抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用的製作方法

2023-05-08 00:05:06 1

抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用。通過本發明的單克隆抗體與不同支原體菌株菌體蛋白進行反應，Western?Blotting結果表明，本發明的單克隆抗體3G11隻與牛支原體分離株發生特異性免疫反應，而不與絲狀支原體絲狀亞種SC型（MmmSC）、絲狀支原體絲狀亞種LC型（MmmLC）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp)、無乳支原體(M.agalactiae)、綿羊肺炎支原體(M.ovipneumoniase)反應，說明本發明的抗牛支原體單克隆抗體具有良好的特異性，可用於牛支原體感染的診斷和檢測，從而也為該病的防控提供了一種有效的手段。
【專利說明】抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細
胞株及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種對牛支原體有特異性的單克隆抗體，產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其製備方法和應用。屬於疾病診斷和檢測領域。
【背景技術】
[0002]支原體(Mycoplasma),又稱黴形體，是目前已知的能在人工培養基中生長的最小原核微生物。支原體無細胞壁，細胞形態多形化；能夠通過0.22 μπι的細菌濾器(Nicholas&Ayling, 2003)。其基因組小，GC含量僅為27.8mol%-32.9mol%,生物合成及代謝能力低下。對青黴素等作用於細菌胞壁的抗生素有抵抗力。支原體在自然界中廣泛存在，主要分布於汙水、土壤、動植物和人體內。支原體最早於1700年在患有傳染性胸膜肺炎的牛中發現，直到1898年法國科學家RouX和Nocard用含有動物血清的人工培養基首次分離成功，並將其命名為胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonia Organism,ΡΡ0)。此後,不斷有新的類似的微生物被分離出來，統稱為類胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonsa like organism,PPL0)。1967年，國際細菌命名委員會正式將這類微生物命名為支原體，並一直沿用至今。早期的支原體研究受限於培養條件，研究進展一直很緩慢。直至1962年，Hayflick採用無細胞的支原體培養基成功分離到肺炎支原體後，支原體的研究才逐漸取得極大進展。迄今為止，人們已經分離到190多種支原體，許多能夠引起動植物多種疾病。
[0003]牛支原體(Mycoplasma bovis, Μ.bovis)在分類上屬於支原體屬，同其他支原體一樣，牛支原體具有體型微小，基因組成分微量等特徵(Caswell&Archambault, 2007)。普通光學顯微鏡不能觀察到牛支原體，只有在電鏡下才能觀察到其外表特徵。與大部分支原體一樣，牛支原體是一種宿主特異性黏膜常在菌，在牛的呼吸道黏膜、腸道黏膜，泌尿生殖到黏膜，乳腺黏膜、眼結膜 均可存在，其主要生存方式是作為寄生或作為條件致病菌的共生關係(Gevaert, 2006;Pfutzner&Sachse, 1996)。健康牛上呼吸道黏膜的牛支原體,在應激條件下，如長途運輸、天機驟變，管理不良等原因，可以轉移到其他部位，引起多種疾病(MaunseIl&Donovan, 2009)。
[0004]自Nocard在1898年從患肺炎的病牛胸前積液這兩個分離到絲狀支原體絲狀亞種(MmmSC)以來，人們一直認為MmmSC引起的牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)是危害養牛業最重要的傳染病。然而，1961年康奈爾大學的hela發現的牛支原體逐漸引起全世界的重視。
[0005]牛支原體能夠引起肺炎，中耳炎，乳房炎、角膜結膜炎等與M.bovis相關的疾病被簡稱為MbAD。MbAD在歐洲和北美廣泛流行，造成了非常嚴重的經濟損失。在英國每年超過190萬頭牛感染呼吸道疾病，約有157000頭小牛死於肺炎和相關疾病，至少有1/4-1/3是由牛支原體引起的。在美國，由於牛支原體導致乳房炎引起的損失比呼吸道引起的損失更加嚴重，每年約為1.08億美元。MbAD病原牛支原體於1961年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離到，1976確認為牛支原體感染。牛支原體在分類上地位上屬於支原體科支原體目支原體屬成員，目前由於缺乏牛支原體基因組的完整數據，所有研究工作仍然以全菌體蛋白組分與免疫血清的免疫結果為基礎進行。
[0006]2008年中國湖北省首先出現牛支原體的病例報告，此後，寧夏，貴州等十多個省市自治區相繼出現由牛支原體引起的死亡病例。據我們的統計，MbAD的死亡率可以達到38%，而且臨床症狀與已經在中國消滅的牛傳染性胸膜肺炎(0ΙΕ規定必須報告的傳染病CBPP)相似，所以最初是被當做CBPP捲土重來而引起了獸醫界的廣泛關注和焦慮。牛支原體病的快速診斷因而被提上日程。
[0007]2012年，任澤民、姜勇等以牛支原體湖北分離株HB0801作為抗原免疫8周齡BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術篩選出了 6株能穩定分泌抗牛支原體的單克隆抗體細胞株，分別生產腹水並對單抗進行了純化和特性鑑定。但是ELISA特異性分析結果表明，這6株單抗不僅與臨床分離的牛支原體菌株以及ATCC標準株PG45顯陽性反應，同時所有製備的單抗都與無乳支原體PG2有交叉反應，因此無法實現對牛支原體的特異性檢測(任澤民、姜勇等，牛支原體單克隆抗體的製備與鑑定，中國畜牧獸醫，2012年第39卷第7期)。
[0008]因此，建立一種快速、高通量的針對牛支原體感染的血清抗體檢測方法就顯得十分重要了。

【發明內容】

[0009]針對目前現有技術中存在的問題，本發明的目的之一在於提供一種能夠實現對牛支原體進行快速且特異性檢測的單克隆抗體。
[0010]本發明的目的之二在於提供一種能夠穩定分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0011]本發明的目的之三在於提供所述的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞株在製備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的應用，從而為牛支原體感染所引起疾病的防控提供了一種有效的途徑。
[0012]為了達到以上所述的目的，本發明所採用的技術手段為:
[0013]本發明以牛支原體湖北分離株Hube1-1株作為抗原免疫6周齡SPF級雌性BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術篩選出了 I株能穩定分泌抗牛支原體的單克隆抗體細胞株，分別生產腹水並對單抗進行了純化和特性鑑定。ELISA特異性分析結果表明，這株單抗僅與臨床分離的牛支原體菌株顯陽性反應，而與絲狀支原體絲狀亞種SC標準株PG1、絲狀支原體絲狀亞種LC型標準株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種中國分離株87001、無乳支原體標準株PG2、綿羊肺炎支原體標準株Y-98均不反應，因此說明了本發明的單克隆抗體能夠實現對牛支原體的特異性檢測。
[0014]本發明的一株分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3G11，分類命名為骨髓瘤雜交瘤細胞株，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060，保藏時間為2013年I月16日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0015]此外，本發明還提供了由所述的雜交瘤細胞株所分泌的抗牛支原體的單克隆抗體。及所述的雜交瘤細胞株和所述的單克隆抗體在製備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0016]圖1為融合後的細胞形態示意圖；
[0017]左圖為融合後第3天的細胞形態；右圖為融合後第9天的細胞形態；
[0018]圖2為3G11株單克隆抗體與的牛支原體Hube1-1分離株Western Blotting分析
結果;
[0019]泳道1:牛支原體Hube1-1分離株;M為蛋白分子量Marker0671 ；
[0020]圖3為3G11株單克隆抗體的特異性分析結果；
[0021]1:牛支原體Hube1-1分離株；2:絲狀支原體絲狀亞種SC標準株PGl ；3:絲狀支原體絲狀亞種LC型標準株Y-goat ；4:山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001 ；5:無乳支原體標準株PG2 ；6:綿羊肺炎支原體標準株Y-98 ；M:蛋白分子量Marker0671 ；
[0022]圖4為3G11株單克隆抗體對牛支原體各分離株的特異性分析結果。
[0023]1:牛支原體Hube1-1分離株；2:牛支原體內蒙分離株；3:牛支原體廣西分離株；4:牛支原體吉林分離株；5:陰性對照(牛血清白蛋白)；M:蛋白分子量Marker0671
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0025]實施例1抗牛支原體的單克隆抗體的製備及其特性檢測
[0026]I實驗材料
[0027]1.1細胞、菌株、基因組、實驗動物
[0028]SP2/0骨髓瘤細胞由本實驗室保存；大腸桿菌感受態細胞DH5a和BL21、牛支原體Hube1-1分離株、牛支原體內蒙分離株、牛支原體廣西分離株、牛支原體吉林分離株、絲狀支原體絲狀亞種SC標準株PGl、絲狀支原體絲狀亞種LC型標準株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001、無乳支原體標準株PG2、綿羊肺炎支原體標準株Y-98由本實驗室保存；6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心，具有合格證。
[0029]1.2工具酶及其他試劑(盒)
[0030]FBS購自GIBCO公司；卡那青黴素、購自宏博生物技術有限公司，HT、HAT (50x)培養基凍乾粉、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、二甲基亞颯、雙抗(青黴素一鏈黴素)溶液購自Sigma公司；山羊抗鼠IgG-HRP、聚乙二醇50%(MW:1450)購自Sigma ;DMEM基本培養基購自哈爾濱動物生物製品國家工程研究中心有限公司。
[0031]1.3牛支原體液體培養基配製
[0032]PPLO肉湯21g,滅活馬血清200mL,新鮮酵母浸出液IOOmL, 0.5g/mL的葡萄糖2mL,0.5g/mL的丙酮酸鈉8mL，0.5%酚紅3.2mL，用去離子水補足到IOOOmL,調節pH至7.4?7.6，經0.22 μ m濾膜過濾除菌分裝，4°C保存備用。對於初代分離需加入青黴素100U/mL，醋酸鉈終濃度為0.01%。加1%的瓊脂糖製成固體培養基待用。
[0033]1.4血清樣品牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)陽性血清PS2、口蹄疫(FMD)陽性血清、牛結核分枝桿菌(MB)陽性血清、牛病毒性腹瀉(BVDV)陽性血清、牛傳染性鼻氣管炎(IBRV)陽性血清各I份，牛支原體臨床陽性血清20份，健康牛血清20份，以上血清均保存於中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物細菌病研究室支原體課題組。
[0034]2 方法
[0035]2.1抗原的製備
[0036]牛支原體Hube1-1株按1%(ν/ν)比例接種於500mL牛支原體液體培養基，37°C培養36h收穫，菌數應達到109(XU/ml以上。13000g離心30min收穫支原體菌體沉澱。將牛支原體菌體沉澱用相當於原體積1/10的PBS重懸後，再13000g離心30min收穫支原體菌體沉澱，即洗滌，洗滌3次後，冰浴超聲破碎，功率為150w，有效時間為5min。再12000g離心20min收穫支原體菌體破碎裂解物，用BCA蛋白定量試劑盒測總蛋白濃度。定量分裝後保存於_70°C。
[0037]2.2單抗的製備
[0038]2.2.1動物的免疫
[0039]6周齡的SPF級雌性BALB/C小鼠，首免，背部皮下注射弗氏完全佐劑乳化的抗原100 μ g/只；2周後,用不完全弗氏佐劑乳化的抗原,背部皮下注射100 μ g/只，二免後14d再用不完全弗氏佐劑乳化的抗原同樣計量加強免疫一次，三免14天後，通過斷尾採取免疫鼠血液，分離血清，通過間接ELISA的方法測定小鼠血清抗體效價。在融合前三天通過腹腔注射進行加強免疫。
[0040]2.2.2骨髓瘤細胞的復甦
[0041]從液氮罐中取出凍存的SP2/0骨髓瘤細胞，迅速放入37°C水浴鍋中快速晃動至完全融化；在1000r/min離心3min ;吸棄上清，用完全DMEM細胞培養基(含20%FBS)將細胞沉澱吹散懸浮後加入有適量生長液的細胞培養瓶中，置5%C023 7°C培養箱培養；培養3-5d後進行細胞傳代，擴大培養。融合前一夜，更換培養液。
[0042]2.2.3細胞融合
[0043](I)製備飼養細胞
[0044]取一隻未免疫的BALB/C小鼠，眼眶放血，收集血清，即為陰性血清。腹部向上，固定四肢後，先撕開皮膚，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然後用吸管2-3mL(視老鼠大小而定)DMEM基礎液注入小鼠腹腔，吹吸幾次後將液體吸出放於50mL離心管中，再重複一次，此為腹腔巨噬細胞。用DMEM基礎液清洗腹腔巨噬細胞2次，用含FBS10%的完全培養基重新懸起，調整細胞數量為IO5個/mL，鋪於96孔細胞培養板中，每孔100 μ I。
[0045](2)製備免疫脾細胞
[0046]取已加強免疫的BALB/C小鼠一隻，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。腹部向下，固定四肢後，用鑷子夾住下腹部皮膚，剪一小口，撕開皮膚露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，剪開腹膜，暴露出脾臟，再換一套器械，用鑷子夾住脾臟，用剪刀去掉粘連細胞的脂肪組織，剪破脾臟外膜，放入滅菌的勻漿器中。加5mL DMEM基礎液於勻漿器中，輕輕研磨，擠壓出脾細胞，補加IOmL DMEM基礎液，靜置2min，吸取上層細胞懸液於一無菌的50mL離心管，再補加IOmL DMEM基礎液於勻漿器中，同上重複2次。1000r/min離心IOmin,棄 去上清,細胞重懸後計數。
[0047](3) SP2/0細胞骨髓瘤細胞的準備
[0048]棄掉培養瓶中的培養液，用DMEM基礎液將骨髓瘤細胞吹打下來。用DMEM基礎液洗滌2次後，重懸計數。
[0049](4)細胞融合
[0050]將SP2/0細胞與免疫脾細胞按照1:5?1:10比例加入到50mL離心管中，混合均勻後lOOOr/min，離心8min。棄淨上清，輕輕敲擊管底，使細胞沉澱略加鬆動，便於PEG充分的作用細胞。將裝有細胞混合物的離心管放於37°C水浴中。然後在Imin內慢慢滴入預溫至370C的50%PEG ImL,邊加邊輕輕用吸管尖攪拌。繼續攪拌30s，靜置30s。然後慢慢加入37°C預溫的DMEM基礎液10mL。具體方法為:第一分鐘逐滴滴入lmL，第二分鐘加2mL，第三至第四分鐘加3mL，第5分鐘加其餘的6mL，每次加時需緩慢加入，並不斷輕輕地攪拌。最後緩慢加入30mLDMEM基礎液。1000r/min離心7min，棄取上清，於37°C放置5_8min。用含20%FBS的HAT完全培養基輕柔重懸融合後的混合細胞，鋪於96孔細胞培養板中，約100 μ L/孔。於37°C，5%C02培養箱中培養。分別在融合後第3、6天吸去100 μ L/孔培養基，加入100 μ L/孔，即半換液。培養至第9、12天用含20%FBS的HT完全培養基半換液培養。
[0051]2.2.4間接ELISA方法篩選陽性克隆
[0052]2.2.4.1篩選方法的建立
[0053]米用方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度。用樣品包被液(0.5M碳酸鹽包被液)將純化的抗原按照0.25 μ g/mL、0.5 μ g/mL、0.75 μ g/mL、l.0 μ g/mL進行稀釋,將稀釋好的不同濃度的抗原縱向加入到96孔酶標板中，100 μ L/孔，370C 2h。用PBST洗板3次，每次將孔內液體棄淨。用含5%(sigma)魚明膠的PBST封閉，37°C 2h。以免疫鼠血清作為陽性對照血清，空白鼠血清作為陰性對照血清，將血清按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000進行稀釋，100 μ L/孔，橫向加入酶標板中，37°C lh。洗滌後，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG一 HRP (sigma)，100 μ L/孔，37°C lh。然後 100 μ L/孔，加入 TMB 底物顯色液，顯色 lOmin，以終止液終止反應。在450nm波長下，用酶標儀讀取其吸光值(OD值450)。選擇OD值接近於1.0，P/N值接近最大的孔所對應的抗原稀釋濃度作為抗原的最佳包被濃度。
[0054]2.2.4.2陽性克隆的篩選
[0055](I)以確定好的抗原的最佳包被濃度用包被液稀釋抗原，100 μ L/孔，加入酶標板中，37°C孵育2h ；
[0056](2)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄淨空中液體；用含5%魚明膠的pBST 封閉，100 μ L/ 孔，37°C孵育 2h ；
[0057](3)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄淨空中液體；加入按比例稀釋好的待檢樣品，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；
[0058](4)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄淨空中液體；加入1:5000稀釋的羊抗鼠 IgG — HRP (Sigma) 100 μ L/ 孔，37°C孵育 Ih ；
[0059](5)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄淨空中液體；加入TMB底物液，100 μ L/孔,避光顯色IOmin0
[0060](6)加入終止液50 μ L/孔。
[0061](7)在450nm波長下，用酶標儀讀取其吸光值。
[0062]2.2.5陽性雜交瘤細胞的克隆
[0063]採用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細胞。克隆前按照飼養細胞的製備方法製備小鼠飼養細胞層，飼養細胞用含20%FBS的完全培養基懸浮後平鋪於96孔細胞培養板中，細胞濃度為IO5個/mL，100 μ L/孔。將細胞用培養基稀釋到3個細胞/mL、5個細胞/mL、10個細胞/mL。將這三個濃度的細胞懸液分別加入96孔細胞培養板中，100 μ L/孔，使相應的每孔分別含0.3,0.5和I個細胞。放置37°C，5%C02培養箱中培養。分別在培養至第3、6、9天，半換液更新孔內培養基。在克隆後第7?9天，細胞克隆長滿1/3?1/2個視野時，即可檢測。如檢出的雜交瘤細胞生長孔有特異性抗體，可選擇抗體效價高，呈單個克隆生長，形態良好的細胞孔，繼續同法再克隆或擴大培養，一般克隆3?4輪，直到該雜交瘤細胞株完全穩定後，擴大培養到24孔細胞培養板。待24孔細胞培養板中的細胞生長良好時，可通過腹腔注射接種小鼠的方法製備腹水，並做好標記，凍存4支以上的細胞。
[0064]2.2.6單克隆抗體的大量製備
[0065]採用體內製備方案，即:預刺激BALB/C小鼠和雜交瘤細胞的腹腔注射的方法。操作過程如下:取8?10周齡的雌性BALB/C小鼠，腹腔注射滅菌的液體石蠟0.5mL/只，7?10天後腹腔注射雜交瘤細胞5xl05?IO6/只(或者一個24孔細胞板的細胞一長滿後，收集細胞注射即可)。一般在9?15天後即可產生大量的腹水。抽取腹水後，離心取中間層，測定效價，並凍存細胞。
[0066]2.3單抗的鑑定
[0067]2.3.1單抗亞類鑑定
[0068]採用抗體類型及亞類鑑定試劑盒SBA Clonotyping System/AP(SouthernBiotechnology Associates, USA),檢測單抗類型。
[0069](IWflABTS底物貯存液:lmL去離子水溶解15mgABTS，避光儲存於2_8°C (4周)
[0070](2)用ρΗ7.4的PBS稀釋捕獲抗體濃縮物至5-lOug/mL，每孔IOOul加入ELISA板(也可用免疫用的抗原包被)
[0071](3)把板子放入溼盒孵化，2_8°C至少包被12小時
[0072](4)用PBST洗板3次，每孔加滿封閉液(含1%牛血清白蛋白的PBS)
[0073](5)將板子放入室溫至少封閉I小時
[0074](6) PBST 洗板 3 次
[0075](7)每孔加入IOOul雜交瘤上清，蓋好，室溫緩慢震蕩Ih或在2-8°C孵育過夜
[0076](8) PBST 洗板 3 次
[0077](9)用封閉液1:250-1:500稀釋HRP標記的抗體，每孔IOOul，蓋好，室溫緩慢震蕩I小時
[0078](10) PBST 洗板 5 次
[0079](ll)55mM檸檬酸鹽:將525mg檸檬酸或804mg檸檬酸鈉.2Η20溶於50mL雙蒸水，用3M NaOH調節pH為4.0。IOmL 55mM檸檬酸鹽加入200ul ABTS貯存液和IOul 30%的雙氧水。
[0080](12)每孔加IOOul上述底物溶液
[0081](13)分別在顯色IOmin和20min 405nm讀OD並記錄數據。
[0082]2.3.2單克隆抗體(腹水)效價的測定
[0083]按照建立的間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法測定單克隆抗體(腹水)的效價。首先，按照最佳包被濃度包被蛋白，封閉洗滌後，將收集的腹水按照ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'10_4、10_5及10_6做連續稀釋，一般做6個稀釋度。並以骨髓瘤細胞SP2/0的培養上清按照同樣稀釋辦法稀釋作為陰性對照，按照2.2.4.1確定的ELISA方法進行檢測。
[0084]2.3.3 單抗 Western Blotting 驗證
[0085]取2.1製備的牛支原體沉澱的超聲裂解物40 μ I與2X SDS凝膠電泳上樣緩衝液和10μ1 lmol/L DTT混勻，置於沸水浴中加熱lOmin。離心10000r/min, lmin。取5ul處理後的樣品進行SDS凝膠電泳。電泳結束後，採用半乾法轉膜將蛋白轉到硝酸纖維素膜上。用I3BST洗三遍，每次lOmin。用5%魚明膠封閉2h。用PBS將小鼠腹水做1:500倍稀釋，將封閉後的硝酸纖維素膜侵入到稀釋後的小鼠腹水中，孵育lh。PBST洗三遍同上。用PBS將羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)按1:5000進行稀釋，用該液體在37°C孵育硝酸纖維素膜lh。PBST洗三遍同上。用DAB顯色液顯色後觀察。
[0086]2.3.4單抗的特異性檢驗
[0087]應用Western Blotting檢測所製備的單克隆抗體針對不同支原體菌株的特異性。選取的測試菌株有:牛支原體Hube1-1分離株、牛支原體內蒙分離株、牛支原體廣西分離株、牛支原體吉林分離株、絲狀支原體絲狀亞種SC標準株PGl、絲狀支原體絲狀亞種LC型標準株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001、無乳支原體標準株PG2、綿羊肺炎支原體標準株Y-98。用1.5mL離心管稱取0.03?0.04g各株支原體培養物沉澱，按照2.3.3方法進行檢測。
[0088]2.4間接阻斷ELISA方法的建立
[0089]2.4.1間接阻斷ELISA方法的程序
[0090]用60mmol/L CBS將ELISA抗原稀釋成0.2 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標板中，4°C靜置過夜；甩去板中的液體，用含0.05%Tween-20的PBS(PBST，pH7.2)洗板3次，力口入封閉液(含2.5%脫脂奶粉的PBST)，每孔200μ L，37°C作用Ih ;甩去液體、洗板，加入被檢的牛血清，每孔100 μ L， 37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入單抗Η)10，每孔100 μ L，37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入HRP標記的羊抗豬二抗，每孔100μ L，37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入TMB，每孔IOOyL,室溫作用15min ;加入lmol/L H2SO4 50 yL終止反應，測定0D450nm值。
[0091]2.4.2條件優化
[0092]將牛支原體牛陽性血清從10倍開始倍比稀釋加入到包被好抗原的酶標板中，100 μ L/孔，370C，Ih ;將單抗從500倍稀釋，100 μ L/孔，37°C，Ih ;加入40000倍稀釋羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，100 μ L/孔，37°C，Ih ;終止並顯色；讀取0D450值；計算待檢血清對單抗的阻斷率(％阻斷率=IOO-1OOX被檢血清OD值/陰性對照平均OD值)。取陰性對照值接近1.0，且阻斷率最大的反應條件為最佳反應條件。
[0093]2.4.3特異性檢測用建立好的間接阻斷ELISA方法檢測一下血清樣品:牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)陽性血清PS2、口蹄疫(FMD)陽性血清、牛結核分枝桿菌(MB)陽性血清、牛病毒性腹瀉(BVDV)陽性血清、牛傳染性鼻氣管炎(IBRV)陽性血清各I份。阻斷率> 50%的臨床樣品判定為陽性，阻斷率< 50%的臨床樣品判定為陰性。
[0094]2.4.4臨床樣品檢測用建立好的間接阻斷ELISA方法檢測一下血清樣品:牛支原體臨床陽性血清20份，健康牛血清20份。阻斷率> 50%的臨床樣品判定為陽性，阻斷率< 50%的臨床樣品判定為陰性。
[0095]3 結果[0096]3.1雜交瘤細胞株的篩選
[0097]3.1.1細胞融合
[0098]細胞融合後第3-6天，部分孔出現明顯細胞群落，第9天細胞在培養板孔底覆蓋到1/10?1/3的面積。融合後的細胞形態如圖1所示。
[0099]3.1.2陽性克隆的篩選
[0100]用間接ELISA方法對各孔培養上清進行篩選。經篩選並克隆後得到I株能夠穩定分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3G11，分類命名為骨髓瘤雜交瘤細胞株，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060，保藏時間為2013年I月16日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0101]3.2單抗的製備
[0102]3.2.1間接ELISA方法的建立
[0103]採用方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度。ELISA方法的最佳反應條件為:抗原包被濃度為0.5 μ g/mL，37°C，孵育2h ;用PBST洗板3遍；用含5%(sigma)魚明膠的PBST封閉，37°C 2h ;陽性對照血清稀釋倍數為1:1000,37°C Ih ;用PBST洗板3遍，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG — HRP (sigma)，100 μ L/孔，37°C孵育lh。然後100 μ L/孔，加入TMB底物顯色液，顯色lOmin，以終止液終止反應。在450nm波長下，用酶標儀讀取其吸光值(OD45tl值)，ELISA檢測結果如表I所示。
[0104]表I間接ELISA方法建立結果
[0105]
【權利要求】
1.一株分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3G11，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060。
2.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株所分泌的抗牛支原體的單克隆抗體。
3.權利要求1所述的雜交瘤細胞株在製備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應用。
4.權利要求2所 述的單克隆抗體在製備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/91GK103436496SQ201310336959
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月5日 優先權日:2013年8月5日
【發明者】辛九慶, 劉洋, 李媛, 汪洋 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱動物生物製品國家工程研究中心有限公司