二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒的製作方法
2023-05-21 16:39:01 1
專利名稱：二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢驗測定技術領域，更具體地說，涉及一種二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒。
背景技術：
二氧化碳結合力指血漿中碳酸氫根所含的二氧化碳的含量。血清或血漿中二氧化碳結合力含量測定是臨床生化檢驗的常規項目，測定二氧化碳結合力可以了解人體內酸鹼平衡的情況。呼吸性酸中毒，(肺氣腫、肺纖維化)、呼吸肌麻痺、支氣管擴張、氣胸及呼吸道阻塞；代謝性鹼中毒，例如嘔吐、腎上腺皮質功能亢進、缺鉀及服用鹼性藥物過多等都會引起酸鹼中毒，從而使二氧化碳結合力增高；代謝性酸中毒，例如尿毒症、休克、糖尿酮症、嚴重腹瀉及脫水；呼吸性鹼中毒，例如呼吸中樞及呼吸加快等會引起二氧化碳結合力降低。因此，測定血清或血漿中的二氧化碳結合力含量，是輸液療法糾正失衡的重要指標，對治療有重要意義。目前，測定二氧化碳結合力的方法包括PH電極測定法、酸鹼清空法和量壓法等， 量壓法主要是採用瓦式呼吸機進行測定，即根據樣品中的碳酸氫根與乳酸作用生成二氧化碳，在密閉的環境下，測定出二氧化碳的體積從而測算出碳酸氫根的含量，從而得到二氧化碳結合力。但是，上述方法測定操作誤差較大，測定結果的準確度不高，很難作為醫院常規檢驗項目開展。隨著各種半、全自動生化分析儀的普遍應用，近年來普遍採用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)偶聯的速率法(簡稱PEPC法)測定二氧化碳結合力。其反應原理為碳酸氫根與磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草醯乙酸和磷酸；草醯乙酸與還原型輔酶在蘋果酸脫氫酶的作用下生成蘋果酸和氧化型輔酶。在PEPC法中，通過測定還原型輔酶的用量，測定碳酸氫根的含量，從而得到二氧化碳結合力。但是，空氣中二氧化碳會與還原型輔酶發生反應，從而造成還原型輔酶下降； 此外，待檢測樣品中內源性物質的增高，例如某些疾病會使血乳酸增高，從而使樣品中乳酸脫氫酶含量增加，由於乳酸脫氫酶的作用，使還原型輔酶下降，影響檢測二氧化碳結合力的準確性。
發明內容
有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒，該檢測方法能夠準確檢測二氧化碳結合力。本發明提供了一種二氧化碳結合力的檢測方法，包括步驟a)提供二氧化碳結合力的待檢測樣品；步驟b)將所述待檢測樣品與檢測液混合，反應，得到反應液，所述檢測液包括PH 值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；
步驟c)檢測步驟b)得到的反應液在540 550nm波長下的吸光度值，計算得到
二氧化碳結合力。優選的，所述待檢測樣品為血 清或肝素抗凝血漿。優選的，所述Tris-HCl緩衝液的濃度為10 50mmol/L。優選的，所述檢測液中氯化鈉的濃度為150 160mmol/L。優選的，所述檢測液中碳酸酐酶的濃度為3000 5000U/L。優選的，所述檢測液中顯色劑的濃度為120 500mg/L。優選的，所述檢測液還包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉。本發明還提供一種試劑盒，包括pH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。9、根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述碳酸酐酶的濃度為3500 4500U/L。優選的，還包括標準液，所述標準液為40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氫鈉。從上述的技術方案可以看出，本發明提供一種二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒，該檢測方法包括將二氧化碳結合力的待檢測樣品與檢測液混合，反應，得到反應液，所述檢測液包括PH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；檢測所述反應液在540 550nm波長下的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。在檢測過程中，所述待檢測樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，從而使反應液的PH值升高，顯色劑顯色，然後通過檢測所述反應液的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。與現有技術相比，本發明利用顯色反應，無需使用還原型輔酶，檢測的二氧化碳結合力具有很好的準確性。
具體實施例方式下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。本發明提供一種二氧化碳結合力的檢測方法，包括步驟a)提供二氧化碳結合力的待檢測樣品；步驟b)將所述待檢測樣品與檢測液混合，反應，得到反應液，所述檢測液包括PH 值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；步驟c)檢測步驟b)得到的反應液在540 550nm波長下的吸光度值，計算得到
二氧化碳結合力。本發明中，所述Tris-HCl緩衝液的濃度優選為10 50mmol/L，更優選為20 30mmol/L，最優選為30mmol/L。所述檢測液中氯化鈉的濃度優選為150 160mmol/L，更優選為152 158mmol/L，更優選為154mmol/L。所述檢測液中碳酸酐酶的濃度優選為3000 5000U/L，更優選為3800 4200U/L，最優選為3900 4100U/L。所述檢測液中顯色劑的濃度優選為120 500mg/L，更優選為150 300mg/L，最優選為180 250mg/L。本發明採用的顯色劑優選為質量比為7 3 10的酚紅、溴百裡香酚藍和氯化鈉的混合物。所述檢測液還包括穩定劑，所述穩定劑的濃度優選為10 14g/L，更優選為11 13g/L，最優選為11 12g/L。本發明所述穩定劑優選為質量比為1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉的混合物。本發明提供的檢測方法採用的標準液優選為40g/L的牛血白蛋白和 26mmol/L的碳酸氫鈉。本發明提供的二氧化碳結合力的檢測方法為碳酸酐酶比色法，通過待檢測樣品與試劑盒混合發生的反應，引起PH變化，顯色劑顯色，然後利用紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀，檢測所述反應液在540 550nm波長下的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。本發明提供的二氧化碳結合力的檢測方法測定速度快，並且，由於所述檢測液呈弱酸性，不易吸收空氣中的二氧化碳，抗幹擾能力強。此外，即使所述試劑盒吸收了少量空氣中的二氧化碳，本發明可以通過對檢測液的空白測定，避免對測定結果的影響，保證了測定準確度；並且，本發明提供的檢測方法無需反覆定標，使用方便。本發明提供的二氧化碳結合力的檢測方法的檢測原理為本發明所述待檢測樣品優選為無溶血、無乳糜的血清或肝素抗凝血漿。由於所述待檢測樣品中的鹼度主要是碳酸鹽緩衝系統，其中以碳酸氫根為主，其次是碳酸和碳酸根，在PH為5左右的弱酸性介質中， 碳酸和碳酸根轉化為二氧化碳和水。利用本發明提供的二氧化碳結合力的檢測方法檢測待檢測樣品中的二氧化碳結合力時，待檢測樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，生成的碳酸氫根使反應液的PH值升高，顯色劑顯色。原試劑盒在pH值5以下時為黃色，由於碳酸氫根含量越高顯色就越深，當PH值升高時反應液由黃色變為紫紅色。所述反應液的最佳吸收波長為540 550nm，優選為546nm。將最終反應液置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，在540 550nm波長下測定吸光度值大小。通過吸光度值與碳酸氫根含量的正比關係，測算得到二氧化碳結合力的含量。檢測原理具體為碳酸+氫氧根一水+ 二氧化碳二氧化碳和水在碳酸酐酶作用下生成氫離子和碳酸氫根本發明還公開一種試劑盒，包括pH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。本發明中，所述Tris-HCl緩衝液的濃度優選為10 50mmol/L，更優選為20 30mmol/L，最優選為30mmol/L。所述氯化鈉的濃度優選為150 160mmol/L，更優選為 152 158mmol/L，更優選為154mmol/L。所述碳酸酐酶的濃度優選為3000 5000U/L，更優選為3800 4200U/L，最優選為3900 4100U/L。所述顯色劑的濃度優選為120 500mg/ L，更優選為150 300mg/L，最優選為180 250mg/L。本發明採用的顯色劑優選為質量比為7 3 10的酚紅、溴百裡香酚藍和氯化鈉的混合物。所述檢測液還包括穩定劑，所述穩定劑的濃度優選為10 14g/L，更優選為11 13g/L，最優選為11 12g/L。本發明所述穩定劑優選為質量比為1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉的混合物。按照本發明，還包括標準液，所述標準液為40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉。本發明提供的試劑盒可以為單一試劑，也可以為雙試劑。例如，將Tris-HCl緩衝液、氯化鈉溶液、碳酸酐酶和顯色劑製成單一試劑；或者，將Tris-HCl緩衝液和氯化鈉製成第一試劑，將碳酸酐酶、顯色劑、穩定劑製成第二試劑，在利用該試劑盒檢測二氧化碳結合力時，將第一試劑與第二試劑混合，從而檢測待檢測樣品中的二氧化碳結合力。
本發明提供的試劑盒優選按照如下方法製備按30mmol/L稱取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調pH至4. 8 5. 2，加入氯化鈉、碳酸酐酶及顯色劑，混合。將得到的混合溶液分裝入瓶。本發明可以通過對所述分裝入瓶的混合溶液進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑， 所述乾粉試劑在使用前需用蒸餾水復溶；可以直接製備得到液體試劑，便於直接使用。為了進一步說明本發明的技術方案，下面結合實施例對本發明優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特徵和優點，而不是對本發明權利要求的限制。實施例1試劑盒的配製按30mmol/L稱取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調pH至4. 8 5. 2，分別加入氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑，得到混合溶液，將所述混合溶液分裝入瓶，冷凍乾燥，得到乾粉試劑，所述混合溶液中包括以下成分
Tris-HCl 緩衝液30mmol/L
氯化鈉154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
質量比為7: 3: 10的酚紅、溴百裡香酚藍和氯化鈉200mg/L將40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉混合，得到標準液。實施例2將實施例1製備的試劑盒與蒸餾水混合，靜置10分鐘，得到檢測試劑；將血清、實施例1製備的標準液與上述製備的檢測試劑分別置於全自動生化分析儀的樣品盤和試劑盤中，儀器自動按設定參數8μ 1樣品和240 μ 1檢測試劑取樣，混合，反應，得到反應溶液，在37°c下，孵育時間為300秒，檢測546nm波長下的吸光度值，根據計算公式C#=A#/AfeXCfe(26mmol/L)，測算出二氧化碳結合力的濃度大小，其中C#為被測樣本濃度；A#為樣本吸光度值；Cfe為標準液濃度(已知)為標準液吸光度值。實施例3試劑盒的配製製備第一試劑按30mmol/L稱取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調pH至4. 8 5. 2，加入氯化鈉，得到第一試劑。製備第二試劑用4%的牛血白蛋白溶液溶解碳酸酐酶，用50%甲醇溶解顯色劑，然後加入蒸餾水和穩定劑，得到第二試劑。所述第一液體試劑與所示第二液體試劑中成分如下Tris-HCl 緩衝液30mmol/L
氯化鈉154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
質量比為7: 3: 10的酚紅、溴百裡香酚藍和氯化鈉 200mg/L 質量比為1: 1: 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉 12g/L製備標準液將40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氫鈉混合，得到標準液。實施例4將肝素抗凝血漿、實施例3製備的標準液、第一試劑、第二試劑分別置於全自動生化分析儀的樣品盤和試劑盤中，儀器自動按設定參數8μ 1樣品和200 μ 1第一試劑、40 μ 1 第二試劑取樣，混合，反應，得到反應溶液，在37°C下，孵育時間為300秒，檢測546nm波長下的吸光度值，根據計算公式C#=A#/Afe XCfe，從而測算出二氧化碳結合力的濃度大小，其中工#為被測樣本濃度；A#為樣本吸光度值為標準液濃度為標準液吸光度值。如表1所示，為本發明檢測二氧化碳結合力的測定參數。表1碳酸酐酶比色法測定參數
權利要求
1.一種二氧化碳結合力的檢測方法，其特徵在於，包括 步驟a)提供二氧化碳結合力的待檢測樣品；步驟b)將所述待檢測樣品與檢測液混合，反應，得到反應液，所述檢測液包括PH值為 4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；步驟c)檢測步驟b)得到的反應液在540 550nm波長下的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述待檢測樣品為血清或肝素抗凝血漿。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述Tris-HCl緩衝液的濃度為10 50mmol/L。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述檢測液中氯化鈉的濃度為150 160mmol/L。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述檢測液中碳酸酐酶的濃度為 3000 5000U/L。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述檢測液中顯色劑的濃度為120 500mg/Lo
7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述檢測液還包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉。
8.一種試劑盒，其特徵在於，包括PH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。
9.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述碳酸酐酶的濃度為3500 4500U/L。
10.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，還包括標準液，所述標準液為40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉。
全文摘要
本發明公開了一種二氧化碳結合力的檢測方法和試劑盒，該檢測方法包括將二氧化碳結合力的待檢測樣品與檢測液混合，反應，得到反應液，所述檢測液包括pH值為4.8～5.2的Tris-HCl緩衝液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；檢測所述反應液在540～550nm波長下的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。在檢測過程中，所述待檢測樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，從而使反應液的pH值升高，顯色劑顯色，然後通過檢測所述反應液的吸光度值，計算得到二氧化碳結合力。與現有技術相比，本發明利用顯色反應，無需使用還原型輔酶，檢測的二氧化碳結合力具有很好的準確性。
文檔編號G01N21/78GK102156126SQ20111007223
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者董理 申請人:董理