一種基於af146527基因的弓形蟲pcr檢測方法

2023-05-21 23:10:31 1

專利名稱：一種基於af146527基因的弓形蟲pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種弓形蟲PCR檢測方法。
背景技術：
弓形蟲是一種專性細胞內寄生蟲，可寄生於除紅細胞外的所有有核細胞內，可感 染包括人類在內的所有溫血動物(da Silva RC, Langoni H. Parasitol Res，2009，105 (4) 893-898.)。它引起的弓形蟲病是一種嚴重的人獸共患病，其傳播與流行傳播與流行給畜 牧業生產(特別是帶來養豬業)巨大的損失(Dorny P，PraetN, Deckers N, et al. Vet Parasitol，2009，163(3) 196-206 ；Dubey JP. Vet Parasitol，2009，164(2-4) :89_103·)； 同時，對於妊娠婦女、AIDS患者，骨髓移植患者、器官移植受者以及包括腫瘤患者在內的免 疫力低下群體，弓形蟲病則會導致嚴重的後果，對人類健康存在很大的潛在危害，其防治在 愛滋病、移植醫學、圍產醫學等學科中備受關注(Ong EL. Clin Med, 2008,8 (5) 539-543 ； Pereira-Chioccola VL,Vidal JE,Su C. Future Microbiol, 2009，4 1363—1379 ；PeyronF. Mem Inst Oswaldo Cruz,2009,104(2) 316-319 ；Derouin F, Pelloux H ；ESCMIDStudy Group on Clinical Parasitology. Clin Microbiol Infect,2008,14(12) :1089_1101)。 在臨床上，弓形蟲感染多為隱形感染，難以用傳統常規方法偵檢；及時出現臨床症狀的患 者，由於其臨床症狀複雜多變，且多同時伴有其他病變，亦往往造成診斷困難。目前，弓形 蟲感染的診斷方法主要為免疫學診斷方法，檢測弓形蟲抗體，但往往弓形蟲病患者伴有免 疫功能低下，對於這部分免疫功能低下的患者，往往會出現抗體水平的下降，難以用免疫 學方法診斷。而普通病原學檢測方法如直接塗片法的檢出率低下，動物接種和細胞培養 法儘管檢出率高，但操作繁瑣，周期長，並不適合用於臨床診斷。PCR是一種在體外模擬自 然DNA複製過程的核酸擴增技術，具有操作簡單、快速、特異和靈敏的特點。關於弓形蟲的 PCR診斷方法，國內外學者已經進行了大量的研究，其中Bl基因、P30基因及ITS-I基因 等均曾被作為PCR診斷的標靶。弓形蟲基因組中存在一個529bp的重複序列(AF 146527 基因)，其基因組中的拷貝數高達200 300，遠遠高於上述的PCR診斷標靶，因此，以其作 為PCR診斷的標靶可以提高診斷的靈敏性(Homan W L, Vercammen M, DeBraekeleer J, et al. International Journal for Parasitology，2000，30 :69_75)。國外學者曾利用該重 復序列為標靶建立螢光定量PCR診斷方法，獲得較為理想的效果(Homan W L，Vercammen M, De Braekeleer J, et al. International Journal forParasitology,2000, 30 69-75 ； Edvinsson B, Lappalainen MjEvengard B, et al. ClinMicrobiol Infect,2006,12(2) 131-136.)。但螢光定量PCR的設備及試劑成本較高，因此，本領域需要一種敏感特異的普 通PCR檢測方法，以滿足實際工作中弓形蟲感染診斷的需要。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測弓形蟲的PCR方法，通過以下技術方案實現(1)設置PCR檢測試劑盒，試劑盒包括PCR反應管、陽性對照、陰性對照、Taq酶、EB染料、溴酚藍上樣緩衝液(常規濃度)；(2)提取被檢樣本DNA; (3) PCR擴增；(4)擴增產物 分析；其中(1)的PCR反應管內含IOX緩衝液、dNTP、引物1、引物2和MgC12，所述引 物1、引物2系根據弓形蟲AF146527基因序列(SEQ ID NO. 1)設計合成的DNA片段，序列如 下引物 1 5，-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3，(SEQ ID NO. 2) 引物 2 5，-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3，(SEQ ID NO. 3)。所述陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，通過以下方法構建將以弓形蟲 基因組 DNA 為模板，以引物 Tox4[5，-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3，(SEQ ID NO. 4)]、引 物 Tox5[5，-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3，(SEQ ID NO. 5)]擴增獲得的 PCR 產物連接 於pMD18-T載體後經測序驗證獲得的陽性質粒，該質粒含有弓形蟲AF146527基因片段；所述陰性對照為去離子水；其中步驟(2)所述提取被檢樣品DNA，可採用《分子克隆》描述的經典方法提取，亦 可使用上海飛捷生物公司的基因組DNA快速提取試劑盒提取(或其他生物公司的DNA提取 試劑盒提取)；其中步驟⑶所述的PCR擴增是在PCR管中加入步驟⑵提取的被檢樣本DNA，同 時設陽性對照和陰性對照，反應體系為10Xbuffer 5 μ 1，IOmM dNTPO. 25 1· 5 μ l,25mM MgCl22 5μ 1，引物 1(50ρ θ1/μ 1)1 μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1) 1 μ ITaq 酶( υ/μ 1)1 μ 1， 模板DNA 1 μ 1，加去離子水補足至50 μ 1。PCR反應條件為94°C預變性5min後，94°C變性30s，56 63°C退火30s，72 °C延 伸1. 5min，共循環30 45次，最後72°C延伸lOmin。優選反應體系為IOXbuffer 5 μ 1, IOmM dNTP 1 μ l,25mM MgCl22yl，引物 1(50ρ θ1/μ 1)1μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1)1μ l，Taq 酶(IU/μ 1) 1 μ 1，模板 DNAl μ 1，加去離 子水補足至50 μ 1。優選反應條件為94 °C預變性5min後，94 °C變性30s，63 °C退火30s，72 V延伸 1. 5min，共循環30次，最後72°C延伸IOmin0其中步驟(4)所述擴增產物分析，是將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，被檢樣本孔 出現的電泳條帶與陽性對照和陰性對照孔對比，以判斷陽性或陰性。利用本發明優選的PCR反應體系與反應條件，最低可檢出10個拷貝AF146527基 因(即0. 03 0. 05個蟲體)，具有高度的敏感性；同時，本發明對正常小鼠全血、健康志願 者全血、間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲及結核桿菌的基因組DNA擴增均為陰性，僅擴增弓形蟲基 因組DNA結果為陽性，具有高度的特異性。本發明的優點是提供了一種基於弓形蟲基因組中高度重複的AF146527基因的檢 測弓形蟲的PCR檢測方法，可快速、敏感、特異地檢測被檢樣本中的弓形蟲存在與否，適用 於人類和動物弓形蟲感染的篩查、臨床診斷及流行病學調查。


圖1本發明PCR方法的特異性實驗電泳圖。1 弓形蟲；2 正常小鼠全血；3 正常 人全血；4 間日瘧原蟲；5 惡性瘧原蟲；6 結核桿菌；M =DNAmarker
圖2本發明PCR方法的敏感性實驗電泳圖。1 7 分別為10、102、103、104、105、 106、100拷貝數的pMD-18/Tox529bp重組質粒模板的擴增產物；M =DNAmarker
具體實施方式
下面的實施例旨在對本發明進行進一步詳細說明，不當作為對本發明的限制。實施例一弓形蟲PCR檢測方法的建立1.設置PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括(I)PCR管管內含IOX緩衝液、dNTP、引物1、引物2和MgC12，所述引物1、引物2 系根據弓形蟲AF146527基因序列設計合成的DNA片段，序列如下引物 1 5，-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3，引物 2 5，-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3，(2)陽性對照含有目的基因片段的重組質粒。(3)陰性對照去離子水。(4) Taq 酶(5) EB 染料(6)溴酚藍上樣緩衝液(常規濃度)。2.樣本的採集自弓形蟲感染病鼠採取抗凝全血500 μ 1及肝臟、脾臟、淋巴結等 組織，4°C或冷凍保存；3.被檢樣本DNA提取取200μ 1抗凝全血(或Img樣本如肝臟、脾臟、淋巴結置於 研缽，加入生理鹽水Iml，研磨成糊狀，轉移至離心管)，按上海飛捷生物公司的基因組DNA 快速提取試劑盒提取(或其他生物公司的DNA提取試劑盒提取)DNA (亦可按《分子克隆》經 典方法提取DNA)，4°C保存備用；4. PCR擴增在每個PCR檢測管中加入提取的DNA樣品1 μ 1，Taq酶1 μ 1，同樣設陽 性、陰性對照。混勻後稍離心，置於PCR進行擴增，PCR擴增條件94°C預變性5min後，94°C 變性30s，63°C退火30s，72°C延伸1.5min，共循環30次，最後72°C延伸IOmin05. PCR擴增產物分析將瓊脂糖溶於電泳緩衝液，然後加入EB染料，混勻後制膠， 將擴增產物與溴酚藍上樣緩衝液混合，依次加入加樣孔，恆壓電泳。電泳完成後，紫外燈下 觀察樣品孔泳道條帶，並與陽性對照和陰性對照對比，判定被檢樣本弓形蟲陽性或陰性。實施例二 .檢測方法的特異性實驗用經過有效性驗證的弓形蟲DNA、正常小鼠全血、健康志願者全血、間日瘧原蟲、惡 性瘧原蟲及結核桿菌的基因組DNA各1 μ 1為模板，按照本發明方法的優化反應體系和反應 條件進行弓形蟲特異性PCR擴增(擴增條件同實施例一)。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳 分析(同實施例一)。結果僅擴增弓形蟲基因組DNA泳道出現約250bp特異性條帶，為陽性，其餘各對照 DNA泳道均為陰性(見圖1)。實施例三檢測方法的敏感性實驗將構建的含有目的基因的質粒稀釋後作為模板加入PCR反應管，使PCR反應管內 含有目的基因的質粒DNA拷貝數為10° 106，按照本發明方法的優化反應體系和反應條件 進行弓形蟲特異性PCR擴增(擴增條件同實施例一)。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析(同實施例一)，以確定其檢測敏感性。結果表明，該方法最低可 檢出10個拷貝AF146527 基因(即0. 03 0. 05個蟲體)，表明該方法具有較高的靈敏度(見圖2)。
權利要求
一種檢測弓形蟲的PCR方法，其特徵包括以下步驟(1)設置PCR檢測試劑盒，試劑盒包括PCR反應管、陽性對照、陰性對照、Taq酶、EB染料、溴酚藍上樣緩衝液(常規濃度)；(2)提取被檢樣本DNA；(3)PCR擴增；(4)擴增產物分析；其中步驟(1)的PCR反應管內含10×緩衝液、dNTP、引物1、引物2和MgCl2，所述引物1、引物2系根據下述鹼基合成的DNA片段引物1 5』 TGGAGCCACAGAAGGGACAG 3』引物2 5』 GCCATCACCACGAGGAAAGC 3』所述陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，通過以下方法構建將以弓形蟲基因組DNA為模板，以引物Tox4(5』CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG 3』)、引物Tox5(5』 CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATTT 3』)擴增獲得的PCR產物連接於pMD18 T載體後經測序驗證獲得的陽性質粒，該質粒含有弓形蟲AF146527基因片段；所述陰性對照為去離子水；其中步驟(2)所述提取被檢樣品DNA，可採用《分子克隆》描述的經典方法提取，亦可使用上海飛捷生物公司的基因組DNA快速提取試劑盒提取(或其他生物公司的DNA提取試劑盒提取)；其中步驟(3)所述的PCR擴增是在PCR管中加入步驟(2)提取的被檢樣本DNA，同時設陽性對照和陰性對照，反應體系為10×buffer 5μl，10mM dNTP0.25～1.5μl，25mM MgCl22～5μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μl，Taq酶(1U/μl)1μl，模板DNA1μl，加去離子水補足至50μl。PCR反應條件為94℃預變性5min後，94℃變性30s，56～63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循環30～45次，最後72℃延伸10min；其中步驟(4)所述擴增產物分析，是將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，被檢樣本孔出現的電泳條帶與陽性對照和陰性對照孔對比，以判斷陽性或陰性。
2.根據權利要求1所述檢測弓形蟲的PCR方法，其特徵在於PCR反應體系的最佳組 成為 IOXbuffer 5 μ 1, IOmM dNTP 1 μ l,25mM MgCl22 μ 1，引物 1 (50pmol/μ 1) 1 μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1)1μ 1，Taq 酶(IU/μ 1) 1 μ 1，模板 DNA 1 μ 1，加去離子水補足至 50 μ 1。
3.根據權利要求1所述檢測弓形蟲的PCR方法，其特徵在於PCR最佳反應條件為94°C 預變性5min後，94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸1. 5min，共循環30次，最後72°C延 伸 IOmin0
4.根據權利要求1所述檢測弓形蟲的PCR方法，其特徵在於檢測樣品中弓形蟲的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種弓形蟲PCR檢測方法。以弓形蟲基因組DNA為模板，採用本發明設計的引物，以本發明優化的PCR體系和條件進行PCR反應，擴增高度重複的弓形蟲特定的AF 146527基因的部分片段，可快速、特異、敏感地檢測出樣本中的弓形蟲，為人類和動物弓形蟲病的篩查與臨床診斷及流行病學調查簡單、快速、準確的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101962674SQ20101023775
公開日2011年2月2日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者夏惠, 孫新, 徐家森, 方強, 沈繼龍, 王雪梅, 陳興智, 齊文娟 申請人:蚌埠醫學院