗原，是從DV3感染的病毒宿主細胞(C6/36， 一種白蛟伊蚊細胞)獲得。
(2) 抗原免疫
取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次採用弗氏完全佐劑與等體積DV3NS1抗原混勻乳化，每隻小鼠皮下多點注射30嗎，以後每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV3抗原或重組的DV3 NS1抗原交替免疫共6次後，於融合前3天每隻小鼠腹腔注射DV3 NS1抗原100嗎進行加強免疫，3天後取其脾細胞進行融合。
(3) 雜交瘤細胞製備及篩選飼養細胞的製備取正常BALB/C小鼠，眼球放血後，頸椎脫位法處
死，浸沒入75%酒精中5min，超淨工作檯無菌操作取出小鼠脾臟，於銅網上研磨製成細胞懸液並用無血清1640 (含慶大黴素100pg/ml)洗滌二次，離心去上清，用40ml含15。/。FBS的1640培養液重懸細胞，平均分至96孔板中，約60pl/孔，37°C， 5MC02孵箱培養待用。
細胞融合取免疫血清效價較高的小鼠，眼球放血後，頸椎脫位法處死，浸沒入75Q/。酒精中5min，超淨工作檯無菌操作取出小鼠脾臟，銅網研磨完全後，用無血清1640洗滌細胞二次後，將對數生長期的NS-1細胞與脾細胞按1:4比例混勻，室溫1000rpm離心5 min，棄盡上清；在37°C水浴中，在1 min內緩慢加入1 ml PEG 1450，邊加邊輕輕搖勻；分別於1min、 2min、 3 min、 4min、 5min內力卩lml、 2ml、 3 ml、 4ml、 5 ml無血清1640終止融合；最後加入10 ml 15% FBS 1640培養基，室溫800 rpm離心5min;棄上清，用60ml上述培養基重懸，平均分至加有飼養細胞的96孔板中，100pl/ L， 37°C， 5%0)2孵箱培養。次日對融合的細胞加入2xHAT選擇培養基，以後每隔2天用lxHAT培養基換液一次。待融合細胞克隆長至佔孔底面積的1/10時，取培養上清經間接ELISA法用NS1蛋白和DV3病毒進行雙篩選。陽性克隆轉至24孔培養板中擴大培養，經ELISA和免疫螢光(DV3感染細胞抗原片)複測仍為強陽性的克隆用有限稀釋法進行克隆化。克隆化2 3次至陽性率達100%，選擇分泌抗體效價高的細胞株擴增培養後置-8(TC保存。(4)單克隆抗體腹水製備和純化
腹水製備採用體內誘生法製備本發明中單克隆抗體，即在小鼠體內接種雜交瘤細胞製備腹水。陽性雜交瘤細胞株置5%C02、 37"C培養箱中培養，取對數生長期的細胞，離心棄上清，用預冷的無血清RPMI 1640培養基重懸並洗滌細胞2次，以適量預冷的培養基重懸細胞計數，每隻小鼠腹腔注射3xl06 5xl06個/20(Vl (小鼠於1周前腹腔注射不完全佐劑0.5 ml)。約1 2周後小鼠腹水形成，用7號注射針頭收集腹水，離心後收集腹水上清，立即加入疊氮鈉至終濃度為0.1%,存放於4。C備用。
單抗純化用辛酸一硫酸銨沉澱法純化腹水。操作方法如下將腹水於4°C ， 12 000 rpm離心30 min，加入2倍腹水體積的0.06M、 PH4.4乙酸鈉緩衝液，在室溫攪拌下30min內按33 pl/ml逐滴緩慢加入辛酸，4°C靜置2小時，離心30分鐘，取上清經定性濾紙過濾後，加入上清體積1/10體積的0.1MPBS，並用1MNaOH調PH值至7.4，冰浴攪拌下，緩慢加入固體硫酸銨0.277 g/ml(硫酸銨終濃度為45%), 4。C靜置過夜，離心30分鐘，棄上清，沉澱溶於適量的0.01MPBS， 4。C透析過夜，透析後的抗體用Bradford法測定抗體蛋白含量，4"C保存備用或加50%甘油凍存於-8(TC備用。
(5)單克隆抗體特性鑑定
免疫球蛋白亞類鑑定採用間接ELISA，包被純化的DV3 NS1抗原，封閉後與雜交瘤細胞培養上清孵育，再分別與HRP標記羊抗小鼠IgM、IgGl、 IgG2a、 IgG2b和IgG3抗體反應，充分洗滌後TMB顯色，測A450值。本專利發明的兩株單克隆抗體均為IgGl。
單克隆抗體特異性鑑定採用間接ELISA法，分別用4型重組DVNS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常規的間接ELISA法進行檢測。結果顯示本專利發明的單克隆抗體1D14A2A10為DV3特異性單抗，而5D32A17為型交叉性單抗。另外，採用間接免疫螢光法，按常規方法培養I IV型登革病毒並製作感染細胞抗原片，分別與陽性雜交瘤細胞培養上清和FITC標記的羊抗小鼠IgG孵育，並設立未感染病毒的C6/36細胞抗原片作為陰性對照，對照圖1-圖8可知圖1， 2， 4表明單抗1D14A2A10分別與DV1， DV2， DV4感染C6/36細胞抗原片均呈陰性反應，圖3表明單抗1D14A2A10與DV3感染C6/36細胞抗原片呈陽性反應，圖5-8表明單抗5D32A17分別與DV1 DV4感染C6/36細胞抗原片均呈陽性反應，說明螢光顯微鏡下觀察結果與間接ELISA檢測結果一致。在圖9中M代表彩虹預染蛋白質分子量標準，其中帶2為單抗1D14A2A10與DV3 NS1蛋白結合帶，帶5為單抗5D32A17與DV3 NS1蛋白結合帶，免疫印跡結果顯示兩株單抗與重組DV3NS1蛋白均可在分子量約41KD處顯示陽性結合帶。
單克隆抗體競爭表位分析採用競爭抑制實驗。純化的NS1蛋白lpg/ml包被酶標板，先加入lmg/ml純化的單抗50pl，再加入稀釋的生物素標記單抗5(^1， 37。C孵育1 h後0.5%Tween 20的PBS洗板，加入lOOplHRP標記親和素，26"孵育30min後洗板TMB顯色，測定A450值。以單抗對同一生物素標記單抗的抑制為陽性對照，以己知無關單抗對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率。抑制率計算公式為(1一各孔測定值/陰性對照值)xl00。抑制率>75%判定為表位相關，〉50%為不完全相關，<50%為不相關，<25%為完全不相關。結果顯示2株單抗識別2個不完全相同的抗原位點。2、檢測III型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒
(1) 所用試劑的配製
a. 辣根過氧化物酶標記的親和素，購自Zymed公司；
b. 濃縮洗液含有2。/。Tween-20的20xPBS,即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4，58.02g Na2HP04.12H20,175.3g NaC1,15磅20min高壓滅菌後,加入20ml Tween-20攪勻，使用時20倍稀釋；
c. 陽性對照DV2NS1抗原1:1000稀釋液；
d. 陰性對照含0.1。/。Tween-20的10mM PH7.4 PBS,即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4,58.02gNa2HPO4.12H2O,175.3gNaC1,15磅20min高壓滅菌,20倍稀釋後加入0.1% Tween-20;
e. 顯色液由顯色液A和B組成，使用時取二者等量混勻使用。其中顯色液A、 B的組成成分如下
顯色液A :
將0.89g擰檬酸和0.16g EDTA 二鈉溶於1000ml水中，115。C高壓30min，降至90。C後加TMB0.25g，搖勻於4。C閉光保存；顯色液B :
將9.33g檸檬酸和14.6g EDTA 二鈉溶於1000ml水中，115。C高壓30min後，降至90。C後加0.75。/。過氧化氫尿素12.8ml，搖勻於4。C閉光保存；
f. 終止液1MH2S04。
(2) 酶標板的製備
將本發明單抗1D14A2A10用lOmM磷酸鹽緩衝液(pH7.6)稀釋至5嗎/ml， 150W/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，4。C過夜。拍幹後，每孔加 入300^1/孔的0.25。％酪蛋白(Sigma)的封閉液，於4。C過夜以封閉非特異性結合位點。傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封4i:保存。(3)生物素標記5D32A17的製備將2.2mg生物素溶解於0.5ml蒸餾水，取其3(^1加入到lml單抗 5D32A17 (濃度為2mg/ml)中，4。C靜置2h後於PBS中4。C透析過夜， 換液三次。收集結合物加入終濃度50%甘油保護劑，最後用磷酸鹽緩衝 液稀釋1000倍，即為工作液。3、 檢測血清樣品中的m型登革病毒NSl抗原取待測的樣品100pl，加入1D14A2A10包被的聚苯乙烯96孔微量測 試板中，同時設陰性對照和陽性對照，37T:溫育lh，濃縮洗滌液20倍稀 釋後洗滌板條，洗板五次後，加入1:1000稀釋的生物素標記的單抗 5D32A17， 100^1/孔，室溫30min，同上洗板五次後，加入1:1000稀釋的 辣根過氧化物酶標記的親和素，100^1/孔，室溫30min，同上洗板八次後 加顯色液(顯色液A和B等量混合，現用現配)，100^1/孔，室溫避光10min 後，加入終止液，100^1/孔，終止反應。以空白孔調零，於450nm波長測 定吸光度(A值)。陽性對照平均值^).50，陰性對照平均值SO.IO，實驗 成立。樣品A值^陰性對照A值平均值x2.1，則判為陽性，反之為陰性。本節中所用試劑均按照2中的試劑配製方法進行配製。4、 檢測III型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒的靈敏度及特異 性分析(1)靈敏度檢測以純化的梯度稀釋DV3 NS1蛋白為標準檢測品，以相應BSA為陰 性對照，進行雙抗體夾心ELISA試驗。以BSA的檢測值作為標準，以 檢測值大於或等於相同BSA濃度檢測值的2.1倍的DV3 NS1的最低濃度 作為本方法檢測該抗原的靈敏度。結果顯示，抗體對檢測重組DV3 NS1 蛋白的靈敏度約為0.4pg/ml。(2)特異性分析用梯度稀釋的四個血清型登革病毒培養上清及乙腦病毒和黃熱病毒 培養液進行檢測，結果如圖10顯示，本發明試劑盒僅特異的檢測DV3， 與其餘3型DV病毒培養液無交叉反應，並且與其它黃病毒屬的病毒如乙 腦病毒及黃熱病毒均不發生交叉反應。說明建立的雙抗體夾心抗原捕獲 ELISA檢測具有登革病毒血清型特異性。
權利要求
1、一種檢測III型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，其特徵在於，包括包被捕獲抗體的微孔反應板和標記有標記物的檢測抗體。
2、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的捕獲抗體是 由保藏號為CCTCC一C200819的雜交瘤細胞株1D14A2A10分泌的單克 隆抗體1D14A2A10，所述的檢測抗體是由保藏號為CCTCC一C200820的 雜交瘤細胞株5D32A17分泌的單克隆抗體5D32A17。
3、 根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的雜交瘤細胞 株1D14A2A10和5D32A17是用重組的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉 免疫小鼠，然後用免疫後的小鼠脾細胞和商品化的小鼠骨髓瘤細胞融合， 最後用HAT篩選得到。
4、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的標記物是生 物素、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、膠體金、螢光素。
5、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，試劑盒還包括濃縮 洗液、陽性對照、陰性對照、顯色液和終止液。
全文摘要
本發明公開了一種檢測III型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，以及這種試劑盒在檢測III型登革病毒NS1抗原中的應用。本發明提供的檢測III型登革病毒抗原的免疫診斷試劑盒，包括包被單抗1D14A2A10的微孔反應板和標記有生物素的單抗5D32A17，還可以包括陽性對照、陰性對照、濃縮洗液、顯色液和終止液。該試劑盒能特異性的檢測III型登革病毒的NS1蛋白，與其他3種血清型登革病毒NS1無交叉反應，並且分別結合NS1不同抗原位點。本發明的檢測III型登革病毒抗原的免疫診斷試劑盒能同時快速檢測大批樣品，具有高特異性、高敏感性等特點，能夠快速、準確的對登革病毒感染病人進行早期分型診斷，具有重要的臨床應用價值。
文檔編號G01N33/543GK101576560SQ20081004334
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月8日 優先權日2008年5月8日
發明者晶 晉, 潘玉先, 車小燕 申請人:南方醫科大學