採用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置的製作方法

2023-05-08 06:34:56

專利名稱：採用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種探測生物晶片的光學測量裝置；特別涉及一種用光反射差法無標記高通量探測生物樣品的裝置。
背景技術：
生物大分子之間如何相互作用及調控是當前生命科學面臨的最基本問題之一，也是解釋生命本質與奧妙的重要組成部分，生物大分子相互作用的檢測是研究生物分子相互作用的關鍵。隨著生命科學進入基因組、後基因組時代，研究方法已從單個生物大分子的孤立研究擴展到具有整體性、網絡式、動態性等特點。因此發展無標記、高通量、並行檢測的方法和裝置是應時之需，已成為生命科學取得突破進展的關鍵之一。螢光標記法和表面等離子體共振法是目前具有代表性的兩種高靈敏度檢測方法。螢光標記法具有高靈敏度和高通量的特點，但需要螢光標記，存在可能改變蛋白質的性質、產生光致漂白和檢測時間長費用大等不足。如參考文獻1 =Kodadek, T. Chem. Biol. 8，105-115 0001)。表面等離子共振法雖然具有無標記和高靈敏度的特點，但由於其靈敏度來源於表面等離子的共振，不僅對生物晶片有很高的要求、而且手續繁瑣、 檢測成本比較昂貴，在高通量檢測方面具有一定的困難。如參考文獻2 f.Marmelli，等 Bioelectrochemistry 66，129(2005)。正如英國劍橋大學著名的 M. Cooper 博士在「Drug Discovery&Development"網上對生命科學傳感器的評論中指出「目前還沒有真正無標記高通量的生物傳感器」。光反射差法是近年來發展起來的一種非接觸、無損傷的高靈敏度探測新方法， 不僅可同時獲得實部和虛部兩路信號，具有很高的靈敏度，而且具有很高的空間解析度和時間解析度。本發明人和合作者首次發展了氧化物薄膜原子尺度外延生長的光反射差法原位實時探測方法，已獲授權發明和實用新型專利各兩項(專利號ZL97219032. 1 ； ZL97121997. 4 ；ZL03153938. 6 ；Z103276452. 9)。在此基礎上，本發明人和合作者分別對蛋白質、核酸等生物樣品進行了光反射差法無標記的檢測，實驗結果表明，光反射差法是無標記和高通量檢測生物大分子相互作用(如蛋白與蛋白，蛋白與核酸，核酸與核酸等)的一種好方法。本發明人和合作者已申請相關專利4項(專利申請號200810057538.0 ； 200810101699. 5 ；200810101699. 5 ；200810101700. 4)。儘管上述專利都是無標記的探測， 但都還達不到高通量探測的要求。Y. Y. Fei等採取反射鏡掃描和透鏡系統，用光反射差法實現了高通量探測。如參考文獻 3 :Υ· Y. Fei，at el, Review of scientificinstruments, 79,013708(2008)。但在此方案中，一方面通過反射鏡掃描來實現光束的掃描達到幾個微米的精度，其穩定性和重複性的要求是非常高的，因而裝置結構比較複雜。另一方面，由於透鏡不同部位對光束聚焦的畸變，使探測結果可能產生誤差，其圖像處理也是比較複雜的。因此，到目前為止，如何實現生物晶片無標記高通量的檢測仍然是一個挑戰
發明內容
本發明的目的在於，克服上述一般光反射差法探測生物晶片難以實現高通量檢測，而採用反射鏡掃描和透鏡系統的技術，使得測量裝置和圖像處理過程相當複雜的缺點； 從而提供一種採用光柵尺控制掃描實現高通量，利用透鏡和小孔裝置提高解析度與靈敏度的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置。本發明的目的之二在於應用本發明的裝置檢測蛋白質與蛋白質、蛋白與核酸、核酸與核酸等生物大分子相互作用的不同的生物樣品和不同的生物晶片的方法，該方法不僅可高通量的探測生物晶片，而且具有高的靈敏度和解析度。本發明的目的是這樣實現的本發明提供的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，包括一由雷射器 1、調製器2、普克盒3、分析器4和第一透鏡5組成的入射光路；一由小孔部件13、光電探測器14、第一鎖相放大器15、第二鎖相放大器15'和計算機系統16組成的反射光探測光路； 其特徵在於，還包括一個三維調節架11、χ軸掃描臺7、第一光柵尺8、y軸掃描臺9、第二光柵尺10和第二透鏡12 ；其中，所述的第一光柵尺8安裝在所述的χ軸掃描臺7上，所述的第二光柵尺10安裝在所述的y軸掃描臺9上；該χ軸掃描臺7和該y軸掃描臺9安放在所述的三維調節架11上，所述的χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9分別與第一光柵尺8和第二光柵尺10電連接；第一光柵尺8和第二光柵尺10分別與計算機系統16電連接；測量時生物晶片6安放在該χ軸掃描臺7上面，以便調節生物晶片6的水平；在所述的小孔部件13反射光前方光路中插入所述的第二透鏡12，第二透鏡12把從生物晶片反射的光束擴束，將從生物晶片6上表面和下表面的反射光束分開，僅探測從生物晶片6具有生物樣品的一個表面的反射光，排除了生物晶片另一個沒有生物樣品表面反射光的幹擾，提高了探測的靈敏度和信噪比；用光電探測器14檢測小孔部件13選取的從生物樣品的反射光，光電探測器14 輸出的信號同時輸入第一鎖相放大器15和第二鎖相放大器15'，第一鎖相放大器15和第二鎖相放大器15'放大後的信號輸入計算機系統16，分別檢測反射光的基頻和倍頻信號； 其中，第一光柵尺8和第二光柵尺10提供的位置移動信號，反饋給計算機控制系統，計算機控制系統根據第一光柵尺8和第二光柵尺10提供的位置移動信號，控制χ軸掃描臺7和y 軸掃描臺9的馬達按照設定的掃描範圍進行二維掃描。由於光柵尺提供的信號嚴格的與掃描臺的位移一致，與掃描的速度和均勻性沒有直接的關係，因而克服了一般掃描系統必須考慮掃描的加速、穩定等產生的影響，實現生物晶片6的二維快速掃描。在上述的技術方案中，還包括2個驅動馬達，第一驅動馬達分別與所述的χ軸掃描臺7和計算機系統16電連接，第二驅動馬達分別與所述的y軸掃描臺9和計算機系統16 電連接；χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9可以同時採用計算機通過光柵尺的信號控制馬達掃描，也可以χ軸掃描臺7(或7軸掃描臺9)採用計算機通過光柵尺的信號控制馬達掃描，y 軸掃描臺9 (或χ軸掃描臺7)不使用光柵尺，而採用計算機直接控制馬達掃描。在上述的技術方案中，所述的小孔部件13，用來選取從生物樣品表面反射光的中心部分進行探測，用光電探測器14檢測小孔部件13選取的從生物樣品的反射光，這樣相當於減小了掃描光斑，而且可排除雜散光的幹擾，因而提高了解析度。所述的小孔部件13為一塊不透明的金屬或塑料平板上開一個小孔，該小孔的直徑根據檢測需要的探測光光斑大小和形狀設計。在上述的技術方案中，還包括2個以上所述的小孔部件13，該2個以上小孔部件13串聯設置在探測光路中，或一個一個的分別放在探測光路的不同位置。當選用小孔的直徑比較小時，採用串聯的幾個小孔具有一定的優點。因為光束通過小孔後往往會產生衍射， 採用幾個串聯的小孔，後面的小孔就可阻擋和隔離前面小孔所產生的衍射光，因而可排除衍射光的幹擾和提高檢測的信躁比。在上述的技術方案中，所述的金屬平板為合金鋁板或鋼板或鐵板或塑料，並把製作了小孔的金屬板煮黑。在上述的技術方案中，所述的小孔部件上的小孔做成圓形、方形或矩形或一條狹縫；該小孔的尺寸和光束的尺寸一致，也可以比光束的尺寸小。小孔可以繞垂直於光束和入射光平面的軸旋轉360度，測量時旋轉小孔就可以在入射平面上得到需要的光斑形狀。本發明相對於已有技術具有以下優點由於在本發明的無標記高通量探測生物晶片的裝置中設置了第二透鏡，該透鏡把從生物晶片反射的光束擴束，將從生物晶片6上表面和下表面的反射光束分開，僅探測從生物晶片6具有生物樣品的一個表面的反射光，排除了生物晶片另一個沒有生物樣品表面反射光的幹擾，提高了探測的靈敏度和信噪比。本發明的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置中還利用了小孔，該小孔用來選取從生物樣品表面反射光的中心部分進行探測，用光電探測器14檢測小孔13選取的從生物樣品的反射光，這樣相當於減小了掃描光斑，而且可排除雜散光的幹擾，因而提高了解析度。本發明的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置中還包括2個驅動馬達，第一驅動馬達分別與所述的X軸掃描臺7和計算機系統16電連接，第二驅動馬達分別與所述的y軸掃描臺9和計算機系統16電連接；χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9可以同時採用光柵尺的信號用計算機控制馬達掃描，也可以χ軸掃描臺7 (或y軸掃描臺9)採用光柵尺的信號用計算機控制馬達掃描，y軸掃描臺9(或χ軸掃描臺7)不使用光柵尺，直接用計算機控制馬達掃描。本發明提供的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，由於第一光柵尺和第二光柵尺提供的位置移動信號，反饋給計算機控制系統，計算機控制系統根據第一光柵尺和第二光柵尺提供的位置移動信號，控制X軸掃描臺和y軸掃描臺的馬達，按照設定的掃描範圍進行二維掃描。由於光柵尺提供的信號嚴格的與掃描臺的位移一致，與掃描的速度和均勻性沒有直接的關係，因而克服了一般掃描系統必須考慮掃描的加速、穩定等產生的影響，實現生物晶片6的二維快速掃描。不僅實現了生物晶片無標記高通量的檢測，而且具有很高的靈敏度和解析度。適用於探測蛋白質與蛋白質、蛋白與核酸、核酸與核酸等生物大分子相互作用的不同的生物樣品和不同的生物晶片，生物晶片可以是一個生物樣品點， 也可以是成千上萬個生物樣品點的面陣生物晶片，還可以原位實時監測生物大分子的相互反應，因而在生化研究、製藥和臨床等領域具有非常廣泛的應用。


下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細的說明圖1本發明的無標記高通量探測生物晶片的裝置示意圖。圖2採用本發明無標記高通量探測核酸生物晶片獲得的基頻信號掃描成像圖。
圖3採用本發明無標記高通量探測核酸生物晶片獲得的倍頻信號掃描成像圖。圖面說明如下1-雷射器；2-調製器；3-普克盒；4-分析器；5-第一透鏡；6-生物晶片；7-x軸掃描臺；8-第一光柵尺；9-y軸掃描臺；10-第二光柵尺；11_三維調節架12-第二透鏡13-小孔；4-探測器；15-第一鎖相放大器；15'-第二鎖相放大器16-計算機系統。
具體實施例方式實施例1 參考圖1，製作一臺本發明的採用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置， 本實施例利用專利號為ZL03153938. 6所提供的光反射差法裝置進行了改造。本實施例中雷射器1選用輸出偏振光波長632. Snm的He-Ne雷射器，在雷射器1 輸出光的前方安置一個調製器2 (美國Hinds公司生產的PEM90型光彈調製器)，在調製器 2後安置普克盒3 (Cleveland Crystals公司生產的IMPACT10型普克盒)，在普克盒3後安置一分析器4(從New Focus購買的55 型偏振器)，在分析器4安置第一透鏡5，其第一透鏡5的焦距為10釐米。由雷射器1、調製器2、普克盒3、分析器4和第一透鏡5組成的入射光路；第二透鏡12選用焦距為20釐米的透鏡，在第二透鏡12後安置一小孔部件13，該小孔部件13用一塊合金鋁板經過表面煮黑，在合金鋁板中間開有直徑為1毫米小孔，在小孔部件13後安置一光電探測器14(美國Newport-Klinger公司生產的818-B8-40型矽光電二極體)，在光電探測器14的信號輸出端分別與第一鎖相放大器15和第二鎖相放大器 15'電連接，兩臺鎖相放大器均採用Manford Research Systems公司生產的SR830DSP型號的鎖相放大器，兩臺鎖相放大器分別與具有數據採集和控制的計算機系統16電連接，而組成反射光探測系統。χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9選用市場上購買的，其調節範圍為0-7 釐米的一維精密調節臺；第一光柵尺8和第二光柵尺10為雷尼紹公司的SIGNUM RELM高精度光柵尺，分別和χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9連接，並通過計算機系統16用光柵尺的信號控制χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9的掃描；χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9安置在一個三維調節架11上；選用有500多個核酸樣品點的晶片做生物晶片6，生物晶片6安放在χ軸掃描臺7上。當測量時將生物晶片6安放在該χ軸掃描臺7上面，以便調節生物晶片6的水平；在小孔部件13反射光前方光路中插入第二透鏡12，第二透鏡12把從生物晶片反射的光束擴束，將從生物晶片6上表面和下表面的反射光束分開，僅探測從生物晶片6具有生物樣品的一個表面的反射光，排除了生物晶片另一個沒有生物樣品表面反射光的幹擾，提高了探測的靈敏度和信噪比；用光電探測器14檢測小孔部件13選取的從生物樣品的反射光，光電探測器14輸出的信號同時輸入第一鎖相放大器15和第二鎖相放大器15『，第一鎖相放大器15和第二鎖相放大器15'放大後的信號輸入計算機系統16，分別檢測反射光的基頻和倍頻信號；其中，第一光柵尺8和第二光柵尺10提供的位置移動信號，反饋給計算機控制系統，計算機控制系統根據第一光柵尺8和第二光柵尺10提供的位置移動信號，控制 χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9的馬達按照設定的掃描範圍進行二維掃描。由於光柵尺提供的信號嚴格的與掃描臺的位移一致，與掃描的速度和均勻性沒有直接的關係，因而克服了一般掃描系統必須考慮掃描的加速、穩定等產生的影響，實現生物晶片6的二維快速掃描。首先打開雷射器1，從雷射器輸出的偏振光通過調製器2、普克盒3、分析器4和第一透鏡5入射到生物晶片6的表面，生物晶片6表面的反射光通過第二透鏡12的擴束，把從生物晶片上下表面的反射光分開，小孔部件13放在生物樣品點表面反射的光束中間，光電探測器14探測從小孔13透過的反射光，從探測器出來的信號經過隔直流電路後，輸入到兩臺鎖相放大器，經過放大的信號由計算機採集，並進行數據和圖像處理後，輸出結果。在生物晶片掃描以前，先把入射的雷射束調到沒有生物樣品點的表面，分別調節普克盒3和分析器4，使輸出信號為「0」，以便提高靈敏度。然後用計算機系統16和兩光柵尺分別控制 χ軸掃描臺7和y軸掃描臺9的掃描。並用計算機系統16進行數據和圖像的採集與處理， 輸出檢測結果。見圖2是在10分鐘時間內，用光反射差法無標記高通量探測500多個核酸樣品點生物晶片獲得的基頻信號掃描成像圖。見圖3是在10分鐘時間內，用光反射差法無標記高通量探測500多個核酸樣品點生物晶片獲得的倍頻信號掃描成像圖。實施例2 按實施例1實施，χ軸掃描和實施例1 一樣，χ軸掃描臺7和光柵尺8與計算機系統16連接，計算機系統16通過光柵尺的信號控制χ軸掃描臺7的掃描；y軸掃描臺9和步進馬達與計算機系統16連接，y軸掃描臺9直接通過計算機系統16控制步進馬達進行y軸掃描。第二透鏡12選用焦距為5釐米的透鏡，選用1000個蛋白質樣品點的晶片作生物晶片6，其中選擇雷尼紹公司的 SIGNUM RELM高精度光柵尺做第一光柵尺8控制χ軸掃描臺的掃描；y軸掃描臺利用計算機控制的步進馬達進行掃描；小孔部件13的小孔孔徑選取直徑為0. 5毫米。檢測蛋白質的雜交反應。首先打開雷射器1，雷射器輸出的偏振光通過調製器2、普克盒3、分析器4和第一透鏡5入射到生物晶片6的表面，生物晶片6表面的反射光通過第二透鏡12的擴束，把從生物晶片上下表面的反射光分開，小孔13放在生物樣品點表面反射的光束中間，探測器14 探測從小孔13透過的反射光，從探測器出來的信號經過隔直流電路後，輸入到兩臺鎖相放大器15，經過放大的信號由計算機採集，並進行數據和圖像處理後，輸出結果。在生物晶片掃描以前，先把入射的雷射束調到沒有生物樣品點的表面，分別調節普克盒3和分析器4， 使輸出信號為「0」，以便提高靈敏度。然後用計算機16和光柵尺8控制χ軸掃描臺7的掃描，用計算機系統16控制y軸掃描臺9的步進馬達進行y軸掃描。並用計算機16進行數據和圖像的採集與處理，輸出檢測結果。實施例3 按實施例1實施，y軸掃描和實施例1 一樣，y軸掃描臺9和光柵尺10與計算機系統16連接，計算機系統16通過光柵尺10的信號控制y軸掃描臺9的掃描；χ軸掃描臺7 和步進馬達與計算機系統16連接，χ軸掃描臺7直接通過計算機系統16控制χ軸掃描臺7 的步進馬達進行χ軸掃描。第二透鏡12選用焦距為50釐米的透鏡，具體檢測方法同實施例1和2，選用1000個蛋白質樣品點的晶片作生物晶片6，其中選擇雷尼紹公司的SIGNUM RELM高精度光柵尺做第一光柵尺8控制χ軸掃描臺的掃描；
7y軸掃描臺利用計算機控制的步進馬達進行掃描；小孔部件13的小孔孔徑選取直徑為0. 5 毫米。檢測蛋白質的雜交反應。 利用精密光柵尺提供的信號嚴格與掃描臺位移一致的特點，採用精密光柵尺控制生物晶片的二維快速掃描，實現了高通量的探測，克服了一般掃描系統由於加速度和不均勻性的影響，難以快速探測的缺點。採用透鏡和小孔裝置提高了探測的靈敏度和解析度。該方法和裝置不僅可高通量的探測生物晶片，而且具有高的靈敏度和解析度。適用於檢測蛋白質與蛋白質、蛋白與核酸、核酸與核酸等生物大分子相互作用的不同的生物樣品和不同的生物晶片。
權利要求
1.一種用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，包括一由雷射器(1)、調製器O)、普克盒(3)、分析器(4)和第一透鏡( 組成的入射光路；一由小孔部件(13)、光電探測器(14)、第一鎖相放大器(15)、第二鎖相放大器(15')和計算機系統(16)組成的反射光探測光路；其特徵在於，還包括一個三維調節架(11) ^軸掃描臺(7)、第一光柵尺(8)、 y軸掃描臺(9)、第二光柵尺(10)和第二透鏡(1 ；其中，所述的第一光柵尺(8)安裝在所述的χ軸掃描臺(7)上，所述的第二光柵尺(10)安裝在所述的y軸掃描臺(9)上；該χ軸掃描臺(7)和該y軸掃描臺(9)安放在所述的三維調節架(11)上，所述的χ軸掃描臺(7) 和y軸掃描臺(9)分別與第一光柵尺(8)和第二光柵尺(10)電連接；第一光柵尺(8)和第二光柵尺(10)分別與計算機系統(16)電連接；測量時生物晶片(6)安放在該χ軸掃描臺(7)上面；在所述的小孔部件(1 反射光前方光路中插入所述的第二透鏡(1 ；用光電探測器(14)檢測小孔部件(1 選取的從生物樣品的反射光，光電探測器(14)輸出的信號同時輸入第一鎖相放大器(1 和第二鎖相放大器(15')，第一鎖相放大器(1 和第二鎖相放大器(15')放大後的信號輸入計算機系統(16)，分別檢測反射光的基頻和倍頻信號； 其中，第一光柵尺8和第二光柵尺(10)提供的位置移動信號，反饋給計算機控制系統，計算機控制系統根據第一光柵尺(8)和第二光柵尺(10)提供的位置移動信號，控制χ軸掃描臺 (7)和y軸掃描臺(9)的馬達按照設定的掃描範圍進行二維掃描。
2.按權利要求1所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，還包括2個驅動馬達，第一驅動馬達分別與所述的χ軸掃描臺(7)和計算機系統(16) 電連接；第二驅動馬達分別與所述的y軸掃描臺(9)和計算機系統(16)電連接。
3.按權利要求1所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，還包括了第二透鏡(12)，第二透鏡(1 安放在所述的小孔部件(1 前面。所述的第二透鏡(12)的焦距為5 50釐米。
4.按權利要求1所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，所述的小孔部件(1 為一塊不透明的金屬平板或塑料平板上開一個小孔，該小孔的大小根據檢測需要的探測光光斑大小和形狀設計，並安裝在可旋轉360度的調節座上。
5.按權利要求1所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，所述的小孔部件(1 為2個以上，該2個以上小孔部件串聯設置在光反射差法用的裝置中入射光路中；所述的小孔部件前後一排串聯放在入射光路的一個位置或分開，一個一個的分別放在入射光路的不同位置。
6.按權利要求3所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，所述的金屬平板為合金鋁板、鋼板、鐵板或塑料板，並把該金屬平板煮黑。
7.按權利要求1所述的用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，其特徵在於，所述的小孔部件(1 上的小孔做成圓形、方形或矩形或一條狹縫；該小孔的尺寸和光束的尺寸一致，也可以比光束的尺寸小。
全文摘要
本發明提供一種用光反射差法無標記高通量探測生物晶片的裝置，該裝置包括一入射光路和一由小孔部件、光電探測器、第一鎖相放大器、第二鎖相放大器和計算機系統組成的反射光探測光路；還包括第一光柵尺安裝在x軸掃描臺上，第二光柵尺安裝在y軸掃描臺上；該x軸掃描臺和該y軸掃描臺安放在三維調節架上，x軸掃描臺和y軸掃描臺分別與第一光柵尺和第二光柵尺電連接；第一光柵尺和第二光柵尺分別與計算機系統電連接。利用精密光柵尺提供的信號嚴格與掃描臺位移一致，採用精密光柵尺控制生物晶片的二維快速掃描，實現了高通量的探測，克服了已有技術由於加速度和不均勻性的影響，難以快速探測的缺點。採用透鏡和小孔裝置提高了探測的靈敏度和解析度。
文檔編號G02B7/02GK102192879SQ201010128589
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優先權日2010年3月17日
發明者何立平, 原昆, 呂惠賓, 周嶽亮, 戴俊, 楊國楨, 溫娟, 王旭, 金奎娟, 陸珩 申請人:中國科學院物理研究所