可溶性cd40l刺激人外周血b細胞長期培養方法
2023-05-22 06:49:01
專利名稱：可溶性cd40l刺激人外周血b細胞長期培養方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養方法，特別涉及一種利用可溶性CD40配體(sCD40L)刺激人外周血B細胞的長期培養方法。
背景技術：
在抗B型肝炎病毒特異性主動免疫治療領域，樹突狀細胞(DC)作為一種功能強的抗原提呈細胞(APC)，在抗病毒免疫中起核心作用。科學研究證明，DC功能缺陷或數量減少與B肝慢性化或慢性攜帶狀態有直接相關性。因而利用激活DC能誘導出HBsAg特異的殺傷效應，是抗肝炎病毒主動免疫治療極有前景的方法。但是，這種方法卻存在著如下缺陷(1)樹突狀細胞在自然狀態下數量很少，僅佔外周血單個核細胞的0.1％-0.5％，體外培養難，成活時間短，僅有10-15天時間，要達到治療劑量的細胞數採血量多，故在多次進行的免疫治療中，病人損傷大，臨床應用不便。(2)慢性B型肝炎患者或病毒感染者體內，樹突狀細胞的功能顯著缺陷或數量減少，體外培養的效率不高或培養後功能不足。(3)樹突狀細胞的體外培養成本較高。(4)樹突狀細胞確切的分化機制，各功能亞群發揮作用的分子機理，DC與其它免疫細胞之間相互的關係，還並不清楚。
在本發明之前，B細胞作為一種抗原遞呈細胞(APC)，早已為人們熟知。但以往刺激人外周血B細胞培養的方法是用可穩定表達CD40配體的NIH3T3細胞與B細胞共刺激培養。這種方法不但引入了外源性的細胞，增加實驗的幹擾因素，而且不能直接作用於人體，無法供應臨床。因此，其雖然可以在體外培養人外周血B細胞，但不能解決臨床疾病的困擾。
發明內容
本發明的目的就在於克服上述缺陷，研究、開發一種利用可溶性CD40配體刺激人外周血B細胞的長期培養方法。
本發明的技術方案是可溶性CD40L刺激人外周血B細胞的培養方法，其主要技術步驟為(1)無菌收集人外周血；(2)淋巴細胞分離液分離人外周血，得人外周血單個核細胞；(3)將人外周血單個核細胞置於由含10％人AB血清、轉鐵蛋白、胰島素組成的培養液中重懸細胞；(4)放入5％CO2、37℃、飽和溼度的孵育箱內培養；(5)加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL-4繼續刺激培養。
本發明的優點和效果在於採用CD40配體體外刺激人外周血B細胞可以產生B細胞的大量持續培養，能夠從20ml外周血單個核細胞中持續大量培養B細胞。同時，培養活化後的B細胞可以高表達MHC I、MHC II、CD80、CD86等抗原遞呈的必需分子，並可以有效提呈腫瘤細胞裂解物、抗原肽、抗原cDNA，甚至RNA，誘發特異性細胞免疫反應，其效果與樹突狀細胞相似，卻避免了樹突狀細胞培養的缺陷。同時，也解決了CD40配體的NIH3T3細胞與B細胞共刺激培養的缺陷。
本發明的其他優點和效果將在下面繼續描述。
圖1——外周血中B細胞團簇狀生長圖(A-培養第10天，B-培養第20天，C-培養第30天，D-培養第40天，E-培養第50天)。
圖2——細胞周期分析結果示意圖(G0-189.39％、G2-M2.67％、S7.94％)。
圖3——培養後CD40-B細胞高表達CD80、CD86及MHCI和II類分子示意圖。
具體實施例方式
i.無菌收集人外周血(PBMC)20ml(抗凝)，用IMDM培養液重懸，並計數；ii.在室溫下1500轉/min離心5分鐘，去上清；iii.用培養液重懸細胞，並計數；iv.該培養液含10％人AB血清、轉鐵蛋白、胰島素；v.用淋巴細胞分離液(ficoll)分離得人外周血單個核細胞，培養；vi.將人外周血單個核細胞濃度調整為2×106/ml，培養體系4ml；vii.加入IL-4 2ng/ml、CsA 625ug/ml、sCD40L 2ug/ml至培養液中；viii.將PBMC懸液移至6孔培養板中，每孔加4ml(2×106/ml)；ix.再放入5％CO2、37℃、飽和溼度的孵育箱內培養；x.人外周血單個核細胞靜置12小時以上，待細胞沉降於培養板底部，小心吸去培養板上層培養液2ml；xi.補充含10％人AB血清、轉鐵蛋白、胰島素的培養液2ml；xii.再加入IL-4 2ng/ml、CsA 625ug/ml、sCD40L 2ug/ml至培養液，小心將細胞吹散；xiii.繼續放入5％CO2、37℃、飽和溼度的孵育箱內培養。每4天半量換液。
在sCD40L和IL-4作用下，外周血B淋巴細胞成團簇樣生長，如圖1所示，A為培養第10天，B為培養第20天，C為培養第30天，D為培養第40天，E為培養第50天；B細胞成功培養達50天，細胞周期分析表明G0-189.39％、G2-M2.67％、S7.94％，如圖2所示；並高表達CD80、CD86及MHCI和II類分子，如圖3所示。
權利要求
1.可溶性CD40L刺激人外周血B細胞長期培養方法，其步驟為(1)無菌收集人外周血；(2)淋巴細胞分離液分離人外周血，得人外周血單個核細胞；(3)將人外周血單個核細胞置於由含10％人AB血清、轉鐵蛋白、胰島素組成的培養液中重懸細胞；(4)放入5％CO2、37℃、飽和溼度的孵育箱內培養；(5)加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL-4繼續刺激培養。
2.根據權利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細胞長期培養方法，其特徵在於步驟(2)中將人外周血在室溫下離心分離。
3.根據權利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細胞長期培養方法，其特徵在於步驟(3)將人外周血單個核細胞濃度調整為2×106/ml，培養體系4ml。
4.根據權利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細胞長期培養方法，其特徵在於培養過程中重複步驟(3)、(5)，每4天半量換液，繼續培養。
全文摘要
本發明涉及一種利用可溶性CD40配體(sCD40L)刺激人外周血B細胞的長期培養方法。本發明無菌收集人外周血，淋巴細胞分離液分離人外周血，將人外周血單個核細胞置於由含10％人AB血清、轉鐵蛋白、胰島素組成的培養液中重懸細胞，放入孵育箱內培養，加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL－4繼續刺激培養。解決了現有方法存在的引入外源性的細胞，增加實驗的幹擾因素，無法供應臨床的缺陷。本發明採用CD40配體體外刺激人外周血B細胞可產生B細胞大量持續培養，能從20ml外周血單個核細胞中持續大量培養B細胞。培養活化後的B細胞可以高表達MHC I、MHC II、CD80、CD86等抗原遞呈的必需分子，有效提呈腫瘤細胞裂解物、抗原肽、抗原cDNA，甚至RNA，誘發特異性細胞免疫反應。
文檔編號C12N5/08GK101041815SQ20071002052
公開日2007年9月26日 申請日期2007年3月6日 優先權日2007年3月6日
發明者吳超, 黃祖瑚, 劉勇, 陳廣梅, 陳軍浩 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院