基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品及其製備方法
2023-04-25 01:21:21 2
基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法，通過序列的合成、克隆載體、目的片段和載體的連接、質粒轉化以及重組質粒的提取、凍幹保存等步驟製得基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品，本發明製備出一種包含病毒特徵序列信息、適於分析樣品中該病毒及含量水平的標準樣品；本發明提供的標準樣品均勻性好、穩定性強、可長期保存、純度好，並且製備方法過程簡單，可以為基孔肯雅病毒檢測研究、醫用研究等提供標準樣品，以實現不同實驗室結果比對，從而保證實驗室的質量控制；同時也為檢驗檢疫機構、進出口貿易等企業實現對基孔肯雅病毒的快速準確檢測提供了標準樣品。
【專利說明】基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品及其製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品及其製備方法，屬於分子生 物學領域。
【背景技術】
[0002] 基孔肯雅病毒（chikungunya virus, CHIKV)，經伊蚊傳播，以發熱、皮疫及關節疼 痛為主要特徵的急性傳染病。1952年首次在坦尚尼亞證實了基孔肯雅熱流行，1956年分離 到病毒。本病主要流行於非洲和東南亞地區，近年在印度洋地區造成了大規模流行。
[0003] 目前，基孔肯雅病毒的診斷方法主要由病毒分離、瓊脂糖免疫擴散技術、分子生物 學等診斷技術。近年來，隨著分子生物學技術的發展，實時螢光PCR技術以其快速、敏感、特 異性好的優點佔很大優勢，引起了眾多研究者的關注，但現有分子生物學檢測試劑盒多為 公司根據文獻設計陽性對照，沒有統一的標準。隨著進出口貿易的增大，檢驗流程時限縮 短，難以保證實驗室的質量控制。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，本發明研製一種基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品，可用於特 徵序列檢測時的陽性對照，以保證檢測結果的可溯源性。具體技術方案如下。
[0005] 本發明所述基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法，主要包括如下步 驟： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：並在每段序列前增加一個T7啟動 子； 2) 將合成序列平端克隆入質粒並通過酶切鑑定及膠純化； 3) 目的片段和載體的連接反應； 4) 通過感受態細菌轉化質粒； 5) 重組質粒提取； 6) 採用分光光度計法對重組質粒進行質量檢測； 7) 選取純度和完整性均合格的重組質粒，將溶液混合在一起，並再次測定濃度和純度， 然後進行分裝凍幹，將製備好的標準樣品置於_80°C冰箱保存。
[0006] 上述基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法所述步驟中還包括重組質 粒的鑑定：即從步驟4)得到的菌液中取1-3個菌落，接種於含氨苄的LB培養基中培養，提 取質粒，然後進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆。
[0007] 上述基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法所述步驟中還包括核酸序 列測定及序列對比分析：即將經PCR鑑定為陽性重組質粒的細菌測序並進行同源性分析。
[0008] 本發明所獲得的基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品，即為含有Sequence NO. 1 的核苷酸序列的重組載體。而且所述重組載體為質粒。
[0009] 進一步地，上述步驟2)所述克隆和膠純化的具體步驟為：將序列平端克隆入 PUC19質粒中；酶切鑑定選擇feoR 1和油<31作為質粒載體的克隆位點進行酶切，37°C，反應 l-2h，反應體系為 DNA 16 μ L，IOX buffer 2 μ L，feoRI 1 μ L，ZhI 1 μ L ;酶切產物經 1 % 瓊脂糖凝膠電泳，切取所需片段，膠回收純化。
[0010] 進一步地，上述步驟3)所述目的片段和載體的連接反應具體步驟為：條件為 16°C，反應16h，反應體系為：步驟2)得到的純化產物1 μ L，合成序列X μ L :其與載體的 摩爾比為 3?20 :1，T4 Ligase 1 μ L，IOX Ligase solution 1 μ L，加去離子水補齊至 10 μ L。
[0011] 進一步地,上述步驟4)所述感受態細菌轉化質粒的具體步驟為：將感受態細菌加 到預冷無菌的Eppendorf管內，取步驟3)得到的連接反應液，加到含DH5 α感受態細菌的 管中，輕混勻，冰上靜置30min，42°C熱激90s，不要搖晃管，冰上靜置5min，加不含氨苄的LB 培養基，37°C，225rpm，培養Ih得轉化液；取轉化液塗布於含氨苄的LB固體培養基上，37°C 倒置培養16h。
[0012] 本發明是基於病毒的RNA序列與cDNA序列互補的原理基礎之上，利用DNA合成技 術合成病毒的特徵核酸序列，將其克隆入質粒載體中，製備出一種包含病毒特徵序列信息、 適於分析樣品中該病毒及含量水平的標準樣品；本發明提供的標準樣品均勻性好、穩定性 強、可長期保存、純度好，並且製備方法過程簡單，可以為基孔肯雅病毒檢測研究、醫用研究 等提供標準樣品，以實現不同實驗室結果比對，從而保證實驗室的質量控制；同時也為檢驗 檢疫機構、進出口貿易等企業實現對基孔肯雅病毒的快速準確檢測提供了標準樣品。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1質粒酶切電泳圖，圖2重組質粒測序圖，圖3序列比對報告。
【具體實施方式】
[0014] 實驗材料：pUC19質粒、瓊脂糖、限制性內切酶feoR I和油al、T4 Ligase試劑 盒、膠純化試劑盒、DH5a菌株、LB培養基購於大連寶生物工程有限公司，Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System 購自 promega 公司。
[0015] 實施例1 :標準樣品的製備 1. 合成序列：利用軟體Clone Manager 7.0從GenBank上下載公開發布的序列，進行 同源性分析和引物匹配，分析確定擬合成的病毒序列：TTT TTA GCC GTA ATG AGC GTC GGT GCC CAC ACT GTG AGC GCG TAC GAA CAC GTA ACA GTG ATC CCG AAC ACG GTG AGG TAT ACG TGT CCC CTA AGA GAC ACA TTG TAT GTA GGT GAT MG TAT AGA TCA AAG GGC CGA ATA ACC CCT GAA TAG TAA CAA MT ATG MA ATC MT AM AAT CAT AM ATA GM AM CCA TM ACA GAA GTA GTT CAA AGG GCT ΑΤΑ MA CCC CTG AAT AGT AAC AM ACA TM AAT TM TM AM TCA MT GAA TAC CAT MT TGG CAA ACG GAA GAG ATG TAG GTA CTT AAG CTT CCT AM AGC AGC CGA ACT CAC TTT GAG MG TAG GCA TAG CAT ACC GM CTC TTC CAC GAT TCT CCG AAC CCA CAG GGA CGT AGG AGA TG，序列合成委託公司完成；為便於將病毒核酸序列體外轉錄成 RNA，在每段序列前增加一個T7啟動子，序列20bp :TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ; 2. 將合成序列平端克隆入pUC19質粒並通過酶切鑑定及膠純化：將序列克隆入pUC19 質粒中，經序列酶切位點分析,選擇AcoR I和油<31作為質粒載體的克隆位點進行酶切，如 圖1所示，37°C，反應l_2h，反應體系如下：
【權利要求】
1. 基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：並在每段序列前增加一個17啟動 子； 2) 將合成序列平端克隆入質粒並通過酶切鑑定及膠純化； 3) 目的片段和載體的連接反應； 4) 通過感受態細菌轉化質粒； 5) 重組質粒提取； 6) 採用分光光度計法對重組質粒進行質量檢測； 7) 選取純度和完整性均合格的重組質粒，將溶液混合在一起，並再次測定濃度和純度， 然後分裝凍幹，將製備好的標準樣品置於_80°C冰箱保存。
2. 根據權利要求1所述的基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法，其特徵在 於，所述步驟還包括重組質粒的鑑定：從步驟4)得到的菌液中取1-3個菌落，接種於含氨苄 的LB培養基中培養，提取質粒，進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克 隆。
3. 根據權利要求2所述的基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品的製備方法，其特徵在 於，所述步驟還包括核酸序列測定及序列對比分析：將經PCR鑑定為陽性重組質粒的細菌 測序並進行同源性分析。
4. 由權利要求1所述方法製備的基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品，即含有 Sequence NO. 1的核苷酸序列的重組載體。
5. 根據權利要求4所述的基孔肯雅病毒核酸分子特徵標準樣品，其特徵在於，所述重 組載體為質粒。
6. 根據權利要求1所述的標準樣品的製備方法，其特徵在於，步驟2)所述克隆和純化 的具體步驟為：將序列平端克隆入PUC19質粒中；酶切鑑定選擇feoR 1和油<31作為質粒載 體的克隆位點進行酶切，37°C，反應l_2h，反應體系為DNA 16iiL，10X buffer 2iiL，feoR I 1 y L，油al 1 y L ;酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳，切取所需片段，膠回收純化。
7. 根據權利要求1所述的標準樣品的製備方法，其特徵在於，步驟3)所述目的片段和 載體的連接反應具體步驟為：條件為16°C，反應16h，反應體系為：步驟2)得到的純化產物1 yL，合成序列 X iiL:其與載體的摩爾比為 3?20:1，T4 Ligase liiL，10X Ligase solution 1 U L，加去離子水補齊至10 ii L。
8. 根據權利要求1所述的標準樣品的製備方法，其特徵在於，步驟4)所述感受態細菌 轉化質粒的具體步驟為：將感受態細菌加到預冷無菌的Eppendorf管內，取步驟3)得到的 連接反應液，加到含DH5 a感受態細菌的管中，輕混勻，冰上靜置30min，42°C熱激90s，不要 搖晃管，冰上靜置5min，加不含氨苄的LB培養基，37°C，225rpm，培養lh得轉化液；取轉化 液塗布於含氨節的LB固體培養基上，37°C倒置培養16h。
【文檔編號】C12N15/66GK104404167SQ201410598062
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】李雲峰, 薛芳, 龍川鳳, 耿麗梅 申請人:薛芳