水稻抗病相關基因OsDR3的製作方法

2023-05-21 22:52:01 1

專利名稱：水稻抗病相關基因OsDR3的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術領域。具體涉及一種水稻DNA片段的分離克隆、功能驗證和應用。所述的DNA片段包含水稻抗病相關基因OsDR3，它能夠顯著提高植物抵抗病害的能力。將該片段的完整編碼區(coding sequence)與玉米中的泛素(ubiquitin)啟動子結合後直接轉入感病植物體，轉基因植株的抗病能力顯著提高。
背景技術：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細菌、黴菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結果(1)病原體成功的在寄主植物內繁殖，引起相關的病症；(2)寄主植物產生抗病反應，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預防病害同時又保護環境的根本出路。
植物的抗病反應是多基因參於調控的複雜過程。參於植物抗病反應的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關基因。
根據目前人們對抗病基因功能的認識，這類基因的產物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內的抗病信號傳導路徑(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.Plant Biol.4288-294)。抗病基因介導的抗病反應抗性強，是很好的基因資源。但由於下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少於30個，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大約40個；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病範圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個抗病基因的作用往往幾年或者十幾年後就喪失了。
抗病相關基因是指除抗病基因外所有參於抗病反應的基因，它們的編碼產物參於合成植物體內抗病信號分子、參於信號傳導或參於防衛反應等。這類基因的共同特點是病原誘導後它們的表達量升高或降低，因此人們可以根據病原誘導前後基因的表達量的差異大規模地鑑定植物抗病相關基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人們對抗病相關基因的認識有限。根據已有報導，大多數抗病相關基因單獨作用時的抗性能力可能比抗病基因小。但根據下述原因，它們是值得大力開發的基因資源(1)由於絕大多數抗病相關基因的產物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數抗病相關基因參於的抗病反應沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。
植物的抗病反應可以分為兩大類。長期以來研究者們對這兩大類抗病反應給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、質量抗性和數量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)或完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。質量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介導的抗病反應。數量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由數量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)調控的抗病反應，它被認為無病原特異性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等編著，CAB International，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人們對植物抗病QTL的基因本質還不清楚。因此，雖然水稻中已經鑑定出了大量抗病QTL，如抗白葉枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗紋枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用於水稻品種抗病性的改良。
近年研究發現很多抗病相關基因的染色體位置與抗病QTL相對應，提示這些抗病相關基因可能就是相對應的QTL。抗病相關基因的染色體位置與抗病QTL相對應這一現象在多種植物中都被觀察到，包括水稻(Xiong等，2002，45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 217111-120)、小麥(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆類(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和馬鈴薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。這些結果為採用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依據。
分離克隆抗病相關基因是利用這類基因改良植物抗病性的前提。同時，與抗病基因的應用相比，抗病相關基因的應用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過超量表達抗病相關基因進行農作物品種的改良，將進一步增強植物的抗病性，拓寬植物的抗譜；這些方面是採用常規植物育種和改良技術所不能達到的。

發明內容
本發明的目的是從水稻中分離克隆一個抗病相關基因完整編碼區段的DNA片段，利用這個基因改良水稻或其它植物抵禦病害的能力。這個基因被命名為OsDR3(Oryza sativa defenseresponsive 3)。
本發明涉及分離和應用一種包含OsDR3基因的DNA片段，該片段賦予植物對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害產生抗病反應。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當於SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當於SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
OsDR3基因編碼的蛋白質具有WRKY類蛋白質的保守結構域，表明其屬於WRKY類蛋白質家族。
可以採用已經克隆的OsDR3基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發明的基因或同源基因。同樣，採用PCR(polymerase chain reaction)技術，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的OsDR3基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。採用以上技術，可以分離得到包含OsDR3基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞，產生轉基因植物。
本發明為增強植物對細菌性和真菌性病害的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將OsDR3基因與超量表達、組成型啟動子(如玉米泛素啟動子)連接後轉入感病植物，通過超量表達OsDR3基因拓寬和增強植物對病原菌的抗性。
將克隆的抗病相關基因轉入感病的植物，有助於產生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉化技術在植株中累加多個抗性基因，而不會產生傳統育種技術中伴隨出現的連鎖基因組序列。抗病相關基因的克隆是克服傳統育種不能在植物種間轉移抗病相關基因問題的前提。
本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相應的種子，以及用本發明的基因或基於該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其它的植株。
在本發明的實施例部分，我們闡述了OsDR3基因的分離、功能驗證和應用過程以及該基因的特點。


序列表SEQ ID No1.本發明分離克隆的OsDR3基因的編碼區序列。
圖1.OsDR3基因位於水稻1號染色體，其染色體位置與兩個獨立研究鑑定的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)相對應。
圖2.採用RT-PCR(reverse transcription-PCR)技術分析OsDR3基因在不同水稻材料接種病原菌或接水(control，對照)後的表達特徵。(A)接種稻瘟病菌後OsDR3基因的表達；(B)接種白葉枯病菌後OsDR3基因的表達；1、2、3、4、5、6、7和8分別代表接種或接水後2小時、4小時、8小時、16小時、1天、3天、5天和7天。Actin為β-肌動蛋白。
圖3.水稻品種明恢63中覆蓋OsDR3基因區段的Shotgun亞克隆的重疊圖。箭頭的位置及長度表示測序的方向和長度，序號代表Shotgun亞克隆編號。通過序列拼接得到一條長2946bp的序列。
圖4.採用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結構預測軟體、參照擬南芥作為分析模板分析亞克隆7G7H14序列中所包含的基因的部分結果。圖中示預測的OsDR3基因的結構。Gn代表基因編號；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；Prom代表基本啟動子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中「+」表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動子或PolyA的序列長度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個翻譯閱讀框)；I/Ac代表3』剪切位點分值；Do/T代表5』剪切位點分值；CodRg代表翻譯區分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖5.用RT-PCR方法分析OsDR3基因的內含子。圖中M代表2kb ladder(從上至下的6條帶大小分別是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)，1是以明恢63總DNA為模板(對照)的擴增產物(359bp)，2是以接種病原後的明恢63RNA為模板的RT-PCR擴增產物(264bp)。
圖6.OsDR3基因的結構及用於超量表達遺傳轉化載體構建的DNA片段長度和結構。線條表示內含子；柱條表示外顯子(編碼序列)；數字表示各個結構的鹼基數。長箭頭代表遺傳轉化水稻DNA片段的長度(2879bp)和相對應基因結構的位置。「ATG」和「TGA」分別是翻譯起始密碼和終止密碼。
圖7.OsDR3基因編碼的WRKY類蛋白質的胺基酸序列。單下劃線處示WRKY結構域的保守胺基酸序列；雙下劃線處示鋅指結構中的保守的半胱氨酸(C)和組氨酸(H)位點。
圖8.(A)遺傳轉化載體pU1301的結構；(B)遺傳轉化載體pCAMBIA1301的結構。
圖9.轉基因水稻植株D11UM8-47的T1代植株接種稻瘟病菌菌株V86013後表現出抗感分離。明恢63為抗病對照；CO39為感病對照；牡丹江8號為遺傳轉化受體材料(對照)。
圖10.用RNA雜交技術檢測顯示抗白葉枯病菌能力增強的轉基因植株中的OsDR3基因的表達量都比基因供體明恢63和基因受體牡丹江8號高。RNA雜交用探針系來自OsDR3基因cDNA的部分片段。
具體實施例方式
本發明的前期研究工作結果顯示來源於水稻品種明恢63的cDNA克隆EI12I1是OsDR3基因的cDNA片段，OsDR3是一個抗病相關基因。主要依據有以下幾個方面(1)採用cDNA晶片技術分析發現cDNA克隆EI12I1在水稻品系IRBB10接種白葉枯病菌菌株PXO86後表達量增加了2.9倍，在水稻品系C101A51接種稻瘟病菌菌株V86013後表達量增加了7.4倍(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhanced and repressed expression afterpathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Science in China 45449-467)。對EI12I1克隆的插入片段進行測序，獲得一條長822bp的cDNA序列。序列分析顯示其編碼產物與WRKY類蛋白質同源程度很高。鑑於EI12I1克隆在病原菌接種前後表達量有明顯差異以及序列特徵，我們認為cDNA克隆EI12I1所代表的基因參與植物的抗病反應調控，是一個抗病相關基因(Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。(2)採用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)將這條cDNA序列與公共核苷酸資料庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列比較分析，將OsDR3基因定位於水稻1號染色體，其染色體位置與已知的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相對應(圖1)，提示OsDR3可能就是相對應的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsive genesare involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。(3)利用12種水稻材料-病原菌組合分析OsDR3基因的表達模式(表1)(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系(Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-749)，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白葉枯病近等基因系(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107)。在RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)分析中，OsDR3基因特異性PCR引物EI12I1F(5』-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3』)和EI12I1R(5』-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3』)是根據該基因的cDNA片段克隆EI12I1的序列設計的；另外，用水稻β-肌動蛋白(actin)的PCR引物actinF(5』-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3』)和actinR(5』-CCAT GCTCGATGGG-GTACTT-3』)的擴增產物作為樣品RNA量的標準。RT-PCR分析結果(圖2)顯示接種稻瘟病菌或白葉枯病菌後OsDR3基因在所有抗病水稻材料中的表達量都增加了，即病原菌可誘導增強OsDR3基因表達。這一誘導最早發生在病原侵染後8小時(圖2)。而OsDR3基因的表達在感病水稻材料接種病原菌後和所有水稻材料接水(對照)後無變化。這些結果進一步證實OsDR3是一個抗病相關基因，它不僅參於水稻抗白葉枯病反應的調控，也參於抗稻瘟病反應的調控(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
表1.用於RT-PCR分析的水稻材料和病原菌組合


1水稻材料明恢63和珍汕97是我國常用雜交水稻的兩個親本；其它水稻材料是國際上常用白葉枯病和稻瘟病鑑定材料(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107；Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-74)，由國際水稻研究所(IRRI)惠贈。
2白葉枯病菌菌株JL691是中國菌株(Yang等，2003，Theor.Appl.Genet.1061467-1472)，其它白葉枯病菌菌株和所有稻瘟病菌菌株是國際上常用白葉枯病和稻瘟病鑑定菌株(Wen等，Three types ofdefense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)，由國際水稻研究所惠贈。
以下實施例進一步定義本發明，並描敘了本發明在上述前期研究工作結果的基礎上分離克隆OsDR3基因以及驗證OsDR3基因功能的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1分離克隆OsDR3基因1.從抗病水稻品種明恢63中分離克隆OsDR3基因本發明以上述cDNA克隆EI12I1做探針，從明恢63 BAC文庫(Peng等，A BAC libraryconstructed to the rice cultivar『Minghui 63』for cloning genes of agronomic importance，1998，ActaBot.Sinica 401108-1114)中篩選到一個陽性BAC克隆7G7。用限制性內切酶Hind III消化BAC克隆7G7，將酶切片段與Hind，III處理的pUC19載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉化大腸桿菌DH10B(購自美國Invitrogen公司)，製備亞克隆。亞克隆經用cDNA克隆EI12I1的序列設計的PCR引物EI12I1F(5』-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3』)和EI12I1R(5』-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3』)擴增檢測，獲得一個包含目標基因片段的亞克隆7G7H14；該亞克隆的外源插入片段長約3.6kb。
2.測序分析亞克隆7G7H14本發明採用Shotgun的方法進行測序(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。將亞克隆7G7H14用超聲波打斷，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離大約1kb的DNA片段，純化後用T4-DNA聚合酶補平末端；將這些片段與限制性內切酶Sma I處理的pUC18載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉化大腸桿菌DH10B，挑克隆檢測插入片段大小。選擇插入片段在1kb左右的克隆進行測序。
採用M13-R和M13-F通用引物(購自中國上海生工生物工程公司)、美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)、分別從每個亞克隆的兩端測序。共計對17個亞克隆進行了測序(圖3)。使用Sequeneher 4.1軟體(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用該軟體自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列。在重疊序列長度大於40bp、重疊序列的一致性大於95％的條件下進行序列拼接，得到一段長2946bp的序列。目標基因區段的每一個鹼基都參照重疊在該位點的多個Shotgun片段的序列來確定。
實施例2OsDR3基因結構分析1.總RNA的抽提總RNA的抽提採用TRIzol Reagent(購自美國Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的試劑盒說明書進行。
2.基因內含子的確定採用基因預測軟體GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)對亞克隆7G7H14的序列(2946bp)進行基因結構預測分析。分析結果顯示OsDR3基因從翻譯起始密碼至終止密碼長1195bp，包含3個外顯子(exon)和2個內含子(intron)，起始外顯子長203bp，中間外顯子長150bp，末端外顯子長598bp；在起始外顯子和中間外顯子之間存在一個長95bp的內含子，位於中間外顯子和末端外顯子之間的第2個內含子長149bp(圖4)。因此，預測的OsDR3基因的閱讀框(open reading frame)長951bp。
為了驗證上述基因結構預測結果的正確性，將預測的951bp的編碼序列與OsDR3基因的cDNA片段克隆EI12I1的序列(822bp)做BLAST分析，比較發現兩者重疊區的核酸序列一致，靠近3』末端的一個內含子的插入位點兩側的外顯子序列完全匹配，表明GenScan分析軟體對這個內含子的預測是正確的。
GenScan預測的第一個內含子長95bp，在起始外顯子和中間外顯子之間，而起始外顯子僅203bp，使得這個內含子十分接近基因的5』末端。由於EI12I1並非一條全長cDNA，其5』末端發生缺失，只有中間外顯子的一部分序列和末端外顯子，無起始外顯子序列，故不能通過序列比較來驗證第一個內含子的存在。為了確定預測的第一個內含子的正確性，本發明以預測的951bp編碼序列為模板設計一對PCR引物WRKY2F(5』-AGTCCGTCGACGAGCAAG-3』，位於序列表SEQ ID NO1所示序列的1177至1194bp處)和WRKY2R(5』-GGTAGGGAGAGC CCTTGATG-3』，位於序列表SEQ ID NO1所示序列的1535至1516bp處)；即WRKY2F引物位於起始外顯子而WRKY2R引物位於中間外顯子上，剛好跨越第一個預測的內含子。以水稻品種明恢63接種病原後的RNA為模板做RT-PCR以及以明恢63基因組DNA為模板做PCR擴增，兩者擴增片段大小相差約100bp，剛好是預測的第一個內含子的長度(圖5)。按照pGEM-T Vector System 1 kit試劑盒(購自美國Promega公司)的使用說明書，將RT-PCR產物連接到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌DH10B(購自美國Invitrogen公司)，通過蘭白斑篩選獲得陽性克隆。對陽性克隆進行測序，序列長264bp。將該序列與GenScan軟體預測的編碼序列比較，兩者序列完全一致。此結果證實GenScan軟體對第一個內含子的預測也是正確的(圖6)。
實施例3OsDR3基因產物的結構分析根據BLAST分析結果，OsDR3基因編碼的蛋白質由316個胺基酸組成，具有WRKY類蛋白質家族典型的WRKY結構域保守胺基酸序列WRKYGQK及特徵性鋅指結構的序列C-X5-C-X23-H-X-H(其中C代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X代表任意胺基酸)(圖7)。Eulgem等(The WRKY superfamily of plant transcription factors，2000，Trends.Plant Sci.5199-206)根據WRKY類蛋白所包含WRKY結構域的數目以及鋅指模體的特徵將WRKY蛋白分為三類第I類包含兩個WRKY結構域及C-X4-5-C-X22-23-H-X-H鋅指結構，第II類包含一個WRKY結構域及同樣的C-X4-5-C-X22-23-H-X-H鋅指結構，第III類包含一個WRKY結構域，其鋅指結構不同於以上的C2-H2模式，而是C2-HC模式(C-X7-C-X23-H-X-C)。根據以上分類，可將OsDR3基因編碼的WRKY類蛋白歸入第II類。
實施例4OsDR3基因的功能驗證和應用1.遺傳轉化載體的構建所用載體是我們實驗室構建的pU1301。pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)基礎上改建的，攜帶玉米泛素組成型、超量表達啟動子的農桿菌介導的遺傳轉化載體(圖8)。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture)惠贈。
採用限制性內切酶BamHI消化的方法，將OsDR3基因從重組質粒7G7H14上酶切下來，回收外源片段(圖6)。同時，用BamHI酶切攜帶玉米泛素啟動子的遺傳轉化載體pU1301；酶切完畢，用氯仿異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產物。然後用去磷酸化酶Alk對純化的酶切產物進行去磷酸化處理。用包含OsDR3基因的酶切片段和去磷酸化的載體做連接反應。通過酶切篩選陽性克隆，並通過Xpn I酶切篩選外源片段正向插入的陽性克隆。獲得的重組質粒載體被命名為D11U。
採用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6271-282)將D11U導入感病水稻品種牡丹江8號(Oryza sativa ssp.japonica)。農桿菌介導的遺傳轉化主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青黴素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮黴素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0g硫酸銨(NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然後室溫下定容至1000ml。
2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI) 0.08g硼酸(H3BO3) 0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15g室溫下溶解並定容至1000ml。
3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水並加熱至70℃，然後加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解後混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。
4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinic acid)0.1g維生素B1(Thiamine HCl) 0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl)0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。
5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀 19.0g磷酸二氫鉀 1.7g硫酸鎂 3.7g氯化鈣 4.4g室溫下溶解並定容至1000ml。
6)MSmix母液(100X)碘化鉀 0.083g
硼酸 0.62g硫酸錳 0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025g室溫下溶解並定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，室溫保存。
8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，室溫保存。
9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。
10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。
11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌後4℃保存備用。
12)AS貯存液AS 0.392gDMSO 10ml分裝至1.5ml離心管內，4℃保存備用。
13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀 5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存備用。
(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30g
Phytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預培養基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose) 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
4)共培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH0.2g蔗糖 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
5)懸浮培養基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 0.5ml
維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液0.2mlCH 0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，調節pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養基，加入250μl HN和400ppm CN，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
7)預分化培養基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml6-BA貯存液 0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口滅菌。
使用前溶解培養基，加入250μl HN和200ppm CN，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
8)分化培養基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml6-BA貯存液 2mlKT貯存液 2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH 1g蔗糖 30g
Phytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。
煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。
煮沸並定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟3.1愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置於黑暗處培養4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度25±1℃。
3.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養2周，溫度25±1℃。
3.4農桿菌培養(1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基上預培養農桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。
3.5農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青黴素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮黴素篩選濃度為400ppm，第二次以後為250ppm)3.7分化
(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7周；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26℃。
3.8生根(1)剪掉分化時產生的根；(2)然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。
獲得的轉基因水稻植株被命名為D11UM8(其中D11U為遺傳轉化載體名稱，M8代表水稻品種牡丹江8號)。本發明共獲得獨立轉基因水稻植株47株。採用剪葉法(Kauffman等，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae，1973，Plant Dis.Rep.57537-541)，對所有轉基因植株在成株期階段接種國際上常用的白葉枯病菌菌株PXO61(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae inrice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)，發現13株轉基因水稻植株的抗白葉枯病菌侵害能力顯著(P≤0.05)增強(表2)；與轉基因的受體水稻品種牡丹江8號相比，這些轉基因植株的病斑面積減小了28.2-60.5％。
表2.部分攜帶OsDR3基因的轉基因水稻植株對白葉枯病菌株PXO61的反應

(1)每株轉基因植株接種5片葉，三周後調查病斑和病葉長度，每個數據來自於5片葉的平均值。
轉基因水稻植株對稻瘟病菌的抗性也增強。對轉基因植株D11UM8-47的T1代植株離體接種國際上常用的稻瘟病菌菌株V86013(Wen等，Three types of defense-responsive genes areinvolved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)進行觀察，發現這些植株表現出期望的抗感分離。與對照植株牡丹江8號相比，23株T1代植株中有9株表現抗性明顯提高(圖9)。
本發明是採用組成型、超量表達(玉米泛素)啟動子調控OsDR3基因的表達，因此在轉基因水稻植株中OsDR3基因的表達不會受病原侵染的影響。為了驗證轉基因植株的抗性增強是否與轉入的OsDR3基因的表達量有關，本發明採用RNA雜交技術對部分轉基因水稻植株中OsDR3基因的表達進行檢測。結果顯示OsDR3基因的表達量與植株的抗性密切相關。在沒有病原侵染條件下轉基因受體水稻品種(牡丹江8號)、基因供體(明恢63)和感病轉基因水稻植株中基本上都不能檢測到OsDR3基因的表達，而抗性增強的轉基因植株中都可以檢測到OsDR3基因的表達(圖10)。這些結果進一步證明OsDR3基因參於水稻抗病反應的調控，並且超量表達OsDR3基因可以增強水稻的抗病性。
序列表SEQ ID NO1110華中農業大學120水稻抗病相關基因OsDR3130
1412004-07-231602170PatentIn version 3.121012112946212DNA213Oryza sativa220
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220
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220
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220
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220
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220
221misc_feature222(5)..(5)223a、c、g或t220
221misc_feature222(16)..(16)223a、c、g或t220
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221misc_feature222(2937)..(2937)223a、c、g或t4001tcagngggtt tggccncctg ncgtgaaccc ccgtganatg ngattattcg tnaggtagat 60catcgatcca agttttttca cgtgtccnct tgtagtaggg atcctccncg gttngatcga120gtccrrcgcc cmgacggatt gctamcaaac aatacataat cttctctttt tttgttgttg180agatatatat gatcacgtca cagggcggca ctggttctgg aggttcgtct gtgaattaaa240ccacgctaaa gtacagggta tccgtatagt attccttctc atgtacgatc tggtgtgtat300tgtgtttcca cggggatagc agcagaagca cggggatgat tggccagatc gggttaggga360gggggtcgcc atcgccgcct gcactagatt aatcgctcgc cccggcccag aacgtcgctc420tctccgtccg tccccggctc gccaccatct cctcctccaa gacgcaactt cgagagtgag480agagagagag aatcgagaga tccaatccag tttgcgcaac gagtggcatg gcatgcaacc540gatctagaac gtcaaataaa aacaacgcca tgcgtacata cacgttcatg tgccgcgcgc600cggtgtagcg cagcgtagag agagagagag agagagagta tggtagtctt cctacgctcg660gtcagtgaca gcgtcgcggc gcataaagaa aggcatccac tagcaggagc cagcatacgc720tgccgcatat acaaacacgc atgtagccaa ggcgaggaga gagagagaga gagagagaga780gagggagatc attgaaagct gcacccatcc gtttgttcgc caccatttcc atcccctcca840tcatgagctc caattagtcg cacaccgatc ccctcctctt cttccccccc ttctcctctc900tcctcttttt ttcctcatcc gtgcgcgata ctgcgcttag tttgtgggtg gggggagtga960tcatcaccaa agccacaaag ggggcgcgga gagatattat atattctttg ggaaagcgtt 1020ggattagttt ttctcgcttt gggcttttta tccggagttg gagtgtgtgt gcgccgggag 1080tggtggtggt g atg gcg gca gga gag gag gtg atg gat cgg tcg acg tcg1130Met Ala Ala Gly Glu Glu Val Met Asp Arg Ser Thr Ser1 5 10
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Glu Gln Glu Ser Glu Pro Val Val Lys Gln Glu Glu Glu Gln Lys Glu210 215 220Glu Gln Lys Ala Val Val Glu Pro Ala Ala Val Thr Thr Thr Val Ala225 230 235 240Pro Ala Pro Ala Val Glu Glu Glu Asp Glu Asn Phe Asp Phe Gly Trp245 250 255Ile Asp Gln Tyr His Pro Thr Trp His Arg Ser Tyr Ala pro Leu Leu260 265 270Pro Pro Glu Glu Trp Glu Arg Glu Leu Gln Gly Asp Asp Ala Leu Phe275 280 285Ala Gly Leu Gly Glu Leu Pro Glu Cys Ala Val Val Phe Gly Arg Arg290 295 300Arg Glu Leu Gly Leu Ala Ala Thr Ala Pro Cys Ser305 310 31權利要求
1.賦予植物對病害產生抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當於SEQ ID NO1所示序列，或者與SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亞片段。
2.權利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全長的OsDR3基因編碼序列，該基因編碼的蛋白質具有WRKY類蛋白質的結構。
3.權利要求1中的DNA片段，其中的基因編碼區與其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因經過修飾改造。
4.一種增加植物對白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea Sacc.)抗性的方法，該方法包括將權利要求1的DNA片段連接上合適的啟動子轉入植物體或將權利要求1的DNA片段和其它的DNA片段組成嵌合基因轉入植物或將權利要求1的DNA片段經過修飾改造後轉入植物體，增加植物對病原菌的抗性。
5.基因組中包含權利要求1、2、3中的DNA片段的轉基因植物和轉基因植物種子的應用。
全文摘要
本發明涉及植物生物技術領域。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、功能驗證和應用。所述的DNA片斷包含水稻抗病相關基因OsDR3，編碼WRKY類蛋白質，它能夠賦予植物抵抗由病原菌引起的病害。將該片段與其外源調節序列直接轉入植物體，轉基因植物對病原菌的抵抗能力顯著增強。
文檔編號A01H5/10GK1737142SQ20041000945
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月19日 優先權日2004年8月19日
發明者王石平, 邱德運, 熊敏 申請人:華中農業大學