一種6‑姜烯酚的提取純化方法與流程

2023-05-22 00:30:11 2

本發明屬於天然藥物、中草藥中活性成分提取及純化領域。本發明從生薑中提取和純化6-姜烯酚。

背景技術：

姜是姜科植物姜的鮮嫩莖。生薑藥食兩用，能解表散熱，溫中止嘔。在《本草綱目》中有記載，生薑能夠治療「瘧疾寒熱(脾胃聚痰，發為寒熱)、寒熱痰嗽、霍亂轉筋，入腹欲死、胸脅滿痛(心胸、脅下，硬痛脹滿)、大便不通、溼熱發黃、滿口爛瘡、牙齒疼痛、中藥毒、刀斧傷、閃扭手足、跌打損傷、腋下狐臭、赤白癜風、兩耳凍瘡、諸毒痔漏，久不結痂」。(趙文竹,張瑞雪,於志鵬,等.生薑的化學成分及生物活性研究進展[j].食品工業科技,2016,(11):383-389.)。生薑提取物廣泛應用於製藥、化妝品、日化品中。6-姜烯酚是生薑中的活性成分之一，分子結構如式ⅰ。它具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物學活性。[周萍，彭詠波，李萍，6-姜烯酚抗腫瘤機制研究進展，中南藥學，2012，10(7)：536-537；najy，songk，leejw，kims，kwonj，pretreatmentof6-shogaolattenuatesoxidativestressandinflammationinmiddlecerebralarteryocclusion-inducedmice，europeanjournalofpharmacology，2016，788:241-247。]

現有技術中，6-姜烯酚的提取純化方法主要有以下幾種：

(1)將姜超臨界流體萃取物(6-姜烯酚的含量約為2.5％)與含乙醇的酸水液混合後加熱回流，再分離、精製。酸水反應處理後提取物中6-姜烯酚的含量可達20％。[李萍；彭詠波；馬江；齊煉文；劉慧；成小蘭；一種6-姜烯酚的製備方法，申請號：cn200910232593.3。]

(2)姜超臨界流體萃取物或乾薑提取物經含乙醇的酸水加熱回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯得到萃取後濃縮物，濃縮物過矽膠色譜柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液濃縮，即得。矽膠柱層析分離得到的姜烯酚類組合物，含量可達60～65％。[齊煉文；李萍；馬江，一種姜烯酚提取物的製備方法及其醫藥用途，申請號：cn201110148248.9]。

(3)從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法。原料天堂椒粉碎，採用亞臨界萃取，得油浸膏；將油浸膏採用乙醇溶解，然後採用溶劑萃取，濃縮至浸膏；採用柱分離，根據薄層斑點，收集含有6-姜烯酚的洗脫液，濃縮，放置結晶。所獲粗品進一步重結晶，乾燥後即得6-姜烯酚。[肖紅；王曉瑩；張瑜；肖金霞；郭文華；一種天堂椒的用途及從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法，cn201611104828.7].

(4)以生薑95％乙醇提取物用石油醚脫脂,乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相過d4020型大孔吸附樹脂,依次用25％、50％、75％乙醇溶液洗脫得組分fra和frb。frb以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(12：10：15：10,v/v/v/v)為溶劑系統,經高速逆流色譜hsccc-d1200分離得到組分6-姜烯酚。[喬慶亮，生薑中酚類化合物的分離製備研究，碩士學位論文，浙江工商大學,杭州市，2011。]

(5)乾薑樣品的乙酸乙酯提取物，經矽膠柱層析分離得到6-姜烯酚粗品，再經高速逆流色譜分離，得到純度較好的6-姜烯酚，純度可以以1hnmr表徵結構。[徐美霞，王曉，劉建華，耿巖玲，王岱傑，劉峰，高速逆流色譜結合矽膠柱色譜法分離製備乾薑中的6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚，2013,26(2)：61-65.]

上述方法(1)和方法(2)的提取方法為超臨界流體萃取；方法(1)的分離和純化過程採用了酸水反應，方法(2)在方法(1)的基礎上進一步用石油醚、乙酸乙酯萃取、矽膠柱層析。但這兩種方法的產物的純度分別是20％，和60-65％，非純品，不適合用於藥理實驗，產品不適於作為標準品。

上述方法(3)在柱層析的基礎上利用重結晶的方法純化。因6-姜烯酚的熔點低，室溫下易液化，重結晶的過程中難以析出固體，對後續過濾造成困擾，並且從理論上說產品在這一步驟中在母液中有一定的溶解度，因此損失大。上述方法(4)和方法(5)兩種方法均經過了兩步純化。在製備中使用了高速逆流色譜，成本高，單次處理的樣品量小。

技術實現要素：

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的在於提供一種從生薑中提取純化6-姜烯酚的方法，解決現有技術提取效率不高、成本高和純度不高的問題。

解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：一種6-姜烯酚的提取純化方法，其特徵在於，包括如下步驟：

1)以生薑、乾薑為原料，將所述原料粉碎並加入70％的乙醇中於40-55℃下浸泡提取10～23h；其中，所述原料與溶劑的質量體積比為1g:6～15ml；

2)步驟1)浸泡完成後，紗布過濾，濾液再用布氏漏鬥抽濾，除去固體殘渣；將浸提液轉入燒瓶中，搭建好減壓蒸餾裝置，開始進行減壓蒸餾，待所述餾出液的體積為所述溶劑的70％～80％時停止減壓蒸餾，得浸提液的濃縮溶液，轉移至分液漏鬥中；

3)向步驟2)所得的濃縮液中，加入石油醚萃取，所用石油醚與濃縮液的的體積比為1:1～1:3；石油醚萃取後的下層溶液用乙酸乙酯萃取，所述乙酸乙酯與下層溶液的體積比為1:1～1:3；萃取3次，合併上相萃取液；經旋轉蒸發儀蒸發除去溶劑得棕色油狀物；

4)向步驟3)所得棕色油狀物進行矽膠柱層析；矽膠用量與棕色油狀物的質量比為15：1～40:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為淋洗劑，其體積比為6:1～2:1，進行梯度洗脫；以石油醚+乙酸乙酯(3:1)為展開劑，對收集的柱後淋洗液進行薄層層析，收集rf＝0.38的組分，得粗製品；

5)對步驟4)中所得粗製品以薄層製備色譜進一步純化；

(1)製備薄層層析矽膠板：稱取薄層層析矽膠放入研缽中，矽膠與樣品的質量比為50:1～30:1；按照與矽膠質量比為3:1的比例加入5‰的羧甲基纖維素鈉的水溶液，用研磨棒研磨均勻，直至沒有氣泡；將上述矽膠勻漿均勻平鋪在洗淨乾燥的玻璃板上，自然晾乾；於110℃下活化2小時，待冷卻後取出；

(2)純化：將粗製6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中進行薄層展開，粗製6-姜烯酚與步驟(1)所述薄層層析矽膠板的質量比為1:50～1:30；展開劑為石油醚：乙酸乙酯5:1～2:1。

進一步，所述步驟1)中所述生薑原料與水的質量體積比為1g:6～10ml；所述乾薑原料與水的質量體積比為1g:10～15ml。

進一步，步驟4)柱層析分離中，矽膠用量與膏狀物的質量比為20:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為淋洗劑，依次進行梯度洗脫，石油醚:乙酸乙酯(體積比6:1)，用量與矽膠量比為5ml:1g；石油醚:乙酸乙酯(體積比5:1)，用量與矽膠量比為2.5ml:1g，石油醚:乙酸乙酯(4:1)，用量與矽膠量比為2.5ml:1g；石油醚:乙酸乙酯(3:1)，用量與矽膠量比為3ml:1g，石油醚:乙酸乙酯(2:1)，用量與矽膠量比為2.0ml:1g。

相比現有技術，本發明具有如下有益效果：

1、本發明採用柱層析後，以矽膠薄層製備的方法進一步純化6-姜烯酚，方法簡單，不需要儀器操作，單次處理樣品量大，目標成分幾乎不損失，回收率高，所需的薄層製備矽膠板可以自己製作或者商品板，價格低廉。該方法所得樣品純度極高，可以作為6-姜烯酚樣品鑑別和含量測定中的標準品。

2、本發明在6-姜烯酚粗品進一步精製純化的過程中，採用薄層色譜製備的方法，比傳統的重結晶方法損失小，收率高；所得6-姜烯酚產品可用作含姜、姜烯酚的醫藥製劑、藥理研究、化妝品、日化品等的質量控制的標準品。與採用高速逆流色譜的純化方法相比，該發明製備6-姜烯酚純品不需要使用儀器，單次分離量高，節約了人力、物力成本；與製備hplc精製純化的方法相比，操作簡單，材料成本低廉，節約時間，純度好。與其它提取純化方法比，該發明在純化過程中，幾乎不損失目標成分，收率高。

附圖說明

圖1是本發明6-姜烯酚的提取方法流程圖；

圖2是本發明實施例中6-姜烯酚的1hnmr圖譜；

圖3是本發明實施例中6-姜烯酚的13cnmr圖譜。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。

參見圖1，一種6-姜烯酚的提取純化方法，以生薑、乾薑為原料，將所述原料粉碎採用70％乙醇，40-55℃水浴浸提。過濾藥渣後，提取液經減壓蒸餾得濃縮液。濃縮液分別經石油醚萃取去除雜質、乙酸乙酯萃取6-姜烯酚成分。上述萃取液除去溶劑後，乙酸乙酯萃取部分經矽膠柱層析，石油醚：乙酸乙酯(6:1～2:1)梯度洗脫，分離收集rf＝0.38(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)的組分，得矽膠柱層析分離6-姜烯酚粗品。6-姜烯酚粗品進一步經薄層製備層析分離得6-姜烯酚純品，純品經1hnmr和13cnmr表徵。

具體實施例步驟如下：

1、溶劑浸提法提取生薑中的有效成分

取無損傷、無黴變、無腐爛的新鮮生薑洗淨，削去表皮，切成薄片，剁成薑末，備用。

稱取新鮮生薑末1350.0g，加入13500ml70％乙醇，55℃水浴浸提6-15h，抽濾，得黃色提取液13000ml。在t＝55℃下減壓蒸餾，將上述黃色提取液中的多數溶劑蒸出。

2、有效成分初步萃取分離

以石油醚(60-90℃)對上述生薑粗提液進行萃取，重複三次，將萃取之後石油醚層合併，得到5000ml淡黃色液體。在t＝20℃下採用真空蒸發，將上述淡黃色液體中的多數溶劑蒸出，濃縮至約4ml移入西林瓶中，為黃色澄清透明狀液體。在西林瓶中加入無水mgso4固體(3.5g)，密封，靜止1天，過濾，用石油醚洗滌三次，將濾液合併。真空蒸發除去溶劑，真空乾燥，稱重，得到3.2317g淡黃色油狀物，為石油醚萃取液。

3、乙酸乙酯萃取

對上述石油醚萃取後的下層液以乙酸乙酯進行萃取，重複萃取三次，將萃取之後的乙酸乙酯層合併，得到6000ml金黃色液體。在30℃下真空蒸發蒸出溶劑，濃縮至約5ml移入西林瓶中，得到棕色溶液。在西林瓶中加入無水mgso4固體(3.0g)，密封，靜置1天，過濾，以乙酸乙酯洗滌三次，將濾液溶劑真空蒸發後，稱重，得到4.8724g深棕色液體，為乙酸乙酯萃取液。

4、矽膠柱層析分離6-姜烯酚

稱取70.0g柱層析矽膠，加入適量洗脫劑(石油醚:乙酸乙酯為6:1)，使二者混合均勻，裝柱。乙酸乙酯萃取液以石油醚:乙酸乙酯為6:1溶解樣品上樣。分別以石油醚:乙酸乙酯(6:1)(300ml)、石油醚:乙酸乙酯(5:1)(280ml)、石油醚:乙酸乙酯(4:1)(100ml)、石油醚:乙酸乙酯(3:1)(120ml)進行洗脫。以薄層色譜(tlc)檢測洗脫液中的有效成分，合併含組分rf＝0.38(以石油醚:乙酸乙酯(5:1)展開)洗脫液。以旋轉蒸發儀真空蒸發，得到粗製6-姜烯酚79.7mg。

5、6-姜烯酚的薄層色譜法精製

薄層層析矽膠板的製備：稱取10.0g薄層層析矽膠放入研缽中，以1:3的比例加入30ml5‰的羧甲基纖維素鈉水溶液，用研磨棒研磨均勻，直至沒有氣泡；用藥匙將適量上述矽膠勻漿均勻平鋪在洗淨乾燥的玻璃板上，自然晾乾。於110℃下活化2小時，待冷卻後取出。

將粗製6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中進行薄層展開。將rf＝0.38的矽膠帶刮下，置於100ml錐形瓶中。以乙酸乙酯提取活性成分(15ml×3)，合併提取液，過濾。濾液以旋轉蒸發儀真空蒸發，得黃色油狀液體，乾燥，稱重70.3mg。1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:6.82(d,j＝8.0hz,1h),6.80(dd,j＝15.9,6.7hz,1h),6.68(d,j＝2.0hz,1h),6.66(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),6.04(d,j＝15.9hz,1h),3.87(s,3h),3.20(t,j＝7.5hz,2h),2.58(t,j＝7.5hz,2h),2.24(m,2h),1.20-1.35(m,6h),0.88(t,j＝6.9hz,3h).13cnmr(600mhz,cdcl3)δ:194.26,146.34,145.76,143.92,132.63,129.99,120.78,114.26,110.84,55.85,40.52,34.06,31.31,29.31,27.18,22.64,14.09。

由此可見，本發明在6-姜烯酚粗品進一步精製純化的過程中，採用薄層色譜製備的方法，最終6-姜烯酚的收率為52.1mg/kg，與文獻([肖紅；王曉瑩；張瑜；肖金霞；郭文華；一種天堂椒的用途及從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法，cn201611104828.7])中報導的生薑中6-姜烯酚的含量約為0.005％相近(與生薑的栽培、產地等因素相關)，說明該法收率高。產品的純度高，圖2中1hnmr圖顯示，除了掃描nmr圖譜時人為加入的氘代氯仿溶劑產生的化學位移7.26ppm峰外，未見其它含h原子的雜質所產生的峰，圖3中13cnmr譜進一步證實了該產品純度好。產品6-姜烯酚純度滿足研究藥理活性、生薑提取物質量控制的標準品的要求。

該方法比高速逆流色譜、製備hplc精製純化的方法相比，操作簡單，材料成本低廉，節約時間。所得6-姜烯酚產品可用作含姜、姜烯酚的醫藥製劑、藥理研究、化妝品、日化品等的質量控制的標準品。

最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。