副豬嗜血桿菌實時螢光定量pcr檢測方法

2023-05-21 23:22:26

專利名稱：副豬嗜血桿菌實時螢光定量pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及螢光定量PCR檢測，尤其是一種副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)屬於巴氏德菌科嗜血桿菌屬。HPS通常定植在豬上呼吸道，正常條件下不引起豬發病，但是當機體處於應激狀態或免疫功能下降時可以突破上呼吸道的防禦機制，侵入機體多個器官，引起多發性漿膜炎、關節炎，嚴重者導致體溫升高、呼吸困難甚至死亡，給養豬業帶來巨大的經濟損失。目前對HPS的診斷主要是細菌分離培養和常規PCR方法。HPS的培養條件要求高，需要NAD、馬血清和5% CO2環境，培養時間需M 48h，在分離培養過程中常常出現雜菌汙染。普遍使用的Oliverira等建立的PCR方法(0LIVEIRA S, GALINA L, PIJOAN C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J]. J Vet Diagn Invest, 2001,13 :1495-1501)雖然可以直接對病料進行檢測，但檢測費時且不能準確定量和存在假陽性的可能。實時螢光PCR是一種對DNA數量進行檢測分析的PCR技術，具有操作簡便、敏感性和特異性強、重複性好等優點，而且結果具有實時性，更準確直觀，已廣泛應用於基因的表達檢測和定量研究中。於江等人指出16SrRNA基因序列不宜用作螢光定量PCR檢測，並建立了以infB基因作為靶基因的HPS螢光定量PCR檢測技術(於江，吳家強等.副豬嗜血桿菌螢光定量PCR檢測技術的建立與應用.家畜生態學報.2010,31 ) :77-81)。但是，該研究僅限於HPS血清5型，對其它血清型的通用性未作有效驗證，而且其方法只能區分副豬嗜血桿菌和鏈球菌及巴氏桿菌，抗相關菌幹擾能力有限。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、準確、通用性好、抗幹擾能力強的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法。為解決上述技術問題本發明採用如下技術方案副豬嗜血桿菌實時螢光定量 PCR檢測方法，即通過螢光染料嵌合PCR反應中所發出的螢光信號進行檢測，以登錄號 AB004028的副豬嗜血桿菌的16S rRNA基因序列為參考，其引物序列和擴增序列分別為引物序列 1 5，-GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3，引物序歹Ij 2 5，-CTA GAG ATC GTC GGC TTG-3，擴增序列為序列表SEQ. ID. No. 3的鹼基序列。上述方法包括如下步驟製備DNA樣本取待檢樣本進行總DNA的提取純化；實時螢光定量PCR反應取步驟所得DNA樣本作為模板進行螢光PCR擴增，並同時分別以標準品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行螢光PCR擴增；建立標準曲線取已知濃度的標準品DNA按10倍稀釋法稀釋成5X IO7 5 X 10°拷貝/ μ L 8個濃度梯度，按步驟的PCR反應體系和反應程序進行擴增，反應結束後，根據得到的各濃度梯度的循環閾值Ct繪製螢光定量PCR標準曲線；將DNA樣本的循環閾值Ct與標準曲線對照，得到待檢DNA樣本中的16S rRNA基因片段拷貝濃度，據此得到樣本中的副豬嗜血桿菌的細菌數量。螢光定量PCR反應的反應體系、擴增程序和測定擴增片段的熔解程序分別為反應體系:PCR混合液20μ L，其中STOR GreenI Mix 9 μ L、5pmol/μ L的上下遊引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去離子水7. 9 μ L ；擴增程序95°C 5min，隨後進行40個循環，每個循環包括95°C 20s,62°C 20s, 68°C 20s ；測定擴增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升溫速率從55°C升至95°C進行熔解曲線分析驗證。本發明根據HPS血清型較多的特點，選取具有高度保守性和特異性且是細菌分類鑑定主要靶基因的16S rRNA基因(GENBANK登錄號AB004028)作為擴增靶基因，以該基因屬內高度保守區域作為擴增區域設計特異性引物，建立了螢光染料SYBR Green I與DNA嵌合的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法。由於螢光信號強度與擴增片段的數量成正比，通過已知標準品的標準曲線可對豬嗜血桿菌16S rRNA基因初始模板的DNA進行準確定量，而該基因系細菌染色體上的一段DNA序列，細菌染色體為單倍體，因此16S rRNA基因的拷貝數可以等同於細菌的數量。另外，與常規PCR相比，實時螢光PCR的核酸擴增和檢測都在同一管內進行，通過螢光信號判斷擴增片段是否擴增，無需電泳檢測，解決了 PCR假陽性和核酸染料溴化乙錠對環境的汙染問題。最後，本方法通用性強、特異性高，能夠檢測多種 HPS血清型，而又不受豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌DH5a和豬傷寒沙門氏菌等相關菌的影響。綜上所述，本發明可用於快速準確地對嚴重危害養豬業發展的副豬嗜血桿菌進行定量檢測。


圖1是本發明所用引物的定性PCR電泳圖，圖中1為分子量標記DNA Marker 1 (600bp) ；2為HPS血清4型；3為HPS血清5型；4為HPS血清9型；5為HPS血清14型。圖2是本發明的熔解曲線分析圖。圖3是本發明的PCR擴增動力曲線，圖中1為5 X IO7拷貝/ μ L ；2為5 X IO6拷貝 /^1^3為5父105拷貝/^1^4為5父104拷貝/ μ L ;5為5X IO3拷貝/ yL;6為5Χ102拷貝/yL;7 為 5X101 拷貝/yL。圖4是本發明的標準曲線圖。圖5是本發明的特異性試驗圖，圖中1為HPS血清5型；2為HPS血清9型；3為 HPS血清14型；4為HPS血清4型；5為其它細菌豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌DH5a、豬傷寒沙門氏菌。圖6是本發明的重複性試驗圖，圖中1為IO7拷貝/μ L ；2為IO5拷貝/μ L ；3為 IO3 拷貝 / μ L。
圖7是本發明副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法的流程圖。圖8是本發明實時螢光PCR的臨床檢測結果圖，圖中1為心包液1，2為心包液2， 3為心包液3，4為心包液4，5為心包液5，6為關節液1，7為關節液2，8為關節液3，9為關節液4，10為關節液5。
具體實施例方式副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法的研究1材料與方法1. 1主要儀器和試劑iCycler iQ5螢光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；常規PCR儀購自日本TaKaRa 公司；凝膠成像系統購自美國Alpha Inotech公司；ND-1000微量紫外分光光度計購自美國 Thermo公司。RealMasterMix螢光定量PCR試劑盒(STOR)、細菌基因組DNA提取試劑盒、 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司； PCR Taq Mix, DNA Marker 1購自廣東東盛生物科技有限公司；PMD-18T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；TSA瓊脂培養基購自北京陸橋技術責任有限公司；馬血清購自美國 Hylone公司；NAD購自北京索萊寶科技有限公司。1. 2 菌株HPS血清4型、5型、9型和14型；豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌DH5a、 豬傷寒沙門氏菌由本實驗室保存。1.3引物設計以HPS的16S rRNA基因序列(AB004028)為參考，應用引物設計軟體DNA STAR和 01igo6.0對多種細菌的16S rRNA基因進行分析，選擇HPS的16S rRNA基因屬內保守區作為擴增區域，設計一對引物，擴增片段(見序列表SEQ. ID. No. 3)長度為136bp。引物序列為 5，-GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3』 (見序列表 SEQ. ID. No. 1)和 5』 -CTA GAG ATC GTCGGC TTG-3』 (見序列表SEQ. ID. No. 2)，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物具體參數如表1。表1引物參數表
引物名稱位點長度GC%Tm值序列產物長度HPS-2F1491855.665.8GACGGG AAACTGTCGCTA136 bpHPS-2R2671855. 663.0CTAGAG ATCGTCGGCTTG1. 4模板DNA的製備挑取HPS單個菌落在含5 %馬血清和0. 4mg/mL NAD的TSA瓊脂培養基上劃線，置於5% CO2環境中37°C培養36h，生理鹽水洗脫細菌，用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提細菌DNA，提取方法按說明書進行。1.5定性PCR擴增 採用設計的HPS弓丨物對抽提的DNA模板進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L，包括PCR Taq Mix 12 μ L、上下遊引物 Q5pmol/yL)各 lyL，模板 DNA 5 μ L，超純水 31 μ L。反應條件為95°C預變性5min ；35個循環的95°C 20S，60°C 20S，72°C 20S，最後72°C延伸5min。1. 6標準陽性質粒的製備PCR產物於2 %的瓊脂糖凝膠電泳後，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產物。PCR產物與PMD-18T載體過夜連接後轉化大腸桿菌DH5a。用小量質粒提取試劑盒提取轉化長出的菌落質粒，陽性質粒經PCR和雙酶切鑑定後送上海英駿生物技術有限公司測序。將測序正確的陽性質粒用紫外分光光度計測定純度後，按公式拷貝數=(質粒濃度/質粒分子質量)X阿佛德羅常數(6.02X 1023)計算質粒的拷貝數。將5X109拷貝/ μ L的質粒進行10倍梯度稀釋，分別以5 X IO7 5 X 10°拷貝/ μ L的質粒作為標準品用於實時螢光PCR。1. 7實時螢光PCR方法的建立採用棋盤法篩選引物濃度(2. 5 25pmol/ μ L)和PCR退火溫度(58 62°C )，以在最小的循環閾值(Ct)內得到最大的螢光信號來優化實時螢光PCR最佳的反應條件。實時螢光PCR結束後，從55 95°C按每0. 5°C /IOs測定吸光值進行熔解曲線分析，確定PCR 是否為特異性擴增。1.8標準曲線的建立分別以濃度為5X IO7 5X 10°拷貝/ μ L的質粒標準品為模板，採用優化的反應條件進行實時螢光PCR。Ct閾值設定原則為超過陰性對照擴增曲線(無規則噪音線)的最高點，Ct值> 35為陰性，Ct值< 35為陽性。螢光定量PCR儀會根據每個濃度標準品測得的Ct值，以標準品拷貝數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線。1. 9實時螢光PCR方法的特異性和重複性試驗分別提取HPS血清4型、5型、9型和14型，豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌DH5a、豬傷寒沙門氏菌的DNA進行實時螢光PCR，以評價方法的特異性。 用建立的方法分別對ΙΟ3、105、IO7拷貝/ μ L的質粒進行檢測，每個濃度樣品重複3 次，根據每個濃度的Ct進行變異係數的計算，以評價方法的重複性。2 結果2. 1目的片段的克隆和鑑定如圖1所示，用設計的HPS弓丨物分別對HPS血清4型、5型、9型和14型的DNA進行PCR擴增，PCR產物電泳後出現與預期擴增長度相同的片段。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收後，與PMD-18T載體過夜連接並轉化大腸桿菌DH5a。獲得的陽性質粒經PCR和雙酶切鑑定後送上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果與參考序列完全一致。2. 2實時螢光PCR方法的建立採用棋盤法對PCR退火溫度和引物濃度進行優化，獲得了實時螢光PCR最佳反應體系和條件。總反應體系為20 μ L，其中RealMasterMix 9yL、上下遊引物(5pmol/yL)各 0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及超純水7. 9 μ L。反應條件為95°C預變性5min ；隨後進行40 個 95°C 20s, 62°C 20s, 68°C 20s 的循環。如圖2所示，實時螢光PCR後進行熔解曲線分析以確定反應是否為特異性擴增。 熔解曲線只形成一個特異峰，Tm為84. 5°C，表明沒有非特異性產物的擴增和引物二聚體形成，PCR反應條件得到了很好的優化，數據可以用於定量換算。2. 3標準曲線的建立抽提陽性質粒，測其OD26tZOD28tl值為1.93。計算陽性質粒拷貝數，將5 X IO9拷貝 /μ L的質粒進行10倍梯度稀釋作為標準品，採用優化的反應條件進行實時螢光PCR擴增， 螢光定量PCR儀根據各個標準品測得的Ct值自動生成實時螢光PCR的擴增動力曲線(見圖3)和標準曲線(見圖4)。擴增動力曲線顯示，當模板濃度為5X IO1拷貝/ μ L時，有螢光擴增曲線；而模板濃度為5 X 10°拷貝/ μ L時，沒有擴增曲線，表明該方法檢測最低極限為5 X IO1拷貝/ μ L。 標準曲線公式為Ct = -3.410Xlog拷貝數+25. 346，標準曲線的斜率為-3. 410，截距為 25. 346，相關係數(R2)為0.998。通過從儀器讀取待測樣本的Ct值，代入標準曲線公式可以換算出其初始細菌拷貝數。2. 4特異性試驗以HPS血清4型、5型、9型和14型，豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 DH5a、豬傷寒沙門氏菌的DNA為模板進行實時螢光PCR，如圖5所示，擴增曲線圖顯示只有 HPS血清4型、5型、9型和14型的檢測達到Ct閾值，其它細菌無擴增曲線，表明建立的實時螢光PCR有較高的特異性。2. 5重複性試驗用建立的方法分別對ΙΟ3、105、IO7拷貝/ μ L的質粒進行檢測，每個濃度樣品重複3 次。如圖6所示，擴增曲線圖顯示每個濃度樣品的擴增曲線幾乎重疊，誤差很小，經計算每個濃度樣品重複性的變異係數均小於2%，表明建立的實時定量PCR具有較好的重複性和穩定性。實施例臨床樣品的檢測用建立的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法(方法Α)對臨床採集的10份疑似HPS感染的心包液、關節液進行檢測，並與細菌分離培養(方法B)和常規PCR(方法C) 進行比較。如圖7所示，副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法具體步驟如下製備DNA樣本取待檢樣本進行總DNA的提取純化；心包液處理吸取10微升心包液加入到裝有100微升超純水的EP管中，煮沸 IOmin, 12000rpm離心5min，取上清3微升作為DNA模板。關節液處理吸取10微升關節液加入到裝有100微升超純水的EP管中，煮沸 IOmin, 12000rpm離心5min，取上清3微升作為DNA模板。實時螢光定量PCR反應取步驟所得DNA樣本作為模板在實時螢光定量 PCR儀上進行螢光PCR擴增，並同時分別以標準品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行螢光PCR擴增，其中螢光定量PCR反應的反應體系、擴增程序和測定擴增片段的熔解程序分別為反應體系PCR混合液20 μ L，其中STOR Green I Mix 9 μ L、5pmol/ μ L的上下遊引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去離子水7. 9 μ L ；擴增程序95°C 5min,隨後進行40個循環，每個循環包括95°C 20s,62°C 20s, 68°C 20s ；
測定擴增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升溫速率從55°C升至95°C進行熔解曲線分析驗證。建立標準曲線取已知濃度的標準品DNA按10倍稀釋法稀釋成5X IO7 5X 10°拷貝/ μ L 8個濃度梯度，按步驟的PCR反應體系和反應程序在實時螢光定量 PCR儀上進行擴增，反應結束後，根據得到的各濃度梯度的循環閾值Ct採用計算機自動繪製螢光定量PCR標準曲線(如圖4)；將DNA樣本的循環閾值Ct (如圖8)與標準曲線對照，得到待檢DNA樣本中的16S rRNA基因片段拷貝濃度，據此得到樣本中的副豬嗜血桿菌的細菌數量。採用三種方法的臨床樣品檢測結果如表2 表2三種HPS檢測方法比較
方法方法A方法B方法C臨床樣^^^細菌數量細菌數量陰性/陽性心包液11.66 X IO71. 71 X IO7陽性心包液21.77 X IO81. 64 X IO8陽性心包液31.88 X IO81.84X108陽性心包液41.99 X IO71. 96 X IO7陽性心包液51.27X1071. 31 X IO7陽性關節液11.89 X IO91.85X109陽性關節液25.4X1085. 67 X IO8陽性關節液31.54X IO71.41 X IO7陽性關節液42.41 X IO72. 33 X IO7陽性關節液51.57 X IO81. 61 X IO8陽性吉果顯示，三種檢測方法檢測結果--致，即所有臨床樣i品都為HPS陽性。螢光定量
PCR方法和細菌平板計數所測細菌數量基本一致，而傳統PCR方法不能定量。
上述研究表明，本方法對HPS強毒力(5型和14型)、中等毒力G型)和低毒力 (9型)菌株的檢測結果都為陽性，證實了方法在HPS血清型檢測上的通用性。此外，本方法還具有較高的特異性，只能檢測HPS，而不能檢測豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 DH5a和豬傷寒沙門氏菌。同時，本研究根據16S rRNA基因質粒建立的標準曲線，線性範圍廣，在5X IO7 5X IO1拷貝/ μ L時呈現良好的線性關係，相關係數(R2)為0. 998，最小檢測極限達5X IO1拷貝/μ L。重複性試驗證實方法具有較高的重複性和穩定性，變異係數均小於2%。本方法檢測臨床樣品與細菌分離培養和常規PCR鑑定結果相一致，但操作更簡單和快速，在1. 內即可得到檢測結果。因此，本發明的HPS實時螢光定量PCR檢測方法具有快速、靈敏、準確和穩定的特點，可用於HPS感染的臨床快速檢測。
權利要求
1.一種副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法，通過螢光染料嵌合PCR反應中所發出的螢光信號進行檢測，其特徵在於以登錄號AB004(^8的副豬嗜血桿菌的16S rRNA基因序列為參考，其引物序列和擴增序列分別為引物序列 1 5』 -GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3』引物序列 2 5』 -CTA GAG ATC GTC GGC TTG-3』擴增序列為序列表SEQ. ID. No. 3的鹼基序列。
2.根據權利要求1所述的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於所述方法包括如下步驟製備DNA樣本取待檢樣本進行總DNA的提取純化；實時螢光定量PCR反應取步驟所得DNA樣本作為模板進行螢光PCR擴增，並同時分別以標準品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行螢光PCR擴增；建立標準曲線取已知濃度的標準品DNA按10倍稀釋法稀釋成5X IO7 5X 10° 拷貝/ μ L 8個濃度梯度，按步驟的PCR反應體系和反應程序進行擴增，反應結束後，根據得到的各濃度梯度的循環閾值Ct繪製螢光定量PCR標準曲線；將DNA樣本的循環閾值Ct與標準曲線對照，得到待檢DNA樣本中的16S rRNA基因片段拷貝濃度，據此得到樣本中的副豬嗜血桿菌的細菌數量。
3.根據權利要求2所述的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於所述螢光定量PCR反應的反應體系、擴增程序和測定擴增片段的熔解程序分別為反應體系PCR混合液20μ L，其中STOR Green I Mix 9 μ L、5pmol/μ L的上下遊引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去離子水7. 9 μ L ；擴增程序95 V 5min,隨後進行40個循環，每個循環包括95 °C 20s, 62 V 20s, 68°C 20s 測定擴增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升溫速率從55°C升至95°C進行熔解曲線分析驗證。
全文摘要
本發明公開了一種副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法，選取具有高度保守性和特異性且是細菌分類鑑定主要靶基因的16S rRNA基因(AB004028)作為擴增靶基因，以該基因屬內高度保守區域作為擴增區域設計特異性引物，建立了螢光染料SYBR GreenI與DNA嵌合的副豬嗜血桿菌實時螢光定量PCR檢測方法，通過已知標準品的標準曲線可對豬嗜血桿菌16S rRNA基因初始模板的DNA進行準確定量，並等同於細菌的數量。本發明的方法通用性強、特異性高，能夠檢測多種HPS血清型，而又不受相關菌的影響，可用於快速準確地對嚴重危害養豬業發展的副豬嗜血桿菌進行定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102174653SQ20111004871
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月1日 優先權日2011年3月1日
發明者彭昊, 李軍, 楊威, 潘豔, 禤雄標, 胡帥, 許力幹, 謝宇舟, 謝永平, 陳澤祥, 馬春霞 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所