利用體細胞核轉移胚胎作為細胞供體進行附加核轉移的方法和系統的製作方法

2023-05-08 06:31:31 1

專利名稱：利用體細胞核轉移胚胎作為細胞供體進行附加核轉移的方法和系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用體細胞核轉移方法產生的胚胎細胞作為供體進行第二輪核轉移來產生轉基因動物(「再克隆」)的改良方法，特別是非人哺乳動物。更具體地，本發明提供了再克隆以提高轉基因動物的轉基因表達和表達水平的改良方法。
背景技術：
本發明主要涉及體細胞核轉移(SCNT)領域以及目的轉基因動物的建立。更加具體地，它涉及產生體細胞來源的細胞系、轉化這些細胞系、並利用這些轉化細胞通過一輪以上的核轉移來產生轉基因非人哺乳動物種類的方法。
長久以來人們一直期望具有一定所需的特性或性質，例如增加的體重、奶量、產奶體積、哺乳間隔期以及疾病抵抗力的動物。傳統的飼養方法能夠生產具有一些特定所需特性的動物，但通常這些特性伴隨著一些不需要的性質、耗時、昂貴而不可靠。而且，這些方法根本不能使特定的動物系生產基因產品，例如所需的蛋白治療劑，從目標物種的遺傳補足物中完全缺失(如，牛乳中的蛛絲蛋白)。
能夠產生轉基因動物的技術的建立，提供了一種生產由基因改造攜帶特定特性或被設計表達某些蛋白或其它分子化合物的轉基因動物的異常精確的方法。即，轉基因動物為攜帶發育早期慎重地導入體細胞和/或生殖細胞的基因的動物。隨著動物的發育和生長，由基因工程引入動物的蛋白產品或特定的發育改變就顯現出來。
目前能獲得的產生轉基因家畜動物的技術效率低且耗時，通常產生極低比例的存活胚胎。在轉基因的建立過程中，DNA序列通常隨機插入，可能導致一系列的問題。首要問題為插入失活，它是由於編碼或調控序列被引入的DNA中斷而導致必需基因的失活。另一問題為轉基因可能根本不整合，或整合但不表達。另一個問題為由於位置效應導致不精確調控的可能性，這指基因表達水平的可變性和用同一轉基因構建體生產的不同建立者(founder)動物之間的基因調控的精確性。因此，產生大量的建立者(founder)動物且經常確定其中少於5％以保障轉基因系維持的方式表達轉基因並非罕見。
另外，產生轉基因家畜動物的效率較低，產生的100個後代中只有一個轉基因動物的效率並非罕見(Wall，1997)。結果產生轉基因動物的花費可以高達每隻表達動物25-50萬美元(Wall，1997)。
現有技術方法已經典型地在克隆程序中應用胚胎細胞類型。這包括Campbell等人(Nature，1996)以及Stice等人(Biol.Reprod.1996)的工作。在這些研究中，胚胎細胞系均來自少於10天妊娠的胚胎。在這兩項研究中，細胞都在飼餵層上維持，防止用於克隆步驟的供體細胞的明顯分化。本發明採用分化細胞。我們認為胚胎細胞類型也可能與從分化供體核起始的克隆胚胎一起用於本發明的方法。
因此，根據本發明，包括羊的哺乳動物的高級基因型的增殖是可能的。這將允許具有被證明的遺傳優越性或其它所需特性的成年動物的繁殖。在例如包括山羊、齧齒動物、牛和兔的許多重要哺乳動物物種中的進步將加速。通過本發明，可能幾十億胎兒或成年細胞可以被收穫並用於克隆程序。這將潛在地在短時期內產生許多同樣的後代。
因此，儘管已經用多種方法在幾個不同物種生產了轉基因動物，仍然缺乏以合理的成本容易地和可重複地生產能夠大量表達目的蛋白或展示轉基因的插入所導致的遺傳改變的轉基因動物的方法。而且，根據本發明，在第一輪克隆中運用體外成熟的卵母細胞，產生2-，4-，8-，16-，32-細胞、桑椹胚和胚泡，並運用這些卵裂球作為供體細胞用體內成熟的卵母細胞再克隆，可節省費用，因為體外成熟的卵母細胞可能比體內產生的卵母細胞便宜。
相應地，存在對使建立轉基因動物的生產效率提高的改良核轉移方法的需要，特別是關於通過採用一輪以上的核轉移，建立穩定表達目的轉基因的轉基因動物的活化。
發明簡述簡要地說，本發明提供了通過連續的核轉移過程克隆非人哺乳動物的方法，包括獲得所需的分化哺乳動物細胞用作供體核的來源；從與供體核來源的細胞相同物種的哺乳動物得到至少一個卵母細胞；使該至少一個卵母細胞去核；將所需的分化細胞或細胞核轉移到去核的卵母細胞；同時融合和活化細胞偶聯體(couplet)以形成第一轉基因胚胎，並使其成熟為至少兩細胞的階段；接著採用第一轉基因胚胎的至少一個細胞作為供體細胞進行至少另一輪的核轉移；培養活化的第二輪胚胎，接著利用產生的細胞或最終將第二轉基因胚胎轉移到合適的宿主哺乳動物中，因此胚胎發育為胎兒。典型地，上述方法通過利用在所述的分化的哺乳動物細胞或細胞核插入所述的去核的卵母細胞之前插入、去除或改變目的基因的供體細胞核而完成。還應該注意的是採用的卵母細胞優選為在去核之前在體外成熟的事實，但根據本發明也可以在體內成熟。
還需指出的是本申請也可以用於提高CICM細胞、胎兒或後代的實用性，例如，可以用於細胞、組織和器官移植。通過從動物中取出胎兒或成年細胞並用於克隆過程，當克隆胎兒經過器官形成而進行發育時可從中獲得一系列的細胞、組織和可能的器官。也可以從克隆後代中分離細胞、組織和器官。該方法可為多種醫學和獸醫學治療，包括細胞和基因治療提供了「材料」的來源。如果細胞被轉移回細胞來源的動物，那麼就避免了免疫排斥。因為許多細胞類型可以從這些克隆中分離，用其它的方法學，例如造血嵌合狀態可以避免同一物種以及不同物種動物之間的免疫排斥。
在優選的實施方案中，本發明的方法將通過改良供體細胞的重新編程(reprogramming)而提高核轉移的效率，並因此提高能夠在早期從單個胚胎產生的胚胎的數目。
在本發明的另一實施方案中，成熟卵母細胞可以在體外操作，以限制利用來自來源動物的體內卵母細胞的費用，因此提高了與同時利用接受者和體外供體細胞相比的效率。
本發明方法的另一有益效果為，與從單輪NT的後代相比，通過這些方法的實踐，細胞的重新編程(reprogramming)將提高得到的體細胞NT後代的健康狀況。
本發明的另一有益效果是通過利用早期的核轉移胚胎細胞作為供體細胞來產生第二代的胚胎，第二代胚胎的重新編程(reprogramming)將被增強。
在本發明的具體實施方案中，動物為轉基因動物，供體核被遺傳修飾。供體核可以含有一個或多個轉基因，且該遺傳修飾可以在核轉和胚胎重新構成前發生。
優選實施方式說明下列縮寫詞在說明書中具有指定的意義縮略詞表體細胞核轉移(SCNT)培養的內細胞團細胞(CICM)核轉移(NT)合成的輸卵管液(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶鏈反應(PCR)牛血清白蛋白(BSA)術語解釋胚泡-有胎盤哺乳動物的植入子宮前的大約30-150細胞的胚胎(小鼠受精後大約3天，人受精後大約5天)。胚泡期在桑椹胚期之後，可以通過它獨特的形態學進行區分。胚泡包括由細胞層(滋養外胚層)、充滿液體的腔(囊胚腔或胚泡腔)和內部的細胞簇(內細胞團或ICM)組成的球體。ICM由未分化細胞組成，如果胚泡植入子宮，它提供將變為胎兒的物質。這些同樣的ICM細胞，如果在培養基中生長，可以產生胚胎幹細胞系。在植入時，小鼠胚泡由大約70個滋養層細胞和30個ICM細胞組成。
囊胚-用於形容胚胎發育的早期階段的術語，由中空的細胞球密封被稱為囊胚腔的充滿液體的空腔組成。術語囊胚有時可與胚泡互換使用。
羊-不同種類山羊的或與之相關的事物。
細胞偶聯體-融合和/或活化之前的去核的卵母細胞和體細胞或胎的細胞核。
卵裂型-極早期胚胎分裂中的細胞的分裂模式；每一物種的生物體表現出可以在顯微鏡下觀察到的典型的卵裂型。背離了典型的模式通常預示該胚胎是異常的，因此卵裂型被用作胚胎植入子宮前的篩選標準。
克隆-1)一種DNA分子、細胞、組織、器官或整個植物或動物的精確複製品。2)與另一生物體具有相同的核基因組的生物體。
胚胎分裂-早期胚胎分離為具有同樣遺傳組成的兩個或多個胚胎，是產生同樣的雙胞胎或更多的個體(三胞胎、四胞胎等)所必需的。
胚胎幹(ES)細胞-來自胚胎的原始(未分化)的培養細胞，具有變成多種特定細胞類型的潛力(即，是多能性的)。它們起源於胚泡的內細胞團。胚胎幹細胞並非胚胎；它們無法自己以有組織的形式產生需要的細胞類型，例如滋養外胚層細胞，從而產生一個完全的生物體。
胚胎幹(ES)細胞系-從胚胎幹細胞建立並在實驗室培養的分裂細胞群。在胚胎幹細胞系中為那些能夠產生更多胚胎幹細胞的細胞，或在分化條件下，產生包括能在植入後胚胎、胎兒或發育的生物體中發現的大多數或所有的細胞類型的細胞集合。
去核-一種通過移除細胞核材料而只留下細胞質的方法，當應用於卵時，為母本染色體的移除，該母本染色體沒有被核膜包圍。
螢光原位雜交(FISH)-一種用特異性設計的螢光分子「點亮(lightup)」特定的基因或染色體的部分，使它們在顯微鏡下可見的技術。
螢光甚至使染色體的小基因也可見。
核體-通過去核從細胞得到的細胞核，被較淺的環形細胞質和質膜包圍。
桑椹胚-受精後3-4天的植入前胚胎，是由12-32個細胞(卵裂球)組成的實體團。在8細胞期後，植入前胚胎的細胞開始彼此間粘附更加緊密。變成「緊湊的」。得到的胚胎類似桑椹，被稱為桑椹胚(拉丁語桑屬(morus)＝桑椹(mulberry))。
核轉移-一種將細胞核從供體細胞轉移到去核的卵或受精卵(已經去除核的卵或受精卵)的過程。供體細胞核可以來自生殖細胞或體細胞。重新編程-重新設置核發育的時鐘；例如，重新設置成熟分化細胞核的發育，使其能夠進行早期胚胎細胞核的遺傳程序，製造所有胚胎發育所需的蛋白。在體細胞核轉移中，在體細胞核重新編程以行使胚胎細胞核功能的過程中，接受卵的細胞質組分被認為發揮重要的角色。再克隆或連續核轉移-該技術的第一步為通常的核轉移，其中細胞核被轉移到去核卵中，形成胚胎。在第二步中，將來自得到的克隆胚胎的核轉移到另一去核卵或去核受精卵(母系和父系前細胞核均被去除的受精卵)。第二步可以被重複一次或多次。該技術使細胞核具有兩次(或多次)機會被卵細胞質重新編程(一次在初次核轉移期間，更多次在後繼的核轉移期間)，因此潛在地提高了成功的核重新編程的機會。體細胞-植物或動物除了生殖細胞或生殖細胞前體的任意細胞。
體細胞核轉移-也稱為治療性克隆，是體細胞與去核卵母細胞融合的過程。體細胞核提供遺傳信息，而卵母細胞提供營養和其它胚胎發育需要的能量生產材料。一旦融合發生，細胞變為全能的，且最終發育為胚泡，此時細胞團分離。
轉基因生物體-一種實驗性轉移了來自另一生物體的遺傳材料的生物體，因此宿主獲得了染色體組成中轉移基因的遺傳特性。
本發明涉及提高為進行核轉移過程而建立的轉基因胚胎的數目和增強產生的胚胎的重新編程的系統。本發明提供了一種按照連續核轉移步驟的應用而生產轉基因動物的改良的方法。該性能導致生產活化轉基因胚胎效率的提高，以生產包括山羊、豬、齧齒動物、靈長類、兔和牛的多種非人哺乳動物的成活後代。
另外，本發明涉及一種克隆方法，其中將來自包括非血清飢餓分化的胎兒或成年山羊細胞的分化胎兒或成年哺乳動物的細胞核移植入與供體核同種去核卵母細胞。細胞核重新編程以指導克隆胚胎的發育，接著可以將其轉移到雌性受體以生產胎兒和後代，或用於生產培養內細胞團細胞(CICM)。克隆胚胎也可以與受精胚胎結合來生產嵌合胚胎、胎兒和/或後代。
供體細胞核與去核細胞質的融合，以及後繼的將得到的偶聯體(couplet)的活化是通過體細胞核轉移成功產生活後代所需要的重要步驟。供體細胞核與胞質的電融合為採用的最常見的方法。然而更為重要地，已經公開了一些活化方法及活化步驟時間的選擇用於核轉移的方法學以啟動多種家畜種類胚胎發育的過程。在哺乳動物中，儘管有物種差異，啟始的信號事件和後繼的受精中精子誘導的Ca+2振蕩為導致卵母細胞活化和胚胎發育的通常過程(Fissore等人，1992和Alberio等人，2001)。Ca+2動員的的化學和電學方法目前用於活化體細胞核轉移而產生的偶聯體。然而，這些方法不產生與典型的體內受精模式中精子同樣的Ca+2振蕩模式。
自從在羊中利用體細胞成功的最初報導後(Wilmut等人，1997)，已經發生了核轉移的顯著進步。已經從體細胞克隆了許多其它物種(Baguisi等人，1999和Cibelli等人，1998)，取得了不同程度的成功。許多其它胎兒和成年機體組織類型(Zou等人，2001和Wells等人，1999)，以及胚胎(Yang等人，1992；Bondioli等人，1990；以及Meng等人，1997)，也已經被報導。
根據本發明，運用重組體細胞系進行核轉移，以及通過採用「再克隆」胚胎增加可利用的細胞的數目而提高該程序的效率，不僅使通過傳統轉染方法將轉基因導入更多的轉基因動物，而且充分提高了轉基因動物生產的效率，改良了細胞重新編程，使發育為動物的轉基因胚胎正常和健康地發育。
通過本發明中採用的方法學和系統，通過體細胞核轉移產生轉基因動物，山羊，且顯示能夠在克隆動物的乳汁中產生靶治療性蛋白。
根據本發明的一個優選實施方案，從體細胞NT(核轉移)得到的在不同細胞階段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-細胞、桑椹胚和胚泡細胞階段均可以用作細胞供體通過第二輪NT(再克隆)而生產轉基因動物。
在本發明的另一個實施方案中，運用體外成熟的卵母細胞進行NT得到不同細胞階段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-細胞、桑椹胚和胚泡細胞階段均可以用作細胞供體通過第二輪NT而生產轉基因動物。
在本發明的另一個實施方案中，運用體內成熟的卵母細胞進行NT得到不同細胞階段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-細胞、桑椹胚和胚泡細胞階段均可以用作細胞供體通過第二輪NT而生產轉基因動物。
儘管前述的發明已經為理解的目的通過說明和舉例較為詳細地描述，顯然對本領域技術人員而言可以實行一定的變化和改良。因此，描述和舉例不應解釋為對本發明範圍的限制，該範圍通過附加的權利要求描繪。
材料和方法動情期同步和排卵過度的供體被用作卵母細胞供體，顯微操作按照1996年Gavin W.G.描述的進行，在此引入作為參考。原代體細胞的分離和建立，以及用作細胞核供體的體細胞的轉染和製備也按照前述的方法進行。原代體細胞為獲自採用標準的基於脂質的轉染步驟用目的基因轉染的動物組織的分化非生殖細胞。檢測轉染的細胞，按照1999年Baguisi等人的描述培養和製備轉基因陽性細胞，用作核轉移的供體細胞。應當記住去核和重建步驟可以用或不用通過DNA染色劑Hoechst 33342或其它顯示核酸的螢光感光組合物進行染色卵母細胞而進行。然而優選採用大約0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342使遺傳材料在中期板上顯現。
山羊用於本研究的純種混合飼養的無羊癢病的阿爾卑斯山羊(Alpine)、薩能奶山羊(Saanen)和託根伯格(Toggenburg)奶山羊羊群按照規範化農業(Good Agricultural Practice(GAP))指南飼養。
羊胎兒體細胞分離用作細胞核供體的原代羊胎兒纖維原細胞系來源於用從轉基因雄性動物新鮮收集的精液人工受精的2個非轉基因雌性動物的35和40天的胎兒。外科手術取出胎兒並放置在平衡磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，無Ca++/Mg++)中。切碎胎兒組織，在38℃暴露於0.025％的胰蛋白酶、0.5mM EDTA中10分鐘，製備單個細胞懸浮液。用含有10％胎牛血清(FBS)，補充了核苷、0.1mM 2-巰基乙醇、2mM L-穀氨醯胺及1％青黴素/鏈黴素(10,000I.U.每種/ml)]的胎兒細胞培養基[平衡培養基199(M199，Gibco)衝洗細胞，並在25cm2瓶中培養。孵育4天後用胰蛋白酶收集匯合單層原代胎兒細胞，然後在培養基中維持或冷藏。
區分供體細胞系的性別和基因型從胎兒組織中分離基因組DNA，並通過聚合酶鏈反應(PCR)分析靶信號序列的存在以及用於鑑別性別的序列。通過擴增一段367bp的序列檢測靶轉基因序列。採用zfX/zfY引物對和Sac I限制型內切酶消化擴增片段進行性別區分。
製備進行多輪核轉移的供體細胞轉基因雌性動物系被用於所有的核轉移程序。胎兒體細胞被種於含胎兒細胞培養基的4孔板中，並在培養基中維持(5％CO2，39℃)。48小時後，用新鮮低濃度血清(0.5％FBS)胎兒細胞培養基替換培養基。在後來的7天中，每48到72小時用低濃度血清胎兒細胞培養基替換原培養基。在第一次加入低血清培養基後的第7天，用胰蛋白酶消化收集體細胞(用作細胞核供體)。在與去核卵母細胞融合前，細胞在含有補充了2mM L-穀氨醯胺、1％青黴素/鏈黴素(10,000I.U.每種/ml)的10％FBS的平衡M199中重新懸浮1到3小時。
收集卵母細胞根據本發明的一個實施方案，進行第一輪核轉移的卵母細胞供體雌性動物按照前述的方法(Gavin W.G.，1996)進行同步化和排卵過度，且在48小時的間隔後與切除輸精管的雄性動物交配，收集卵母細胞後，將其在含有補充了2mM L-穀氨醯胺、1％青黴素/鏈黴素(10,000I.U.每種/ml)的10％FBS的平衡M199中培養。類似地，以後的核轉移也採用可能在體內或體外成熟的卵母細胞。體內成熟的卵母細胞來源於上文說明的預先用轉基因胚胎植入的供體。在收集並用於另一輪核轉移前，體外成熟的卵母細胞在體外發育至特定的細胞階段。
細胞質製備和核去除將粘附了丘細胞(Cumulus cells)的卵母細胞棄除。沒有丘細胞的卵母細胞被分為兩組停滯中期-II(arrested Metaphase-II)(單極體)和末期-II(Telophase-II)(無清晰可見的極性體或部分突出的第二極性體的存在)步驟。在停滯中期-II步驟中的卵母細胞首先被去核。通過在M199/10％FBS中培養2到4小時製備分配在活化的末期-II步驟的卵母細胞。在這期間後，所有活化的卵母細胞(具有部分突出的第二極性體)被分組為培養基誘導、鈣活化末期-II的卵母細胞(末期II-Ca)並去核。在培養期間沒有活化的卵母細胞隨後在M199，含有7％乙醇的10％FBS中孵育5分鐘誘導活化，接著在含有10％FBS的M199中另外培養3小時，達到末期-II(末期II-EtOH步驟)。
在去核前將所有的卵母細胞用細胞鬆弛素B(cytochalasin-B)(Sigma，在含有10％FBS的M199中為5□g/ml)處理15到30分鐘。用25到30□m的玻璃吸管吸取第一極性體和環繞極性體的鄰近的細胞質(～30％的細胞質)去除中期板使末期II階段的卵母細胞去核，通過去除第一極性體和含有部分突出的第二極性體的周圍的細胞質(10％到30％的細胞質)摘除分裂末期II-Ca和末期-II-EtOH卵母細胞核，去核後，對所有卵母細胞立即進行重建(reconstructed)。核轉移和重建(reconstruction)在與用於卵母細胞去核同樣的培養基中進行供體細胞注射。用玻璃吸管將一個供體細胞置於透明帶和卵質膜之間。在電融合和活化步驟之前將細胞-卵母細胞偶聯在M199中孵育30到60分鐘。重建的卵母細胞在融合緩衝液(300mM甘露醇，0.05mMCaCl2，0.1mM MgSO4，1mM K2HPO4，0.1mM穀胱苷肽，0.1mg/ml BSA)中平衡2分鐘。電融合和活化在室溫下，在充滿融合培養基的具有2個製成「融合玻片(fusion slide)」的不鏽鋼電極的融合腔(500μm間距；BTX-Genetronics，San Diego，CA)中進行。
融合使用融合玻片進行，融合玻片置於融合平皿內，平皿中注滿足夠量的融合緩衝液，覆蓋融合玻片的電極。將偶聯體從培養孵育器中移出，並用融合緩衝液衝洗。採用立體顯微鏡將偶聯體等距地置於電極之間，細胞核/細胞質的連接與電極平行。應當注意應用於增強偶聯體的活化和融合的的電壓範圍可以為從1.0kV/cm到10.0kV/cm。然而優選的起始單個同步融合和活化電脈衝具有2.0到3.0kV/cm的電壓範圍，更為優選為2.5kV/cm，優選持續時間至少為20μsec。該條件採用BTX ECM 2001 Electrocell Manipulator應用於細胞偶聯體。微脈衝的持續時間可以為10到80μsec不等。該程序後，處理的偶聯體通常被轉移到一滴新鮮的融合緩衝液中。融合處理的偶聯用平衡SOF/FBS衝洗，接著轉移到含有或不含細胞鬆弛素B的平衡SOF/FBS中。如果採用細胞鬆弛素B，它的濃度可以為1到15μg/ml不等，最優選的為5μg/ml。將偶聯體在37-39℃的空氣中含有大約5％CO2的潮溼氣體箱中孵育。應當注意，在現有公開提供的任意的操作步驟中，均可採用甘露醇代替細胞鬆弛素B(含有Ca+2和BSA的HEPES緩衝的基於甘露醇(0.3mm)的培養基)。融合後從10到90分鐘，最優選融合後30分鐘開始，確定了實際細胞核/細胞質融合的出現，進行轉基因胚胎的發育，以進行後來的植入或用於另外輪的核轉移。
環己醯亞胺處理後，用補充至少0.1％的牛血清白蛋白，優選至少0.7％，優選0.8％，加入100U/ml的青黴素和100μg/ml的鏈黴素的平衡SOF培養基(SOF/BSA)充分衝洗偶聯體。將偶聯體轉移到平衡SOF/BSA，且在含有大約6％O2、5％CO2、平衡氮氣的潮溼標準組件孵育箱中，在37-39℃無幹擾地培養24-48小時。將發育與年齡相符的核轉移胚胎(24到48小時由1個細胞到8個細胞)轉移到同步化的替代受體。
核轉移胚胎的培養和轉移至受體根據本發明的一個優選實施方案，所有的核轉移胚胎在50□l含10％FBS的覆蓋礦物油的M199小滴中，在單層原代山羊輸卵管上皮細胞上共培養。在將胚胎轉移到受體雌性動物中前，胚胎培養在39℃下，含有5％CO2的潮溼的孵育箱中維持48小時。胚胎的受體轉移按前述的方法進行。
在本發明建立過程中的試驗操作中，去核和核轉移後，細胞核/細胞質偶聯體在補充了1％到15％胎牛血清，優選10％FBS，及加入了100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的平衡的合成輸卵管液培養基(SOF/FBS)中孵育。在融合前，將偶聯體在空氣中含有大約5％CO2的37-39℃潮溼的氣體箱中孵育至少30分鐘。
通過採用至少兩輪核轉移步驟，本發明提供額外產生的活化和融合轉基因胚胎，使轉基因程序的效率提高。得到的胚胎可以植入替代動物或可以克隆增殖和儲存或利用。通過將核轉移與體外改良和選擇這些細胞的能力相結合，該程序提高了第二核轉移胚胎自身重新編程的能力，導致轉基因動物的高效生產和更健康的轉基因動物。通過這一方式，本發明比以前的轉基因胚胎技術效率更高。根據本發明，這些轉基因克隆胚胎可以用於生產CICM細胞系或其它具有增強的穩定性的胚胎細胞系。因此，本發明排除了對有助於基因工程技術的體外來源和維持的未分化細胞系的需要。
因此，一方面，本發明提供了一種克隆哺乳動物的方法。通常一個哺乳動物可以通過包括下列步驟的核轉移方法生產一種通過核轉移方法克隆非人哺乳動物的方法，包括(i)獲得目的分化哺乳動物細胞用作供體核的來源；(ii)從與供體核來源的細胞同樣種類的哺乳動物中獲得至少一個卵母細胞；(iii)使所述的至少一個卵母細胞去核；(iv)將目的分化細胞或細胞核轉移至去核的卵母細胞；(v)同時融合和活化細胞偶聯體以形成第一轉基因胚胎；(vi)培養所述的第一轉基因胚胎直至達到至少2細胞發育階段；以及(vii)利用所述第一轉基因胚胎的至少一個細胞作為供體細胞通過至少另一輪核轉移生產第二轉基因胚胎產生轉基因動物。
本發明也包括一種克隆基因工程或轉基因哺乳動物的方法，通過該方法，在將分化哺乳動物細胞或細胞核插入去核的卵母細胞之前，在分化哺乳動物細胞或細胞核中將目的基因插入、去除或修飾。
本發明還提供了根據上述方法得到的哺乳動物，以及這些哺乳動物的後代。本發明優選用於克隆羊。本發明進一步提供核轉移胎兒和核轉移和嵌合後代在細胞、組織和器官移植領域的應用。
另一方面，本發明提供一種生產CICM細胞的方法。該方法包括(i)獲得目的分化哺乳動物細胞用作供體核的來源；(ii)從與供體核來源的細胞相同物種的哺乳動物中獲得卵母細胞；(iii)所述的卵母細胞去核；(iv)將目的分化細胞或細胞核轉移至去核的卵母細胞；(v)同時融合和活化細胞偶聯體以形成第一轉基因胚胎；(vi)活化未融合以產生第一轉基因胚胎的細胞偶聯體，但是通過提供包括額外的電衝擊的至少一次附加的活化步驟而在最初電衝擊後被活化以產生第二轉基因胚胎；(vii)培養所述的活化第一和/或第二轉基因胚胎直至超過2細胞發育階段；以及(viii)培養從所述的第二轉基因胚胎得到的細胞來獲得CICM細胞。
這裡描述的方法來源的CICM細胞也可以方便地用於細胞、組織和器官移植的領域，或用於生產胎兒或後代，包括轉基因胎兒或後代。分化哺乳動物細胞為那些通過早期胚胎階段的細胞。分化細胞可以來源於外胚層、中胚層或內胚層的組織或細胞層。
哺乳動物細胞，包括人類細胞可以通過眾所周知的方法獲得。用於本發明的哺乳動物細胞包括例如，上皮細胞、神經細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T淋巴細胞)、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、單核的細胞、成纖維細胞、心肌細胞及其它肌細胞等等。另外，用於核轉移的哺乳動物細胞可以從不同的器官獲得，例如，皮膚、肺、胰、肝、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其它泌尿器官等等。這些僅僅是合適的供體細胞的實例，可用於本發明的合適的供體細胞可以從機體的任意細胞或器官獲得，包括所有的體細胞或生殖細胞。
成纖維細胞為一種理想的細胞類型，因為它們可以從發育中的胎兒和成年動物中大量獲得。成纖維細胞已分化到一定程度，因此曾被認為是不適用於克隆程序的細胞類型。重要的是，這些細胞倍增時間短，可以在體外容易地增殖，且能夠克隆增殖以用於基因打靶操作。本發明的創新之處還在於採用了分化的細胞類型。本發明的優勢在於這些細胞可以在體外容易地繁殖、遺傳修飾和篩選。
合適的卵母細胞的哺乳動物的來源包括山羊、綿羊、牛、豬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類等等。優選地，卵母細胞可以從羊和有蹄類動物獲得，且最優選山羊。分離卵母細胞的方法是現有技術中眾所周知的。基本上包括從哺乳動物如山羊的卵巢或生殖管道分離卵母細胞。山羊卵母細胞的便利來源是激素誘導的雌性動物。
為了成功運用例如基因工程、核轉移和克隆的技術，在卵母細胞作為受體細胞進行核轉移之前，以及在由精子細胞受精而發育為胚胎前，卵母細胞可以優選在體內成熟。在體內成熟的分裂中期II階段的卵母細胞已經成功地運用於核轉移技術。基本上，成熟的中期II卵母細胞是從發情後或注射了人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素幾個小時後，用外科方法從非超排卵或超排卵的動物中收集的。
而且，應當注意，通過轉基因技術改變動物基因組的能力提供了製造重組蛋白的新的選擇。在轉基因畜牧動物乳汁中的人重組醫藥品的生產解決了許多與微生物反應器相關的問題(例如，缺乏轉錄後修飾、不恰當的蛋白質摺疊、高純化費用)或與動物細胞反應器相關的問題(例如，高資金花費、昂貴的培養基、低產量)。
已經報導去核和核轉移的卵母細胞的成熟階段對核轉移方法的成功與否很重要。通常，成功的哺乳動物胚胎克隆操作採用分裂中期II階段的卵母細胞作為受體卵母細胞，因為具信在這一時期，卵母細胞能夠或充分地被活化以處理引入的細胞核，如同它處理受精精子一樣。在馴養動物中，特別是山羊中，卵母細胞活化期通常發生在精子與之接觸和穿入卵母細胞質膜的時候。
在一定時間的成熟期後使卵母細胞去核，該成熟期大約在10到40小時的範圍內，優選大約16-18小時。在去核前優選取出卵母細胞，放入含有1毫克每毫升的透明質酸酶的EMCARE培養基中，再去除卵丘細胞。可以通過反覆用極細吸液管吸液或輕微振蕩而實現。接著根據極性體的有無篩查被剝離的卵母細胞，存在極性體的為應選的分裂中期II卵母細胞，再將其用於核轉移。然後去核。
可以通過已知的方法去核，例如U.S.專利No.4,994,384中所描述的，這裡作為參考引入。例如，中期II卵母細胞被置於EMCARE培養基中，優選含有7.5微克每毫升的細胞鬆弛素B，進行立即去核，或可以置於一種合適的培養基中，例如，胚胎培養基，如加入10％FBS的CR1aa，接著進行去核，優選不多於24小時後，更優選16-18小時後。
去核可以通過採用微移液管移除極性體和周圍細胞質的顯微外科方法完成。接著可以篩查卵母細胞來鑑定已經被成功地去核的卵母細胞。篩查可以通過用含1微克每毫升的33342 Hoechst染料的EMCARE或SOF對卵母細胞進行染色，接著在少於10秒的紫外線照射下觀察卵母細胞而完成，可以將已經成功去核的卵母細胞放置在合適的培養基中。
在本發明中，受體卵母細胞將優選在體外或體內成熟開始後大約10到40小時的時間範圍內去核，更為優選在體外或體內成熟開始後的大約16小時到24小時，最優選體外或體內成熟開始後的16-18小時。
接著將與去核的卵母細胞相同物種的單個的哺乳動物細胞轉移到用於產生活化胚胎的去核的卵母細胞的卵周隙。可以根據現有技術中已知的方法將哺乳動物細胞和去核卵母細胞用於生產活化胚胎。例如，可以通過電融合融合細胞。通過提供足夠引起瞬時的質膜破裂的電脈衝而完成電融合。該質膜的破裂非常短暫，因為膜迅速重形成。因此，如果兩相鄰質膜被誘導而破裂，並由於脂質雙分子層混合重形成，兩細胞間的小通道將開放。根據這種小開放的熱動力學的不穩定性，開口將擴大直至兩個細胞合二為一。參見Prather等人的U.S.專利No.4,997,384(這裡全部引入作為參考)，該文獻對這一過程作了深入討論。可以採用多種電融介質，包括如，蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸鹽緩衝液。融合也可以用仙臺病毒作為融合劑實現(Ponimaskin等人，2000)。
另外在一些情形下(例如，小的供體核)，也可優選直接將核注射入卵母細胞，而不是採用電穿孔融合。該技術被Collas和Barnes，在Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)中公開，在此將其全部引入作為參考。
可以用已知的方法活化活化的胚胎，該方法包括，例如，在亞生理學溫度培養活化的胚胎，本質上通過對活化胚胎提供寒冷或實際上涼爽的溫度刺激。這可以最方便地通過在室溫下培養活化胚胎完成，與胚胎通常暴露的生理溫度條件相比室溫是較冷的。
另外，可以通過應用已知的活化劑而達到活化目的。例如，已經表明在受精期間精子穿入卵母細胞可活化灌注卵母細胞，從而在核轉移後產生大量可生存下來的孕胎(pregnancies)以及許多遺傳一致的小牛。融合後如電和化學休克的處理也可以用於活化NT胚胎。合適的卵母細胞活化方法可見U.S.專利No.5,496,720，Susko-Parrish等人，這裡全部引入作為參考。
另外，活化最好同時完成，儘管相繼活化的操作確實存在。在活化中，發生下列的細胞事件(i)提高卵母細胞中二價陽離子的水平，且(ii)降低卵母細胞內細胞蛋白的磷酸化作用。
可通過將二價陽離子如鎂、鍶、鋇或鈣等通過以如離子載體的形式導入卵母細胞胞質中而外界刺激發生上述事件。其它的提高二價陽離子水平的方法包括採用電休克，用乙醇處理和用caged螯合劑處理。可以通過已知方法降低磷酸化水平，如，通過加入激酶抑制劑如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和神經鞘氨醇等。另外，也可以通過將磷酸酶如磷酸酶2A和磷酸酶2B導入卵母細胞內來抑制細胞蛋白的磷酸化。
相應地，應當理解本發明的具體實施方案提供活化和融合的「再克隆胚胎」的增加的可成活率僅僅是本發明原理應用的例證。在前描述可以證明，形態的改變、採用的方法以及公開方法的特徵的應用，用於進行相繼的核轉移的轉基因胚胎的改良的應用是創新的，且可以被改良和/或採用，而不背離本發明的實質或附加的權利要求的範圍。
作為參考的引用文獻1.Alberio R，et al.，Remodeling of Donor Nuclei，DNA Synthesis，and Ploidy ofBovine Cumulus Cell Nuclear Transfer EmbryosEffect of Activation Protocol，MOL REPROD DEV 2001；59371-379.
2.Baguisi A，et al.，Production of Goats by Somatic Cell Nuclear Transfer，NATBIOTECH 1999；17456-461.
3.Booth PJ，et al.，Effect of Two Activation Treatments and Age of BlastomereKaryoplasts on In Vitro Development of Bovine Nuclear Transfer Embryos，MOLREPROD DEV 2001；60377-383.
4.Bondioli KR，Westhusin ME And CR Loony，Production of Identical BovineOffspring by Nuclear Transfer，THERIOGENOLOGY 1990；33165-174.
5.Campbell，KHS，Mcwhire J，Ritchie WA And I. Wilmut. Sheep Cloned by NuclearTransfer From a Cultured Cell Line， NATURE 1996；38064-66.
6.Collas P，and Barnes FL.，Nuclear Transplantation by Microinjection of Inner CellMass and Granulosa Cell Nuclei，MOL REPROD DEV.1994 Jul；38(3)264-7.
7.Gavin，W.G.，Gene Transfer Into Goat Embryos，in TRANSGENIC ANIMALS-GENERATION AND USE，L.M.Houdebine ed.，(Harwood Academic PublishersGmbh.，1996).
8.Kasinathan P，et al.，Effect of Fibroblast Donor Cell Age and Cell Cycle onDevelopment of Bovine Nuclear Transfer Embryos In Vitro，BIOL REPROD 2001；64(5)1487-1493.
9.Koo DB，et al.，In Vitro Development Of Reconstructed Porcine Oocytes AfterSomatic Cell Nuclear Transfer.BIOL REPROD 2000；63986-992.
10.Lai，L，et al.，Feasibility of Producing Porcine Nuclear Transfer Embryos by UsingG2/M-Stage Fetal Fibroblasts as Donors，BIOL REPROD 2001；651558-1564.
11.Park KW，et al.，Developmental Potential of Porcine Nuclear Transfer EmbryosDerived from Transgenic Fibroblasts Infected with the Gene for the GreenFluorescent ProteinComparison of Different Fusion/Activation Conditions，BIOLREPROD 2001；651681-1685.
12.Ponimaskin E，et al.，Sendai Virosomes RevisitedReconstitution with ExogenousLipids Leads to Potent Vehicles for Gene Transfer，VIROLOGY，2000 Apr10；269(2)391-403.
13.Stice SL，et al.，Pluripotent Bovine Embryonic Cell Lines Direct EmbryonicDevelopment Following Nuclear Transfer，BIOL REPROD.1996 Jan；54(1)100-10.
14.Stice SL，and Keefer CL.，Multiple Generational Bovine Embryo Cloning，BiolReprod.1993 Apr；48(4)715-9.
15.Stice SL and JM Robl，Nuclear Reprogramming in Nuclear Transplant RabbitEmbryo，BIOL REPROD 1992；47636-643.
16.Wakayama T，et al.，Full Term Development of Mice from Enucleated OocytesInjected with Cumulus Cell Nuclei，NATURE 1998；23369-374.
17.Westhusin ME，Pryor JH，and Bondioli KR.，Nuclear Transfer In The BovineEmbryoA Comparison Of 5-Day，6-Day，Frozen-Thawed，And Nuclear TransferDonor Embryos，Mol Reprod Dev.1991 Feb；28(2)119-23.
18.Wilmut I，et al.，Viable Offspring Derived From Fetal and Adult Mammalian Cells.NATURE 1997；385810-813.
19.Yang X，S Jiang，A Kovacs and RH Foote，Nuclear Totipotency of Cultured RabbitMorulae to Support Full-Term Development Following Nuclear Transfer，BIOLREPROD 1992；47636-643.
20.Yong Z And L Yuqiang，Nuclear-Cytoplasmic Interaction and Development ofGoat Embryos Reconstructed by Nuclear TransplantationProduction of Goats bySerially Cloning Embryos，BIOL REPROD 1998；58266-269.
21.Zhang Y.，and Yung Li，Biol.Reproduction 58266-69(1998).
22.Zou X，et al.，Production of Cloned Goats from Enucleated Oocytes Injected withCumulus Cell Nuclei or Fused with Cumulus Cells，CLONING 2001；3(1)31-37.
權利要求
1.通過核轉移方法克隆非人哺乳動物的方法，包括(i)獲得目的分化的哺乳動物細胞用作供體核的來源；(ii)從與供體核來源的細胞同種的哺乳動物中獲得至少一個卵母細胞；(iii)將所述的至少一個卵母細胞去核；(iv)將目的分化的細胞或細胞核轉移至去核的卵母細胞；(v)同時融合和活化細胞偶聯體以形成第一轉基因胚胎；(vi)培養所述的第一轉基因胚胎直至達到其至少2細胞發育階段；且(vii)利用所述第一轉基因胚胎的至少一個細胞作為供體細胞來通過至少另一輪核轉移生產第二轉基因胚胎產生轉基因動物。
2.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自中胚層。
3.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自內胚層。
4.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自外胚層。
5.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自胎兒體組織。
6.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自胎兒體細胞。
7.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自成纖維細胞。
8.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自有蹄類動物。
9.權利要求1或8的方法，其中所述的供體細胞或供體細胞核來自選自牛、綿羊、豬、馬、山羊和水牛的有蹄動物。
10.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自成年非人哺乳動物體細胞。
11.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞選自上皮細胞、神經細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞和肌細胞。
12.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞來自選自皮膚、肺、胰、肝、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟和尿道的器官。
13.權利要求1的方法，其中所述的至少一個卵母細胞去核前在體內成熟。
14.權利要求1的方法，其中所述的至少一個卵母細胞去核前在體外成熟。
15.權利要求1的方法，其中所述的非人哺乳動物為齧齒動物。
16.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核或供體細胞核來源的供體分化的哺乳動物細胞為非靜止體細胞或分離自所述非靜止體細胞的細胞核。
17.權利要求1或8的方法，其中胎兒發育為後代。
18.權利要求1的方法，其中所述的至少一個卵母細胞在體外成熟開始後大約10到60小時進行去核。
19.權利要求1的方法，其中在將所述的分化的哺乳動物細胞或細胞核插入所述去核卵母細胞前，在所述的分化的哺乳動物細胞或細胞核中插入、去除或修飾目的基因。
20.由權利要求1或19的方法所獲得的後代。
21.權利要求19所獲得的後代，進一步包括其中由所述核轉移過程產生的後代為嵌合的。
22.權利要求1的方法，其中克隆步驟中採用細胞鬆弛素B。
23.權利要求1的方法，其中克隆步驟中不採用細胞鬆弛素B。
24.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核來源的分化哺乳動物細胞來自體外成熟的卵母細胞。
25.權利要求24的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎最多在發育的40細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
26.權利要求24的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的32細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
27.權利要求24的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的16細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
28.權利要求24的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的8細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
29.權利要求1的方法，其中所述的用作供體核來源的分化的哺乳動物細胞來自體內成熟的卵母細胞。
30.權利要求29的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎最多在發育的40細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
31.權利要求29的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的32細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
32.權利要求29的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的16細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
33.權利要求29的方法，其中當所述的第一轉基因胚胎在發育的8細胞階段時，採用所述的第一轉基因胚胎的細胞產生至少一個所述的第二轉基因胚胎。
34.權利要求1的方法，進一步包括將所述的第二轉基因胚胎轉移到宿主哺乳動物，使胚胎發育為胎兒。
35.權利要求24或29的方法所獲得的後代。
全文摘要
本發明提供了既提高連續核轉移的效率又提高隨後產生轉基因細胞和/或動物的效率的方法。這種新方法通過採用至少第二輪核轉移，使供體細胞能夠更有效地矯正其重新編程(reprogramming)，產生更多數量的有用的轉基因胚胎。由於產生的胚胎增強了重新編程，本發明可以產生更健康的轉基因動物。
文檔編號C12N15/00GK1735338SQ200380108536
公開日2006年2月15日 申請日期2003年12月9日 優先權日2002年12月10日
發明者E·貝布迪, E·梅米利, Y·艾徹拉德 申請人:Gtc生物治療學公司