幽門螺桿菌診斷試劑盒及其檢測方法
2023-05-21 23:31:41 1
專利名稱：幽門螺桿菌診斷試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種幽門螺桿菌診斷試劑盒及其檢測方法，屬於細菌的檢測技術 領域。
背景技術：
自從澳大利亞學者Marshall等1983年首次從胃炎患者的胃黏膜中分離到幽門螺 桿菌(Helicobacter pylori,HP)後，經過20多年的發展，有關幽門螺桿菌臨床檢測的研究 取得了長足進步。截止目前為止，主要有快速尿素酶試驗，細菌培養，活檢標本切片染色，直 接圖片染色和聚合酶鏈反應(PCR)JI 13，碳14呼吸試驗，血清免疫學檢測，尿素排洩試驗 等，各種方法各有優缺點。焦磷酸測序是近年來發展起來的一種快速，簡便，高通量的短序 列測序方法，本試驗將其應用於幽門桿菌的鑑定及耐藥性分析，具有準確，特異，快速及高 通量的優點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的不足，提供一種幽門螺桿菌診 斷試劑盒。本發明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括(1)特異性擴增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；(3)特異性擴增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO :4和SEQID NO :5所示的引物對;(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；其中，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3均在5，端標記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。上述幽門螺桿菌診斷試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS ；其中，裂解液具體包括Chelex(g/mL)5%，Tricine 30mM，辛酸鈉150mM，鹽酸胍 150mM, Triton 0. 1% (ν/ν)；生理鹽水具體為0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液；PBS具體包括 NaCll. 37M, KCl 27mM, Na2HPO4IOOmM, KH2P0420mM。(2) PCR 反應液:PCR Buffer，特異引物 SEQ ID NO 1 610uM, MgCl225mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；其中，PCRBuffer 包括 0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (g/mL)BSA, 0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。
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(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris-Acetate, 結合緩衝液，退火緩衝液；其中，結合緩衝液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween20 ；退火緩衝液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒 光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括上述所有核苷酸序列的鹼基互補序列，也就 是包括(1)特異性擴增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示；(3)特異性擴增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID N0:10和 SEQID NO 11所示引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示；其中，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9均在5，端標記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。上述幽門螺桿菌診斷試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS ；其中，裂解液具體包括Chelex(g/mL)5%，Tricine 30mM，辛酸鈉150mM，鹽酸胍 150mM, Triton 0. 1% (ν/ν)；生理鹽水具體為0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液；PBS具體包括 NaCll. 37M, KC127mM, Na2HPO4IOOmM, KH2P0420mM。(2) PCR 反應液:PCR Buffer，特異引物 SEQ ID NO 7 1210uM, MgCl225mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；其中，PCRBuffer 包括 0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (g/mL)BSA, 0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 結合緩衝液，退火緩衝液；其中，結合緩衝液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (ν/ν) Tween20 ；退火緩衝液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒 光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，包括如下步驟(1)幽門螺桿菌DNA模板的提取；(2)以步驟(1)所得的DNA為模板再按特異性擴增幽門螺桿菌引物進行PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物以標記生物素的引物序列進行單鏈純化；(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產物進行測序；(5)結果分析。步驟(1)中，所述的幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg胃黏膜 組織，加ImL生理鹽水在研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌3次後13000rpm離心沉澱，加50 μ L裂解液，100°C IOmin, 13000rpm離 心，上清即為DNA模板。步驟(2)中所述的PCR擴增具體方法為50 μ L 體系=Template 5 μ L，10 X PCR Buffer 5 μ L, MgCl24 μ L, dNTP 1 μ L, SEQ ID NO 11 μ L, SEQ ID NO :21 μ L，5U/μ L Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH20 32.6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR 擴增條件:95 V 3min ；95 V 30s，45°C 30s, 72 °C 45s, 50 個循環；72°C 3min, 16 °C 30min。有益效果本發明方法對幽門螺桿菌16S片段進行特異性測序，把測得的幽門螺 桿菌特徵性序列5' -CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3 『作為鑑定標準，其與常規的鑑定方法相 比，敏感度為93. 3%，特異性100%。因此，該法在臨床上快速，特異，高通量的鑑定幽門螺 桿菌具有廣闊的應用前景。本發明的試劑盒通過檢測23S上的2142和2143位點就可以預 測幽門螺桿菌是否耐藥，對幽門螺桿菌臨床用藥具有很好的指導作用。本實驗將焦磷酸技 術應用於HP 23S的2142和2143位點SNP檢測，能在5分鐘內檢測96個樣品，具有結果準 確，耗時短，高通量的諸多優點。
圖1是幽門螺桿菌陽性標本16S rDNA測序結果圖。圖2是幽門螺桿菌陽性標本23S rDNA耐藥測序結果圖，為野生型的非耐藥菌株即 2142和2143位點均為A。克拉黴素耐藥菌23S rDNA 2142及2143位點A突變成G時前三 個鹼基分別為GAA, (2142位點A — G)，或AGA, (2143位點A — G)。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 試劑盒的製備。(I)DNA 提取試劑裂解液:Chelex5%(g/mL)(購於 Bio-rad 公司)，Tricine 30mM(購於 Merck 公 司)，辛酸鈉150mM (購於上海西寶生物科技有限公司)，鹽酸胍150mM (購於美國Sigma公 司)，Triton 0. 1% (ν/ν)(購於美國 Sigma 公司)；生理鹽水0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液(氯化鈉購於上海試四赫維化工有限公司)；PBS =NaCl 1. 37M(購於上海試四赫維化工有限公司)，KC1 27mM(購於上海試四赫 維化工有限公司)，Na2HP04100mM(購於上海試四赫維化工有限公司)，KH2P0420mM(購於上 海試四赫維化工有限公司)。(2) PCR 反應液PCR Buffer 0. 1% (v/v)NP_40 (購於美國 Sigma 公司),0. 02% (ν/ν)明膠(購 於美國 Sigma 公司)，0.06% (g/mL) BSA (購於美國 Sigma 公司)，0. 1 % (v/v) Tween-20 (購 於美國 Sigma 公司)，0· 06M pH8. 9Tricine (購於 Merck 公司)；25mM MgCl2 購於美國 Sigma 公司；
IOmM dNTPs 購於上海鼎國生物技術有限公司；5U/uLTaq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液無水乙醇購自安徽安特生物化學有限公司；0. 2Μ NaOH 購於上海試四赫維化工有限公司；IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 購於美國 Sigma 公司，無水乙酸購於杭 州化學試劑有限公司；結合緩衝液由IOmM Tris-HCl (Tris_base購於美國Sigma公司，鹽酸購於杭州化 學試劑有限公司)，2M NaCl (購於上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購於杭州化學 試劑有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (購於美國Sigma公司)組成。退火緩衝液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 購於美國 Sigma 公司， 無水乙酸購於杭州化學試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購於上海試四赫維化工有限公司)組 成。(4)測序試劑DNA聚合酶購於德國Qiagen公司；ATP硫酸化酶購於德國Qiagen公司；螢光素酶購於德國Qiagen公司；三磷酸腺苷雙磷酸酶購於德國Qiagen公司；底物APS 購於德國Qiagen公司；螢光素購於德國Qiagen公司；四種 dNTP (dATP α S, dTTP, dCTP, dGTP)購於德國 Qiagen 公司。實施例2 檢測方法。(1)幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg人體胃黏膜組織，加ImL 生理鹽水在研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL EP管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS 洗滌3次後13000rpm離心沉澱，加50 μ L裂解液，100°C IOmin, 13000rpm離心，上清即為 DNA模板；(2)以步驟⑴所得的DNA為模板再按特異性擴增幽門螺桿菌引物在 Thermolcycler S1000 (美國bio_rad公司)上進行PCR擴增，具體方法如下50μ L 體系Template 5 μ L, IOXPCRBuffer 5 μ L, MgCl24 μ L, dNTP 1 μ L, SEQ IDNO 11 μ L，SEQ ID NO 21 μ L,5U/uL Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L，ddH20 32. 6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR 擴增條件:95 V 3min ；95 V 30s，45°C 30s, 72 °C 45s, 50 個循環；72°C 3min, 16 °C 30min。(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物以標記生物素的引物序列進行單鏈純化；即 將步驟(2)中得到的50uL PCR擴增產物與3uL sepharoe beads (購於美國GE公司)及47ul 結合緩衝液在一個Eppendorf管中震蕩混合lOmin，然後用Vaccuum pr印workstation系統 (PyroMark ID， 惠 15 Qiagen 公司)中的 vaccuum prep tool sepharosebeads,^n^pff 有 beads 的 vaccum prep tool 依次在 75% 乙醇,0. 2M NaOH 溶液，IOmMTris-Acetate 溶液 中清洗10秒，將vacuum prep tool放入含有IuL測序引物和49uL退火緩衝液的PSQ96 (購於德國Qiagen公司)板中，釋放sepharose beads，將該PSQ96板放在ThermoPlate (購於 德國Qiagen公司)上加熱到80°C 2mie，再冷卻至室溫，即得到可進行後續測序反應的單鏈 純化產物。(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產物進行測序，測序按照儀器(PyroMark ID, QIAGEN公司)說明書操作；(5)結果分析，測序結果與幽門螺桿菌特徵性序列 「5' -CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3 『 」或「5' -CGCACAATCAGCGTCAG TAA-3 『 」(圖 1)比對 鑑定幽門螺桿菌。幽門螺桿菌對克拉黴素耐藥性的鑑定，通過對幽門螺桿菌23S rDNA中 A2142G及A2143G兩個位點的多態性分析來鑑定幽門螺桿菌是否對克拉黴素耐藥(圖2)， 野生型的非耐藥菌株2142和2143位點均為A。克拉黴素耐藥菌23S rDNA 2142及2143位 點A突變成G時前三個鹼基分別為GAA, (2142位點A — G)，或AGA, (2143位點A — G)。以養和生物科技有限公司14C-尿素呼氣試驗試劑盒為參照，本發明試劑盒能穩 定檢出的幽門螺桿菌按收集的呼氣樣品每分鐘衰變數(dpm)計算最小量為ISOdpm;根據 14C-尿素呼氣試驗試劑盒標準，呼氣樣品的每分鐘衰變數(dpm) >200dpm為幽門螺桿菌陽 性；150 200dpm為可疑陽性； 200dpm的50例 樣品經本試劑盒檢測均為陽性，10例其它微生物包括6例其它細菌，4例真菌樣品，檢測，重 復檢測結果均為陰性。
權利要求
一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特徵在於它包括(1)特異性擴增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；(3)特異性擴增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO4和SEQIDNO5所示的引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示；其中，SEQ ID NO1和SEQ ID NO3均在5』端標記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。
2.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特徵在於它包括如下試劑(1)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS；(2)PCR反應液:PCR Buffer,特異引物 SEQ ID NO 1 610uM, MgCl2 25mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，結合 緩衝液，退火緩衝液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，螢光素 和 dNTP。
3.—種幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特徵在於它包括權利要求1所述的所有核苷酸序列 的鹼基互補序列，也就是包括(1)特異性擴增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQID NO 7和SEQ ID NO 8所示 引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 9所示；(3)特異性擴增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQID NO 10和SEQID NO: 11所示引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 12所示；其中，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9均在5，端標記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。
4.根據權利要求3所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特徵在於它包括如下試劑(1)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS；(2)PCR反應液:PCR Buffer,特異引物 SEQ ID NO 7 1210uM, MgCl2 25mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，結合 緩衝液，退火緩衝液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，螢光素 和 dNTP。
5. 一種幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)幽門螺桿菌DNA模板的提取；(2)以步驟(1)所得的DNA為模板再按特異性擴增幽門螺桿菌引物進行PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物以標記生物素的引物序列進行單鏈純化；(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產物進行測序；(5)結果分析。
6.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特徵在於步驟(1)中 所述的幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg胃黏膜組織，加ImL生理鹽水在 研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌3次 後13000rpm離心沉澱，加50 μ L裂解液，100°C lOmin，13000rpm離心，上清即為DNA模板。
7.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特徵在於步驟(2)中 所述的PCR擴增具體方法為50 μ L 體系Template 5 μ L, IOXPCR Buffer 5 μ L, MgCl2 4μ L, dNTP 1 μ L, SEQ ID NO 1 1 μ L, SEQ ID NO 2 IyL, 5U/uL Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L，ddH20 32. 6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR擴增條件95°C 3min ；95°C 30s, 45°C 30s, 72°C 45s，50 個循環；72°C 3min, 16°C 30mino
全文摘要
本發明公開了一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括特異性擴增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；特異性擴增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的引物對；幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示。本發明還公開了應用上述幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法。本發明將焦磷酸技術應用於HP 23S的2142和2143位點SNP檢測，能在5分鐘內檢測96個樣品，具有結果準確，耗時短，高通量的諸多優點。
文檔編號C12Q1/04GK101921827SQ20101010150
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月27日 優先權日2010年1月27日
發明者任緒義, 呂江峰, 王棟梁, 虞閏六 申請人:南京迪安醫學檢測中心有限公司