一種用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子及其製法和用途的製作方法
2023-05-21 22:56:06 1
本發明屬於生物醫用材料領域，具體涉及一種用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子及其製法和用途。
背景技術：
錳是一種順磁性過渡金屬，可用作磁共振顯影的新型對比劑。與臨床上常用的釓類對比劑相比，錳類對比劑的生物安全性更好。錳可以錳鹽、配位化合物、氧化物納米粒等多種形式存在，其中二氧化錳納米粒子最具應用前景。究其原因，主要是因為二氧化錳納米粒子作為磁共振顯影的對比劑在腫瘤組織微環境中能夠轉化成具有弛豫增強效果的二價錳離子，進而實現針對腫瘤部位的特異性成像(Nature Nanotechnology,2016,doi:10.1038/nnano.2016.72)。但二氧化錳粒子本身易團聚、難以在水體系中均勻分散，因而很難直接用作磁共振成像的對比劑。為此，目前國內外多採用聚烯丙基胺、聚乙二醇衍生物等水溶性合成類聚合物修飾改性二氧化錳納米粒子(Prasad P,et al.ACS Nano,2014,8:3202；Kim T,et al.Journal of the American Chemical Society,2011,133:2955)。但尚存在以下主要問題：一是所用水溶性聚合物大都難以生物降解，一些陽離子聚合物還具有一定的生物毒性；二是有關修飾改性涉及多步反應，過程繁雜，難以分離純化和批量生產；三是修飾改性後的二氧化錳納米粒子均缺乏腫瘤靶向性，實際應用時還需藉助另外的化學反應引入腫瘤靶向因子。
技術實現要素：
為克服上述不足，本發明的目的之一是提供一種磁共振顯影用多糖雜化二氧化錳納米粒子的製備方法，即利用具有優良水溶性、生物相容性和可生物降解性的透明質酸或透明質酸鈉在水溶液中原位還原高錳酸鹽，一步法製備多糖雜化二氧化錳納米粒子。其中，所用透明質酸或透明質酸鈉既作為有關雜化型納米粒子製備的還原劑，也作為有關雜化型納米粒子在水體系中分散的穩定劑，同時還作為腫瘤靶向因子，具有多功能特徵。所述的透明質酸或透明質酸鈉靶向性是由於其特異性受體CD44在膠質瘤、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織部位中呈現高表達。
本發明的另一目的在於提供一種由上述製備方法製得的用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子。
本發明的另一目的是提供上述用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子的應用。
本發明目的通過以下技術方案實現：
一種用於磁共振顯影成像的多糖雜化二氧化錳納米粒子的製備方法，包括以下步驟：將多糖水溶液與高錳酸鹽溶液在一定溫度下，按照一定比例充分混合均勻；然後進行水熱反應；反應完成後，將反應生成的分散液透析洗滌，即得到多糖雜化二氧化錳納米粒子。
所述多糖水溶液中的多糖與高錳酸鹽溶液中的高錳酸鹽的質量比為1:0.01～1。多糖水溶液與高錳酸鹽溶液優選在室溫20-40℃混合。
所述水熱反應的溫度優選為20～90℃，時間優選為0.2～3h。
所述多糖水溶液質量分數為0.05％～10％。所述多糖水溶液是通過將多糖在20～70℃、pH＝3～9下用水充分溶解製得。
所述多糖水溶液中的多糖優選為具有優良水溶性、生物相容性和可生物降解性的透明質酸或透明質酸鈉。
所述多糖的分子量優選為5～500KDa。
所述高錳酸鹽溶液質量分數優選為0.01％～5％。
所述高錳酸鹽溶液中的高錳酸鹽優選為高錳酸鈉或高錳酸鉀。
本發明還提供了一種由上述製備方法製得的用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子。所得多糖雜化二氧化錳納米粒子可在水中均勻分散，安全低毒。
上述用於磁共振顯影的多糖雜化二氧化錳納米粒子適用於膠質瘤、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織部位的磁共振成像，還可通過所用多糖組分化學偶聯抗腫瘤藥物，達到診療一體化的目的。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
本發明所涉及的製備方法和流程簡單、易於操作、反應條件溫和、成本低廉，可應用於工業化大批量生產。
本發明所製備的二氧化錳雜化型納米粒子可以較好地分散在水溶液中，並且保持較長時間的穩定，同時具有較好的生物相容性且自帶腫瘤靶向性。此外，本發明製備的多糖雜化二氧化錳納米粒子在腫瘤組織微環境(偏酸、高含量穀胱甘肽)條件下能夠轉化成為具有明顯磁弛豫增強效果的二價錳離子(實施例4)，特別適用於膠質瘤、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織部位的磁共振成像，還可通過所用多糖組分化學偶聯抗腫瘤藥物，達到診療一體化的目的。
附圖說明
圖1為透明質酸鈉和高錳酸鉀混合溶液吸光度隨反應時間變化曲線。
圖2為透明質酸鈉雜化二氧化錳納米粒子的XPS譜圖。
圖3為透明質酸雜化二氧化錳納米粒子在水溶液中的粒徑分布(動態光散射法測定)和透射電鏡照片。
圖4為透明質酸雜化二氧化錳納米粒子的細胞毒性。
圖5為透明質酸鈉雜化二氧化錳納米粒子在體外磁共振成像的T1和T2加權圖像。
圖6為透明質酸鈉雜化二氧化錳納米粒子在體外磁共振成像的T1弛豫率。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
實施例1
將0.1g的透明質酸鈉(HA，分子量20～50KDa)25℃下溫和溶解於20mL水中，將1mg高錳酸鉀溶於水5mL水中，將多糖水溶液與高錳酸鉀溶液在室溫下混合均勻，所得的混合物在40攝氏度下進行水熱反應15分鐘，利用紫光可見光譜儀實時測定溶液的紫外可見光譜圖，如圖1所示。高錳酸鉀溶液在315nm、525nm和545nm有特徵吸收峰，隨時間推移高錳酸鉀的三個特徵峰逐漸消失，與此同時在360nm左右出現一個新的特徵吸收峰表明了多糖雜化二氧化錳納米粒子的生成。隨反應時間增強，該吸收峰的強度也不斷升高，這是因為，剛開始高錳酸鉀還未完全反應完全，隨時間進行，反應生成二氧化錳的量也不斷增加，同時也導致了吸收峰的紅移。反應進行了13分鐘之後，峰型不再有變化，這是因為此時高錳酸鉀已經完全消耗完，反應終止。所得多糖雜化二氧化錳納米粒子均勻穩定地分散在水溶液中。
實施例2
將1g的透明質酸鈉(HA，分子量10～30KDa)在37℃下溫和溶解於40mL水中，將0.10g高錳酸鉀溶於水10mL水中，將多糖水溶液與高錳酸鹽溶液在37攝氏度下混合均勻，所得的混合物繼續在37攝氏度下進行反應2h，用純水透析後凍幹成粉末，通過X射線光電子能譜考察產物的價態，在高分辨譜中可以明顯看到四價錳Mn(IV)的2p軌道的特徵吸收峰，進一步證實了二氧化錳雜化型納米粒子的生成。
實施例3
將0.01g的透明質酸鈉(HA，分子量5～10KDa)在室溫下溶解配置多糖質量分數為0.05％的溶液，與此同時將0.01g高錳酸鉀溶於水10mL水中，將多糖水溶液與高錳酸鹽溶液在20攝氏度下混合均勻，所得的混合物繼續在90攝氏度下進行反應12分鐘，用純水透析並稀釋後，取10μL滴於200目表面塗有碳膜的銅網上，1min後，用濾紙吸乾多餘液體，晾乾後利用JEM100CX透射式電子顯微鏡(日本電子公司，日本)進行觀察，放大倍數為50K，通過透射電鏡觀察其微觀形貌，大小約80nm左右，與動態光散射測定結果大約一致。
實施例4
將0.25g的透明質酸(HA，分子量6～9KDa)在30℃下溫和溶解於50mL水中，將0.01g一水合高錳酸鈉溶於水50mL水中，將多糖水溶液與高錳酸鈉溶液在30攝氏度下混合均勻，所得的混合物繼續在30攝氏度下進行水熱反應0.5h，用pH＝7.4的緩衝溶液透析後，通過BI-200SM型光散射儀(Brookhaven Instruments，USA)對其粒徑及粒徑分布進行表徵，激發光源波長為532nm，散射角為90度。所有測試均在25攝氏度下進行，並重複五次。得到粒徑分布圖，如圖3所示，平均粒徑為80nm左右。取10μL滴於200目表面塗有碳膜的銅網上，1min後，用濾紙吸乾多餘液體，晾乾後利用JEM100CX透射式電子顯微鏡(日本電子公司，日本)進行觀察，電鏡照片如圖3所示。採用CCK8試劑盒測定樣品的體外細胞(大鼠膠質瘤C6細胞)毒性，結果如圖4所示，在最終錳濃度固定為5～50μg/mL的條件下，多糖雜化二氧化錳納米粒子與C6細胞共同孵育24h後的細胞存活率仍然達到90％以上，說明該多糖雜化二氧化錳納米粒子在該濃度下表現出較低的細胞毒性。
實施例5
將1g的透明質酸鈉(HA，分子量(8～10KDa)在37℃下溫和溶解於40mL水中，將0.10g高錳酸鉀溶於水10mL水中，將多糖水溶液與高錳酸鹽溶液在37攝氏度下混合均勻，所得的混合物繼續在30攝氏度下進行水熱反應0.5h，用pH7.4的緩衝溶液透析後得到了透明質酸雜化二氧化錳納米粒子分散液。將分散液稀釋成0.02～0.5mmol/L不同濃度，置於96孔細胞板內，在Intera型1.5T磁共振成像儀上(Philips，the Netherlands)進行體外MRI掃描，具體操作為：吸取100微升錳濃度為1mmol/L透明質酸多糖雜化二氧化錳納米粒子分散液置於96孔板內，其內分別依次加入100微升PBS溶液、pH值為5的酸性溶液、pH值為5的酸性溶液及過氧化氫(H2O2，腫瘤細胞中含量偏高)、pH值為5的穀胱甘肽溶液(GSH，腫瘤細胞中含量偏高)，使得每孔最終液體量為200毫升，按照1:2的濃度梯度分別進行稀釋後行MRI掃描。MRI檢查使用1.5T磁共振成像儀，成像的序列包括：T1加權成像、T2加權成像、T1圖序列及T2圖序列。主要的成像參數如下：T1加權成像：TR/TE＝500/15ms，層厚/層距＝1.5/0mm，矩陣＝256×256，視野＝90×60mm，NSA＝3次。T2加權成像：TR/TE＝2600/100ms，層厚/層距＝1.5/0mm，矩陣＝256×256，視野＝90×60mm，NSA＝3次。T1圖成像使用SE及反轉恢復(IR)序列交替的混合(Mix)序列測量T1馳豫時間，SE序列的TR/TE為3500/20ms，IR序列4000ms/20ms，TI:400ms，8個回波，層厚/層距為1.5/0mm，視野90×60mm，矩陣256×256，NSA為1次，翻轉角90°。T2圖成像採用單層面多SE序列測量T2馳豫時間，TR/TE＝2000ms/20–160ms，8個回波，層厚＝1.5mm，矩陣＝256×256，視野＝90×60mm，NSA＝3次。在工作站上，利用感興趣區技術測量不同條件下各濃度梯度的對比劑的T1及T2弛豫時間。計算r1與r2弛豫率時，以錳濃度(mM/L)為橫坐標(X)，所對應T1或T2值的倒數為縱坐標(Y)作圖6，所得直線的斜率即弛豫率。可以看出在腫瘤細胞高表達的過氧化氫和穀胱甘肽存在的酸性環境下，溶液的弛豫率顯著增強，因此，該多糖雜化二氧化錳納米粒子特別適用於腫瘤組織微環境(偏酸、高含量穀胱甘肽)條件下的磁共振成像。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。