人司登尼亞鈣蛋白-α的製作方法

2023-05-08 15:14:21 2

專利名稱：人司登尼亞鈣蛋白-α的製作方法
技術領域：
本發明涉及新鑑定的多核苷酸、這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途、和這些多核苷酸和多肽的生產。更具體地說，本發明的多肽被推斷鑑定為人司登尼亞鈣蛋白-α。本發明還涉及此多肽活性的抑制。
司登尼亞鈣蛋白(原稱硬骨魚鈣蛋白和血鈣蛋白)是一種由有骨魚類內分泌腺司登尼亞小體產生的抗高血鈣的糖蛋白激素。人也產生司登尼亞鈣蛋白糖蛋白。
司登尼亞鈣蛋白-α具有與甲狀旁腺素(PTH)相似的生物學活性且這兩種蛋白在哺乳動物中都顯示雙重功能。它們表現出可能因骨骼回吸作用引起的升高血鈣的活性(Endocrinology 1192249-2255(1986))並在魚類中表現降低血鈣的活性。降低血鈣的活性可能是因鰓中鈣流入的抑制而引起的(J.Exp.Biol.，140199-208(1988))。另外，在骨骼的新陳代謝中PTH具有雙相活性，即，在低劑量時它增強骨骼的形成，而在高劑量時它增強骨骼的回吸作用。相應地，此多肽本身和其拮抗劑，在不同的條件下，可以用於治療骨質疏鬆。
人們對非人類的司登尼亞蛋白小體已有了深入的研究。最近，一個來源於Anguillaaustralis的司登尼亞蛋白小體已經被純化和克隆。已經發現硬骨魚的腎臟中含有分泌顆粒-司登尼亞小體。電子顯微鏡指示此分泌顆粒有蛋白性質，可能是未知生理生化功能的激素或酶(Butkus，A.et al.Mol.Cell Endocrinol，54123-33(1987))。
從鱒魚的司登尼亞小體也已經分離純化出了一種糖蛋白，它被認作是血鈣蛋白-魚類主要的血鈣激素。這種蛋白在魚的幾個種(特別是歐洲鰻魚、tilapia金魚和鯉魚)的司登尼亞小體中含量相當大。與血鈣濃度在實驗條件下誘導增加相對應，血鈣蛋白典型地從司登尼亞小體中釋放出來。超微結構觀察顯示誘導血鈣濃度增加後產生血鈣蛋白的司登尼亞小體類型的細胞幾乎完全解體。分離得到的糖蛋白表觀分子量為54kDa(Lafeber F.P.et al.，Gen Comp.Endocrinolo，6919-30(1988))。
另外，最近結果顯示幾個硬骨魚鈣蛋白的合成多肽片段抑制彩虹鱒幼魚(Salmogairdneri)鈣的吸收。鰻魚和鮭魚的硬骨魚鈣蛋白的N-端肽段(從胺基酸1到20)在鈣吸收循環的高點上明顯抑制45Ca的吸收(可達75％)，雖然此肽段的摩爾有效劑量20至200倍於完整分子。與此相反，鰻魚的硬骨魚鈣蛋白的C-端片段(從胺基酸202-231)對鈣的吸收沒有抑制作用(Milliken C.E.et al.，Gen.Comp.Endocrinol，77416-22(1990))。
兩個鮭魚司登尼亞鈣蛋白的純化和特性以及用體外和活體模型系統檢測相對於鈣的激素分泌調節的方法也都有了描述。有關一個來自鮭魚CSλgt10 cDNA文庫的coho鮭魚司登尼亞鈣蛋白信使RNA(mRNA)的分子克隆和cDNA序列分析也有了描述。鮭魚司登尼亞鈣蛋白mRNA長度大約為2Kda，編碼一個256個胺基酸的初級翻譯產物。前33個殘基組成了激素的前蛋白區，而剩下的223個殘基構成了激素的成熟形式。(Wagner G.F.et al.，Mol.Cell Endocrinol，907-15(1992))。
本發明的多肽被推斷鑑定為人司登尼亞鈣蛋白-α。此鑑定結果是胺基酸序列同源性比較的結果。
根據本發明的一個方面，提供了一種新的推斷的成熟多肽，即人司登尼亞鈣蛋白-α，還提供了此多肽的有生物活性的和有助於診斷或治療的片段、類似物和衍生物。
根據本發明的另一個方面，提供了編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的分離核酸分子，包括mRNAs，DNAs，cDNAs，基因組DNA和其反義類似物及其有生物活性的和有助於診斷或治療的片段、類似物和衍生物。
根據本發明的另外一個方面，提供了用重組技術生產此多肽的方法，包括在促進所說蛋白的表達和所說蛋白的表達後回收的條件下，培養含有人司登尼亞鈣蛋白-α核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞。
根據本發明的另外一個方面，提供了利用此多肽或編碼此多肽的多核苷酸達到治療目的的方法，例如，治療引起腎臟、骨骼和心臟疾病的電解質紊亂，和由於此多肽的雙相活性而可用於治療骨質疏鬆症，Paget氏病和骨質石化症。
根據本發明的另外一個方面，提供了抗此多肽的抗體。
根據本發明的另外一個方面，提供了此多肽的拮抗劑，可用於抑制此多肽的活性，例如，在治療骨質疏鬆症和血鈣過少症時。引起血鈣過少症的原因很多，包括腎功能失調，甲狀旁腺肥大，嚴重感染，胰液不足或燒傷，這些情況導致從胞間液捕獲鈣。血鈣過少導致痙攣，驚厥和其它相關紊亂。
根據本發明的另外一個方面，提供了包括足夠長的與人司登尼亞鈣蛋白-α序列特異性雜交的核酸分子的核酸探針。
通過本文的講授，本領域的熟練技術人員應該清楚本發明的這些和其它一些方面。
下列附圖是本發明的實施方案的示意，但並不意味對權利要求所限制的本發明的範圍的限制。


圖1顯示人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的cDNA序列和相應的推導的胺基酸序列。胺基酸用標準的3字母縮寫表示。
圖2是從Anguilla Australis得到的司登尼亞鈣蛋白(下行)和人司登尼亞鈣蛋白-α(上行)胺基酸的比較。在170個胺基酸的重疊中有35％的相同胺基酸殘基，總體相似性為55％。
圖3是人司登尼亞鈣蛋白(上行)和人司登尼亞鈣蛋白-α(下行)的胺基酸序列比較。
圖4是描述細菌表達和純化後的人司登尼亞鈣蛋白-α的凝膠的照片。1道是標準分子量標記物，2道和3道都是人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白，但3道的蛋白濃度較高。
圖5是顯示杆狀病毒表達人司登尼亞鈣蛋白-α的結果的凝膠。
根據本發明的一個方面，提供了編碼具有圖1的推導的胺基酸序列的成熟多肽，或編碼由1994年7月15日保藏的ATCC保藏號75831的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的分離的核酸(多核苷酸)。
本發明的多核苷酸是從肺成纖維細胞衍生的cDNA文庫中發現的。它在結構上與人司登尼亞鈣蛋白家族相關。它包含一個編碼約251個胺基酸殘基的開放閱讀框架。其中前40個胺基酸殘基是推斷的前導序列，因此成熟蛋白包括211個胺基酸。此蛋白和人司登尼亞鈣蛋白之間有高度同源性，在整個胺基酸序列中有28％相同且64％相似。
本發明中的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，其中的DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈的則可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼此成熟多肽的密碼序列可以和圖l所示的密碼序列相同，也可以和保藏克隆中的相同，或者可以是因為遺傳密碼的冗餘性和簡併性而形成的一個不同的密碼序列，但此密碼序列編碼與圖1的DNA和保藏的cDNA相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或保藏cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括只有成熟多肽的密碼序列；成熟多肽的密碼序列和諸如前導序列或分泌序列或蛋白原序列的附加密碼序列；成熟多肽的密碼序列(和任選的附加密碼序列)和諸如內含子或成熟多肽的密碼序列的5′和/或3′端非編碼區的非編碼序列。
因此，『編碼多肽的多核苷酸』這個術語限定為只包括此多肽密碼序列的多核苷酸和包括附加密碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上面描述的多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1推導的胺基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變體可以是此多核苷酸天然發生的等位變異體或此多核苷酸的非天然發生的變異體。
這樣，本發明包括編碼與圖1所示同樣的成熟多肽的多核苷酸，或與保藏克隆cDNA編碼的多肽相同的成熟多肽的多核苷酸，還有這些多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖1所示的多肽或保藏克隆cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體，取代變異體和添加或插入變異體。
如上述所示，此多核苷酸可能是一個圖1所示的密碼序列或保藏克隆的密碼序列的天然發生的等位變異體的密碼序列。正如本領域所公知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的密碼序列可以在相同的閱讀框架中融合到某個多核苷酸序列中以幫助多肽在宿主細胞中的表達和分泌，比如，作為分泌序列起控制多肽從細胞中運輸出來的功能的一個前導序列。有前導序列的多肽是一個蛋白原，宿主細胞可以切掉其前導序列以形成此多肽的成熟形式。多核苷酸還可以編碼一個由成熟蛋白和附加的5′胺基酸殘基組成的蛋白原。有序列原的成熟蛋白是蛋白原，是此蛋白的無活性形式。一旦序列原被切除就形成了一個有活性的成熟蛋白。
這樣，例如，本發明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同時具有序列原和前序列(前導序列)的蛋白。
本發明的多核苷酸還可以具有與標記序列框內融合在一起的密碼序列，以利於本發明的多肽的純化。標記序列最好是由例如pQE-9或pQE-60載體提供的六組氨酸標記，以用於細菌宿主中與標記融合的成熟多肽的純化，或者，例如，當用哺乳動物宿主(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)標記。HA標記與流感血細胞凝集素蛋白衍生而來的抗原決定簇相對應(Wilson，I.，et a1.，Cell，37767(1984))。
本發明還涉及這樣的多核苷酸，即當與上面描述的序列有最少50％和最好70％相同的序列時可與之雜交。特別涉及在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。正如此處用到的一樣，『嚴格條件』這個術語是指只有當序列之間有至少95％和最好至少97％相同時才能雜交。在一優選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼與圖1的cDNA或保藏cDNA編碼的成熟多肽的生物功能和活性實質上相同的多肽。
本文提及的保藏物按照國際承認的用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約而保持。這些保藏物只是為了本領域熟練技術人員方便才提供，不是對根據35U.S.C.§112對保藏物的索取的認可。保藏物中的多核苷酸序列，還有由此編碼的多肽胺基酸序列在本文作為參考，在與本文的序列描述有衝突的情況下，它們是決定性的。製造、使用或銷售這些保藏物需要許可證。這樣的許可證本文不授予。
本發明還涉及這樣的司登尼亞鈣蛋白-α多肽，即有著圖1的推導的胺基酸序列或有保藏cDNA編碼的胺基酸序列，和這種多肽的片段、類似物和衍生物。
當指圖1的多肽或由保藏cDNA編碼的多肽時，術語『片段』、『衍生物』和『類似物』的意思是指保留與此多肽相同的生物學功能或活性的多肽。這樣，類似物就包括切除蛋白原部分能被激活產生活性成熟多肽的蛋白原。
本發明中的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優選是重組多肽。
圖1的多肽或保藏cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)由一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選是保守性胺基酸殘基)取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中包括一個取代基團的多肽，或(iii)此成熟多肽與另一個化合物融合的多肽，比如延長此多肽半壽期的化合物(例如，聚乙烯乙二醇)，或(iv)有附加胺基酸與此多肽融合的多肽，比如前導序列或分泌序列或用於純化此多肽的序列或蛋白原序列。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，優選達到了純化均一性。
術語「分離的」是指材料從其原始環境(如，如果是天然發生則是其天然環境)中被移走。例如，在一個活的動物體內存在的天然發生的多核苷酸或多肽不是分離的，而從天然系統中的一部分或所有共存材料中分離出來的同樣的多核苷酸或多肽就是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是某組合物的一部分，只要這些載體或組合物不是其天然環境的一部分，則其仍是分離的。
本發明還涉及包含本發明的多核苷酸的載體，用本發明的載體製造的遺傳工程宿主細胞和用重組技術生產的本發明的多肽的產品。
宿主細胞是用本發明的載體(例如克隆載體或表達載體)進行遺傳操作(轉導或轉化或轉染)的。載體可以是，例如，質粒、病毒顆粒、噬菌體等等的形式。工程化宿主細胞可以在被修飾成適合激活啟動子、選擇轉化體或擴增司登尼亞鈣蛋白-α基因的傳統營養培養基上培養。培養條件，如溫度、pH值等與以前用在表達用宿主細胞的條件相同，這些條件對一般熟練技術人員是公知的。
本發明中的多核苷酸可以被用來通過重組技術生產多肽。這樣，比如，此多核苷酸序列可以包含在用於表達多肽的眾多表達載體中的任一種中。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，比如，SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；質粒和噬菌體DNA組合衍生而來的載體；病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。總之，只要能在宿主體內複製存活，任何質粒和載體都可以用。
適當的DNA序列可以通過各種各樣的步驟插入載體。一般來說，DNA序列通過本領域公知的程序插入合適的限制性內切酶位點內。這些和其它步驟對本領域熟練技術人員是公知的。
表達載體中的DNA序列與合適的表達調控序列(啟動子)連接在一起以指導mRNA合成。這些啟動子的一些有代表性的例子有LTR或SV40啟動子，大腸桿菌的lac或trp啟動子，λ噬菌體PL啟動子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中的表達的啟動子。表達載體還含有翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體還可以含有擴增表達用的適當序列。
此外，表達載體最好含有提供篩選轉化的宿主細胞的表型性狀的基因，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或大腸桿菌用的四環素或氨苄青黴素抗性。
含有上述適當DNA序列和適當啟動子或調控序列的載體可以用來轉化適當宿主以使宿主表達此蛋白。
適當宿主的一些有代表性的例子有諸如大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；諸如酵母的真菌細胞；諸如果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；諸如CHO，COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞；腺病毒；植物細胞等。通過本文的講授，適當宿主細胞的選擇是本領域熟練技術人員所公知的。
更具體地說，本發明還包括上面廣泛描述的一個或多個序列的重組構建體。這些構建體包括其中本發明中的序列以正向或反向插入的載體，如質粒或病毒載體。在本實施方案的一個優選方面中，此構建體還包括與序列可操作連接的調控序列，包括，比如，啟動子。大量的適當載體和啟動子都是本領域熟練技術人員所公知的，而且都是可以買到的。下述載體作為例子提供參考。細菌載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。總之，只要能在宿主體內複製存活，任何質粒和載體都可以用。
啟動子區可以用CAT(氯黴素轉移酶)載體或有選擇性標記的其它載體從任何目標基因中選擇。兩個合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，反轉錄病毒的LTRs和鼠金屬硫蛋白-I。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和啟動子。
在一個進一步的實施方案中，本發明還涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等真核細胞，如哺乳動物細胞，或是低等真核細胞，如酵母細胞，或是原核細胞，如細菌細胞。將構建體導入宿主細胞可以通過磷酸鈣轉染法，DEAE-葡聚糖介導的轉染法，或電穿孔法(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in MolecularBiology，(1986))。
宿主細胞內的構建體可以用傳統的方式生產重組序列編碼的基因產物。本發明中的多肽也可以用傳統的肽合成儀來合成生產。
在適當啟動子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動物細胞，酵母細胞，細菌細胞或其它細胞中表達。用本發明的DNA構建體衍生的RNA通過無細胞翻譯系統也可以用來生產此蛋白。原核和真核宿主用的適當的克隆和表達載體在Sambrook，et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)中有描述，此處作為參考文獻列出。
編碼本發明的多肽的DNA在高等真核細胞中的轉錄在載體插入一個增強子序列時得到提高。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子增強基因的轉錄。例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子，細胞肥大病毒早期啟動子增強子，在複製起始點晚期一側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體包括複製起始點和允許宿主細胞轉化的選擇性標記，如大腸桿菌的氨苄青黴素抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因，和高表達基因來源的指導下遊結構序列轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以由編碼諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的糖酵解酶，α-因子，酸性磷酸化酶，熱休克蛋白或其它蛋白的操縱子衍生而來。外源結構序列在適當相與翻譯起始和終止序列，和能指導翻譯的蛋白分泌到周質空間或細胞外培養基的前導序列裝配在一起。外源序列可編碼包括一個賦予其期望特性的N-端鑑定多肽的融合蛋白，所述特性如表達的重組產物的穩定性和純化簡便性。
細菌細胞用的有用的表達載體通過將編碼目標蛋白的結構DNA序列和合適的翻譯起始和終止信號插入可操作的閱讀框架中，再插入一個功能啟動子構建而成。載體將包括一個或多個表型選擇性標記和確保載體持續存在的(如果需要，提供載體在宿主體內擴增的)複製起始點。轉化用的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌和假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬中的各個種，雖然其它的菌也可以用來作宿主。
作為一個有代表性的但非限制性的例子，細菌用的有用的表達載體可以包括一個選擇性標記和從市售的包括克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件的質粒衍生而來的細菌複製起始點。這些商購載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322「骨架」部分與適當的啟動子和待表達結構序列整合在一起。
當合適的宿主轉化並生長到適當的細胞密度後，選用的啟動子即可用適當的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導，細胞再培養一段時間。
細胞經離心後收穫，用物理或化學的方法破碎細胞，得到的粗提物留作進一步純化用。
表達蛋白用的微生物細胞可以用任何傳統的方法進行破碎，包括凍融法、超聲波法、機械破碎法、或使用細胞裂解試劑，這些方法對本領域熟練技術人員是公知的。
各種各樣的哺乳動物細胞培養系統也可以用來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包括一個複製起始點，一個合適的啟動子和增強子，和任何必需的核糖體結合位點，多腺苷酸位點，剪接供體和受體位點，轉錄終止序列，和5′端非轉錄序列。SV40剪接而來的DNA序列和多腺苷酸位點可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。
用硫酸銨或乙醇沉澱，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析或植物凝集素層析等方法可將人司登尼亞鈣蛋白-α從重組細胞培養物中回收並純化出來。如果需要，可以使用蛋白質再摺疊步驟以完成成熟蛋白的構象。最後，可以使用高效液相層析(HPLC)來完成最後的純化步驟。
本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成方案的產物，或是用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)中生產。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括一個起始的甲硫氨酸胺基酸殘基。
人司登尼亞鈣蛋白-α可以用於大量電解質類疾病的治療。動脈血壓過高的一個原因是由於Na-K泵缺乏或抑制造成的不正常的Na+穿過血管平滑細胞細胞壁的運輸，另外一個原因是如同已經在人的幾種形式的高血壓中描述的那樣的Na+通透性提高。總的結果是細胞內Na+提高，使細胞對血管收縮因子更加敏感。因為Ca++跟隨著Na+，推測正是由於細胞內Ca++的積累而非Na+的積累引起交感神經刺激敏感性增加。相應地，因為人司登尼亞鈣蛋白-α可以發揮降血鈣因子的功能，所以它可以幫助降低這種增加的細胞內Ca++，降低或防止高血壓。
另外，高血鈣還與心率不齊，昏迷和心跳驟停有關。因此，人司登尼亞鈣蛋白-α可以通過降低自由Ca++的濃度來發揮其對這類紊亂的治療價值。
高血壓還直接與腎臟紊亂有關。相應地，過高或過低的電解質濃度可以引起腎臟功能失調，並直接導致其它的紊亂。例如，鈣-磷失衡可以引起肌肉和骨骼疼痛，骨骼脫礦化作用和包括大腦、眼睛、心肌和血管的各種器官的鈣化。因此，本發明的多肽可以用來緩解由於鈣-磷失衡引起的紊亂。腎臟功能失調本身導致血液中不正常的高濃度磷酸鹽，用人司登尼亞鈣蛋白-α可以將其降至正常濃度。
人司登尼亞鈣蛋白-α對某些骨骼疾病的治療也是很有用的。其中，它在骨骼的新陳代謝中可能具有雙相活性，即，在低劑量時它增強骨骼的形成，而在高劑量時它增強骨骼的回吸作用。因此，低劑量的人司登尼亞鈣蛋白-α可以用於治療骨質疏鬆，高劑量可以用於治療骨骼石化，骨骼石化是由於骨骼的過度生長和硬化引起的，標誌是骨皮質的顯著加厚和骨髓腔的窄化和填充。
高血鈣的起因可能也是大量不同的紊亂包括甲狀旁腺肥厚症，維生素D過多症，通過破壞骨骼升高血清鈣濃度的腫瘤，肉樣瘤病，甲狀腺腫大，腎上腺機能不全，血清白蛋白下降，次生腎臟疾病，過量的胃腸鈣吸收和血漿蛋白濃度提高。相應地，人司登尼亞鈣蛋白-α在降低高血鈣和其相關紊亂方面是有效的。
人司登尼亞鈣蛋白-α對與不正常電解質濃度和體液失衡有關的其它紊亂的治療也是有用的，如migraine頭痛。
全長的人司登尼亞鈣蛋白-α基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針以分離全長的基因和分離其它的與此基因有高度序列相似性或相似的生物學活性的基因。這種探針可以是，例如，在20和2000個鹼基之間。但是探針優選具有30到50個鹼基對。此探針還可以用於鑑定與全長轉錄本相對應的cDNA克隆和含有包括調控和啟動子區域，外顯子和內含子的完整人司登尼亞鈣蛋白-α基因的基因組克隆。篩選的一個例子包括通過使用已知的DNA序列合成一個寡聚核苷酸探針分離基因的編碼區。具有與本發明基因互補的序列的標記寡聚核苷酸用於篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫以測定探針雜交到文庫的哪個成員上。
本發明提供了一種鑑定人司登尼亞鈣蛋白-α受體的方法。可以通過本領域熟練技術人員所公知的大量方法鑑定編碼此受體的基因，例如，配體淘選法和FACS分類法(Coligan，et al.，Current Protocols in Immun.，1(2)，Chapter 5，(1991))。優選是，使用表達克隆法，其中多腺苷酸RNA是從對人司登尼亞鈣蛋白-α敏感的細胞中製備，將從此RNA產生的cDNA文庫分成多個集合體並用於轉染對人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白不敏感的COS細胞或其它細胞。在玻片上生長的轉染細胞用標記的人司登尼亞鈣蛋白-α處理。可以通過碘化作用或引入位點特異性蛋白激酶的識別位點等不同方法標記司登尼亞鈣蛋白-α。固定和溫育後，將玻片進行放射自顯影分析。鑑定陽性克隆集合體，製備亞集合體並用迭代亞集合和再篩選程序重新轉染，最後得到一個編碼推斷受體的單克隆。
作為受體鑑定的替代方法，標記的人司登尼亞鈣蛋白-α可以與細胞膜或是表達受體分子的抽提製備物光親合連接。交聯材料通過PAGE來分辨並置於X-光膠片上使膠片曝光。可以切下含有配體-受體複合物的標記複合物，分離成多肽片段，並進行蛋白質微量序列測定。從微量序列測定獲得的胺基酸序列用來設計一套簡併的寡聚核苷酸探針來篩選cDNA文庫以鑑定編碼推斷受體的基因。
本發明還提供了篩選化合物以鑑定人司登尼亞鈣蛋白-α的刺激劑和拮抗劑的方法。作為一個例子，可以進行生物分析測定，其中分析成分包括在細胞膜表面表達人司登尼亞鈣蛋白-α受體的哺乳動物細胞或膜製備物，標記的鈣，例如45Ca++，和待篩選的化合物。如果化合物是一個有效的人司登尼亞鈣蛋白-α刺激劑，它將模仿人司登尼亞鈣蛋白-α受體配體，以使在無人司登尼亞鈣蛋白-α時細胞或膜有45Ca++吸收。通過利用放射性標記可以測定45Ca++吸收的量。當篩選拮抗劑時，將人司登尼亞鈣蛋白-α加入生物分析測定中，以同樣的方式可以測定化合物通過幹擾人司登尼亞鈣蛋白-α和其受體之間的相互作用而抑制45Ca++吸收的能力。
或者，可以在此化合物存在和不存在時測定並比較人司登尼亞鈣蛋白-α和其受體之間相互作用後一個已知的第二信使系統的反應。此第二信使系統包括但不限於，cAMP鳥甘酸環化酶，離子通道或磷酸肌醇水解。
潛在的人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑包括抗體或在有些情況下包括寡聚核苷酸，它們與人司登尼亞鈣蛋白-α結合併消除其功能。拮抗劑還包括與人司登尼亞鈣蛋白-α受體結合併有效地將人司登尼亞鈣蛋白-α封閉在受體之外的多肽。這些多肽是與人司登尼亞鈣蛋白-α緊密相關的但喪失了天然生物學功能的蛋白，一個例子是人司登尼亞鈣蛋白-α的突變形式。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還包括反義構建體。反義技術可以通過三螺旋形成或反義DNA或RNA用來控制基因表達，兩種方法都是基於多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼區用來設計長度為從10到40個鹼基對的反義RNA寡聚核苷酸。設計一個DNA寡聚核苷酸與基因的轉錄區域互補(三螺旋-參考Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；和Dervan et al.，Science，2511360(1991))，從而防止轉錄和人司登尼亞鈣蛋白-α的產生。反義RNA寡聚核苷酸在體內與mRNA雜交並阻斷mRNA分子翻譯成人司登尼亞鈣蛋白-α多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上面描述的寡聚核苷酸也可以送遞到細胞內以使反義RNA或DNA在體內表達，從而抑制人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的產生。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還包括與多肽的活性位點結合使多肽不能發揮生物學功能的小分子。小分子的例子包括但不限於小肽或類肽的分子。
拮抗劑可以用於阻斷高濃度的人司登尼亞鈣蛋白-α引起的骨骼回吸作用的激活，並相應地可以用於治療骨質疏鬆症。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還可以用於治療需要提高鈣水平的血鈣過少症和Paget氏病等紊亂。此拮抗劑可以在一個含有藥物可接受載劑的組合物中使用，例如，按照下面的描述。
本發明的人司登尼亞鈣蛋白-α多肽和刺激劑和拮抗劑化合物可以與適當的藥物載體組合後使用。這樣的組合物包括藥物有效量的本發明多肽，和藥物可接受的載體和賦形劑。這樣的載體包括但不限於鹽類，緩衝鹽類，葡萄糖，水，甘油，乙醇，和它們的組合。配方應當適合給藥方式。
本發明還提供了藥物包或藥盒，包括裝有一種或多種本發明的藥物組合物成分的一個或多個容器。隨這些容器還附有一份控制藥品與生物製品的製造，使用或銷售的政府機構規定的公告，此公告反映製造，使用或銷售機構同意此藥物用於人類使用。另外，此藥物組合物可以與其它藥物化合物聯合使用。
此藥物組合物可以以諸如口服，局部，靜脈內，腹膜內，肌肉內，皮下，鼻內，或皮內途徑的傳統方式給藥。此藥物組合物以對特定適應症的治療和/或預防有效的劑量使用。一般來說，此藥物組合物的使用劑量為最低大約每天每千克體重10微克，大多數情況下使用劑量不超過每天每千克體重約8毫克，在大多數情況下，考慮到給藥途徑、症狀等，劑量為每天每千克體重約10微克至1毫克。
根據本發明，人司登尼亞鈣蛋白-α多肽，和也是多肽的刺激劑和拮抗劑可以經體內表達而應用，即經常被稱為「基因治療」。
如此，例如，在體外用編碼此多肽的多核苷酸(DNA或RNA)可以將病人的細胞進行工程化，然後將工程化的細胞提供給需用此多肽治療的病人。這些方法是本領域所熟知的。例如，通過使用含編碼本發明的多肽的RNA的反轉錄病毒顆粒用本領域公知的程序將細胞進行工程化。
同樣地，可以用，例如，本領域公知的程序，將細胞在體內進行工程化，以使多肽在體內表達。正如本領域公知的那樣，將生產含有編碼本發明的多肽的RNA的反轉錄病毒顆粒的生產細胞給予患者，以使細胞在體內工程化並在體內表達此多肽。通過本發明的講授，這些和其它一些有關本發明的多肽的給藥方法對本領域熟練技術人員來說應該是清楚的。例如，工程化細胞的表達載體可以不僅僅是反轉錄病毒，例如，可以是結合一種適當送遞載體後用於將細胞在體內工程化的腺病毒。
本發明還涉及司登尼亞鈣蛋白-α基因作為檢測與突變的人司登尼亞鈣蛋白-α的存在相關的疾病或疾病的易感性的診斷測試的一部分。這類疾病涉及人司登尼亞鈣蛋白-α的低水平表達，例如，高血壓。
可以通過各種各樣的技術在DNA水平上檢測在人司登尼亞鈣蛋白-α基因內攜帶突變的個體。用於診斷的核酸可以從患者的諸如血液，尿液，唾液，組織活體解剖和屍檢材料的細胞中獲得。基因組DNA可以直接用於檢測或在分析之前通過PCR(Saili etal.，Nature，324163-166(1986))酶法擴增。RNA和cDNA也可以用於同樣目的。作為一個例子，與編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的核酸互補的PCR引物可以用於鑑定和分析人司登尼亞鈣蛋白-α突變。例如，可以通過與正常基因型相比擴增產物大小的變化來檢測缺失和插入。可以通過將擴增DNA與放射性標記的人司登尼亞鈣蛋白-αRNA或與放射性標記的人司登尼亞鈣蛋白-α反義RNA序列雜交來鑑定點突變。通過RNase A消化或通過解鏈溫度的不同可以將配對正確的序列從錯配雙螺旋中區分出來。
基於DNA序列差異的遺傳測試可以通過檢測在有或沒有變性試劑時凝膠中DNA片段電泳遷移率的改變來完成。通過高解析度凝膠電泳可以看見小的序列缺失和插入。在變性甲醯胺梯度凝膠上可以區分不同序列的DNA片段，其中根據其特定解鏈溫度或部分解鏈溫度，不同DNA片段的遷移被阻滯在凝膠的不同位置(參考，例如，Myers et al.，Science，2301242(1985))。
這樣，通過諸如雜交，RNase保護，化學裂解，直接DNA測序或使用限制酶(例如，限制性片段長度多態性(RFLP))和基因組DNA的Southern雜交的方法來完成某特定DNA序列的檢測。
除了更常規的凝膠電泳和DNA測序外，還可以通過原位分析來檢測突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。此序列特別指向並能與某單個人類染色體的特定位點雜交。更進一步地，目前需要鑑定染色體上的特定位點。目前僅有很少幾個在實際序列數據(重複多態性)基礎上的染色體標記試劑可用於標記染色體位點。根據本發明，將DNA定位到染色體在聯繫序列與疾病相關基因方面是重要的第一步。
簡單地說，通過從cDNA製備PCR引物(優選15-25bp)可以將序列定位到染色體上。序列的3』不翻譯區的計算機分析用於快速選擇在基因組DNA中不跨越超過一個外顯子的引物，否則將會使擴增過程複雜化。然後這些引物被用於PCR法篩選含有單個人類染色體的體細胞雜交體。只有含與引物相對應的人類基因的雜交體才能產生擴增片段。
體細胞雜交體的PCR定位是將某特定DNA定位於某特定染色體的一個快速方法。用與本發明相同的寡聚核苷酸引物，和特定染色體來源的片段或大的基因組克隆集合體，可以以類似的方式完成亞定位。其它類似的可用於定位到染色體的作圖策略包括原位雜交，用標記的流選的染色體預篩選和通過與結構染色體特定cDNA文庫雜交進行預篩選。
將某cDNA克隆螢光原位雜交(FISH)到某中期染色體帶上可以用來提供精確的一步法染色體定位。此技術可使用短到500或600個鹼基的cDNA；但是，大於2,000個鹼基對的克隆更有可能以適於簡單識別的足夠的信號強度結合到一個單一的染色體位點上。FISH需要使用可以產生表達序列標記(EST)的克隆，而且越長越好。例如，2,000鹼基對是好的，4,000鹼基對更好，從時間的合理百分比的角度來說，超過4,000個鹼基對對得到好的結果可能是不必要的。有關此技術的綜述，參閱Verme et al.，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某序列被精確定位到染色體上，此序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數據相吻合。舉例來說，這些數據在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(通過Johns Hopkins University Welch Medical Library可以找到)被發現。然後，已經被定位到相同染色體區域的基因與疾病之間的相互關係通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)進行鑑定。
下一步，有必要分析感染的和未感染的個體之間cDNA或基因組序列的差異。如果觀察到在一部分或全體感染個體中有突變，而在正常個體中沒有，那麼此突變可能就是病因。
以目前的物理圖譜和遺傳圖譜技術的解析度，精確定位到與疾病相關的某染色體區域的cDNA可能是50-500個潛在病原基因中的一個。(假設圖譜解析度為1百萬個鹼基，每2萬個鹼基為一個基因)。
本發明的多肽，它們的片段或其它衍生物，或類似物，或表達它們的細胞可以用來作為抗原以產生抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發明還包括嵌合，單鏈和人源化抗體，還有Fab片段，或Fab表達文庫的產物。本領域所公知的各種各樣的方案都可以用來生產這樣的抗體和片段。
抗與本發明的序列相對應的多肽的抗體可以通過將此多肽直接注射動物或以此多肽給予動物(最好是非人類)的方法得到。這樣獲得的抗體即可與此多肽結合。以這種方式，甚至只編碼此多肽的一個片段的序列也可以用來產生結合整個天然多肽的抗體。這樣的抗體可以用來從表達多肽的組織中分離此多肽。
為了製備單克隆抗體，可以使用任何的通過連續細胞系培養提供抗體的技術。例子包括雜交瘤技術(Kohler and Milstein，1975，Nature，256497)，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor et al.，1983，Immunology Today，472)，和生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以採用描述單鏈抗體生產的技術(U.S.Patent 4,946,778)來生產本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。轉基因小鼠也可以用於表達本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。
本發明將以下面的實施例為參考進一步描述；但應理解本發明不限於這些實施例。除非有具體說明，所有的份和量均指重量。
為了理解下面實施例的方便，下面將描述某些常用的方法和/或術語。
「質粒」由置於前面的小寫字母p和/或其後的大寫字母和/或數字表示。本文的起始質粒或是可以買到的，或是無限制基礎上公用的，或是可以根據發表的方案從已有質粒構建。另外，與描述的那些質粒等效的質粒是本領域公知的，對一般熟練技術人員來說是清楚的。
DNA的「消化」是指用對DNA的特定序列起作用的限制酶對DNA的酶促剪切。本文用到的各種各樣的限制酶都是可以買到的，其反應條件，輔助因子和其它需要的條件對一般熟練技術人員來說是公知的。為了催化反應的完成，應在約20μl的緩衝液中含1μg質粒或DNA片段和約2個單位的酶。為了分離所需的DNA片段用於質粒構建，應在更大的反應體積中用20-250單位的酶將5-50μg DNA片段消化。特定限制酶所用的適當的緩衝液和底物由製造商詳細說明。一般酶切反應在37℃溫育約1小時，但也有可能依供應商的說明而有所改變。消化結束後，反應物直接在聚丙烯醯胺凝膠上電泳以分離所需片段。
酶切片段的大小分離用Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)描述的8％的聚丙烯醯胺凝膠完成。
「寡核苷酸」是指可以化學合成的單鏈脫氧多核苷酸或兩個互補的脫氧多核苷酸鏈。這樣合成的寡核苷酸沒有5』磷酸基團，如果不在激酶存在的情況下用ATP加上一個磷酸基團，將不能與另一個寡聚核苷酸連接。合成的寡聚核苷酸將連接到沒有去磷酸化的片段上。
「連接」是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非用別的連接酶，每0.5μg等摩爾數的待連接DNA片段加10單位的T4DNA連接酶(「連接酶」)，用已知的緩衝液和反應條件即可完成連接反應。
除非另有聲明，轉化是按Graham，F.and Van der Eb，A.，Virology，52456-457(1973)描述的方法進行。
實施例1人司登尼亞蛋白-α的細菌表達和純化編碼人司登尼亞蛋白-α(ATCC#75652)的DNA序列首先用與司登尼亞蛋白-α密碼序列的5』和3』端序列對應的PCR寡核苷酸引物擴增。5』寡核苷酸引物的序列為5』-GACTACATGTGTGCCGAGCGGCTGGG-3』，其中含有一個Afl III限制酶位點和開始於甲硫氨酸起始密碼子的20個核苷酸的司登尼亞蛋白-α的密碼序列；3』端引物序列3』-GACTAGATCTCTCCTGGGCTCTGGGAGGTG-5』含有Bgl II位點的互補序列，後接司登尼亞蛋白-α的20個核苷酸。pQE-60載體(Qiagen，Inc.9259 Eton Ave.，Chatsworth，CA91311)編碼抗生素抗性(Ampr)，一個細菌性複製起始點(ori)，一個IPTG可調節啟動子操縱子(P/O)，一個核糖體結合位點(RBS)，一個6-His標記和限制酶位點。pQE-60用Afl III和Bgl II消化。用Afl III和Bgl II消化後擴增序列連接到pQE-60中且插入帶編碼組氨酸標記和序列RBS的框架中。然後，用連接混合物轉化E.coli菌株M15/rep4，商標為M15/rep4的菌株可以從Qiagen公司得到，連接程序按照Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)的描述進行。M15/rep4含有質粒pREP4的多個拷貝，pREP4表達lacI阻遏物和帶有卡那黴素抗性(Kanr)。通過其在LB板上的生長能力來鑑定轉化體，選擇有氨苄青黴素/卡那黴素抗性的菌落。分離質粒DNA，並用限制酶分析予以確認。含有所需構建體的克隆在加有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中培養過夜(O/N)。過夜培養物以1∶100到1∶250的稀釋倍數用於大規模培養。細胞生長到光密度600(0.D.600)為0.4到0.6之間。然後，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。IPTG通過使lacI阻遏物失活，清除P/O，增加基因表達來誘導。細胞繼續生長3到4小時。然後離心(6000×g，20分鐘)收穫細胞。細胞沉澱物溶於6克分子的鹽酸胍離液試劑中。澄清後，在能夠使含6-His標記的蛋白與柱結合緊密的條件下，從此溶液中用鎳螯合柱層析純化溶解的司登尼亞鈣蛋白-α(Hochuli，E.et al.，GeneticEngineering，PrinciplesMethods，1287-98(1990)。從鹽酸胍(GnHCl)中復性蛋白可以通過幾種方法完成(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Structure-A Practical Approach，IRL Press，New York(1990)。首先，用透析步驟清除GnHCl，或者是，從鎳螯合柱上分離出來的純化蛋白可以結合到GnHCl以線性梯度下降的第二根層析柱上。當蛋白結合到層析柱上時蛋白質被復性，隨後用含250mM咪唑，150mM NaCl，25mMTris-Hcl pH7.5和10％甘油的緩衝液洗脫。最後，可溶性蛋白對含5mM碳酸氫銨的儲存緩衝液透析。純化的蛋白用SDS-PAGE分析(圖4)。
實施例2重組人司登尼亞鈣蛋白-α在COS細胞中的表達表達質粒stanniocalcin-αHA來源於一個含有1)SV40複製起始點，2)氨苄青黴素抗性基因，3)大腸桿菌複製起始點，4)CMV啟動子，後面跟隨著多接頭區，一個SV40內含子和聚腺苷酸位點的pcDNAI/Amp(Invitrogen)載體。將編碼整個司登尼亞鈣蛋白-α前體和框內融合到其3』末端的HA標記的DNA片段克隆到載體的多接頭區，因此，重組蛋白的表達是在CMV啟動子的指導下進行的。HA標記與以前描述的來源於流感血細胞凝集素蛋白的抗原決定簇相對應(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，ACherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell37，767)。用識別HA抗原決定簇的抗體，HA標記與目標蛋白的融合可以容易地檢測重組蛋白。
質粒構建策略描述如下用兩個引物通過PCR在克隆的原始表達序列標記(EST)上構建編碼司登尼亞鈣蛋白-α的DNA序列5』引物5』GACTAAGCTTATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 3』含有一個Hind III位點，後接從起始密碼子開始的司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列的21個核苷酸；3』序列5』GACTTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTCCTGGGCTCTGGGAGGTG3』含有Xba I位點，翻譯終止密碼子，HA標記和司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列的最後20個核苷酸(不包括終止密碼子)的互補序列。因此，PCR產物包含一個Hind III位點，司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列，其後的融合到框架中的HA標記，與HA標記相鄰的一個翻譯終止密碼子，和一個Xba I位點。用Hind III和Xba I限制酶消化PCR擴增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp並連接。連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株SURE(Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037有售)。轉化培養物塗於含氨苄青黴素的培養基平板上，挑選抗性菌落。從轉化體中分離質粒DNA，用限制分析檢測正確片段的存在。為了重組司登尼亞鈣蛋白-α的表達，用DEAE-DEXTRAN方法使表達載體轉染COS細胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。司登尼亞鈣蛋白-αHA蛋白的表達用放射標記和免疫沉澱的方法檢測(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉染後兩天，蛋白用35S-半胱氨酸標記8小時。然後收集培養基，用去汙劑緩衝液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5))裂解細胞(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))。細胞裂解物和培養基用HA特異性的單克隆抗體進行免疫沉澱。用15％的SDS-PAGE凝膠分析沉澱的蛋白。
實施例3用杆狀病毒表達系統克隆和表達人司登尼亞鈣蛋白-α編碼全長司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的DNA序列ATCC#75831用與基因的5』和3』序列相對應的PCR寡聚核苷酸引物擴增5』引物的序列為5』GACTGGATCCGCCACCATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 3』並包含一個BamH I限制酶位點(粗體)，和隨後的正好在司登尼亞鈣蛋白-α的前21個核苷酸(翻譯起始密碼子「ATG」有下劃線)之後的代表一個有效的在真核細胞中起始翻譯的信號的6個核苷酸(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))。
3』引物的序列為5』GACTGGTACCCTACTCCTGGGCTCTGGGAGG 3』並包含Asp718限制性內切酶位點和21個與司登尼亞鈣蛋白-α基因的3』序列互補的核苷酸。用一個商品試劑盒(「Geneclean，」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離擴增的序列。然後，片段用BamH I和Asp 718消化並在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段命名為F2。
用杆狀病毒表達系統(綜述參見M.D.and Smith，G.E.1987，杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養程序方法手冊Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555)使用載體pRG1(pVL941載體的修飾物，見下述)表達司登尼亞鈣蛋白-α蛋白。此表達載體包含首蓿夜紋銀蛾核多角體病毒(AcMNPV)的多角體蛋白強啟動子，和接下來的限制性內切酶BamH I和Asp 718的識別位點。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用於有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，以與多角體蛋白啟動子相同的方向插入大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶基因，接下來是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。在多角體蛋白序列的兩側是用於共轉染的野生型病毒DNA的細胞介導的異源重組的病毒序列。可以使用諸如pAc373，pVL941和pAcIM1的很多其它載體代替pRG1(Luckow，V.A.and Summers，M.D.，Virology，17031-39)。
質粒用限制酶BamH I和Asp 718消化，然後通過本領域公知的程序用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然後，用一個商品試劑盒(「Geneclean，」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離DNA。此載體DNA命名為V2。
用T4 DNA聚合酶連接片段F2和去磷酸化質粒V2。然後轉化大腸桿菌HB101細胞，用限制酶BamHI和Asp718鑑定含有攜帶司登尼亞鈣蛋白-α基因的質粒(pBac-stanniocalcin-alpha)的細菌。通過DNA序列測定確認克隆片段的序列。
5μg的質粒pBac-stanniocalcin-alpha與1.0μg的商購線性杆狀病毒(「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)用脂轉染法(Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847412-7417(1987))共轉染。
在含有50μl無血清Grace’s培養基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的無菌微量滴定板的一個孔內混合1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質粒pBac-stanniocalcin-alpha。然後加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培養基，混合併在室溫溫育15分鐘。然後將轉染混合物逐滴加入植於一個含1ml無血清Grace’s培養基的35mm的組織培養板中的Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL1711)，將培養板前後振蕩以混合新加入的溶液。然後將培養板在27℃溫育5小時。5小時後從培養板中除去轉染溶液並加入1ml補加10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。將培養板放回培養箱中繼續在27℃培養4天。
4天後收集上清並按Summers and Smith(見上述)描述的相似的方法進行噬斑分析。作為一個修飾方法，使用可以容易地分離藍色噬斑的帶」Blue Gal」(Life TechnologiesInc.，Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠。(在Life Technologies Inc.，Gaithersburg分發的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學用戶指南的第9-10頁也可以找到「噬斑分析」的詳細描述)。
系列稀釋後4天，將病毒加入細胞，用Eppendorf移液頭挑取藍色噬斑。然後將含有重組病毒的瓊脂重新懸浮在含有200μl Grace’s培養基的Eppendorf管中。短暫離心除去瓊脂，含有重組病毒的上清用於感染植於35mm培養皿的Sf9細胞。4天後收穫這些培養皿的上清並於4℃貯藏。
Sf9細胞生長在補加10％熱失活的FBS的Grace’s培養基中。以感染複數(MOI)2用重組杆狀病毒V-stanniocalcin-alpha感染細胞。6小時後除去培養基並用SF900 II無甲硫氨酸和半胱氨酸培養基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)代替。42小時後，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。在離心收穫前繼續將細胞培養16小時，通過SDS-PAGE和放射自顯影可以看到標記的蛋白(圖5)。在圖5中凝膠指示司登尼亞鈣蛋白-α以同型二聚體的形式存在。
經上述教導，本發明的大量改進和變動是有可能的，因此，在所附的權利要求的範圍內，除了特別描述的以外本發明可以以其它方式實施。
序列表(1) 一般信息(i) 申請者OLSEN，等(ii) 發明題目人司登尼亞鈣蛋白-α(iii)序列數8(iv) 通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州 NEW JERSEY(E)國家USA(F)郵政編碼07068(V) 計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸軟盤(B)計算機IBM PS/2(C)作業系統MS-DOS(D)軟體WORD PERFECT 5.1(vi) 本申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(vii) 在先申請數據(A)申請號(B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36,134(C)文檔號/案號325800-200(ix) 通訊信息
(A)電話201-994-1700(B)電傳201-994-1744(2) SEQ ID NO1信息(i) 序列特點(A)長度892鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO1GAATTCGGCA CGAGAGGAGG AGGAGGAAGA GGGGAGCACA AAGGATCCAG GTCTCCCGAC60GGGAGGTTAA TACCAAGAAC CATGTGTGCC GAGCGGCTGG GCCAGTTCAT GACCCTGGCT 120TTGGTGTTGG CCACCTTTGA CCCGGCGCGG GGGACCGACG CCACCAACCC ACCCGAGGGT 180CCCCAAGACA GGAGCTCCCA GCAGAAAGGC CGCCTGTCCC TGCAGAATAC AGCGGAGATC 240CAGCACTGTT TGGTCAACGC TGGCGATGTG GGGTGTGGCG TGTTTGAATG TTTCGAGAAC 300AACTCTTGTG AGATTCGGGG CTTACATGGG ATTTGCATGA CTTTTCTGCA CAACGCTGGA 360AAATTTGATG CCCAGGGCAA GTCATTCATC AAAGACGCCT TGAAATGTAA GGCCCACGCT 420CTGCGGCACA GGTTCGGCTG CATAAGCCGG AAGTGCCCGG CCATCAGGGA AATGGTGTCC 480CAGTTGGAGC GGGAATGCTA CCTCAAGCAC GACCTGTGCG CGGCTGCCCA GGAGAACACC 540CGGGTGATAG TGGAGATGAT CCATTTCAAG GACTTGCTGC TGCACGAACC CTACGTGGAC 600CTCGTGAACT TGCTGCTGAC CTGTGGGGAG GAGGTGAAGG AGGCCATCAC CCACAGCGTG 660CAGGTTCAGT GTGAGCAGAA CTGGGGAAGC CTGTGCTCCA TCTTGAGCTT CTGCACCTCG 720GACATCCAGA AGCCTCCCAC GGCGCCCCCC GAGCGCCAGC CCCAGGTGGA CAGAACCAAG 780CTCTCCAGGG CCCACCACGG GGGAAGAAGG ACATCACCTC CCAGAGCCCA GGAGTAGGGA 840GACTGGCCGA GGTGCCAAGG GTGAGCGAGG TAGCAAGAGC CACCCAAACG CC 892(2) SEQ ID NO2信息(i) 序列特點(A)長度251個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii) 分子類型蛋白質(xi) 序列描述 SEQ ID NO2Met Cys Ala Glu Arg Leu Gly Gln Phe Met Thr Leu Ala Leu Val-40 -35 -30Leu Ala Thr Phe Asp Pro Ala Arg Gly Thr Asp Ala Thr Asn Pro-25 -20 -15Pro Glu Gly Pro Gln Asp Arg Ser Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu-10 -5 1 5Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile Gln His Cys Leu Val Asn Ala10 15 20Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu Cys Phe Glu Asn Asn Ser25 30 35Cys Glu Ile Arg Gly Leu His Gly Ile Cys Met Thr Phe Leu His40 45 50Asn Ala Gly Lys Phe Asp Ala Gln Gly Lys Ser Phe Ile Lys Asp55 60 65Ala Leu Lys Cys Lys Ala His Ala Leu Arg His Arg Phe Gly Cys70 75 80Ile Ser Arg Lys Cys Pro Ala Ile Arg Glu Met Val Ser Gln Leu85 90 95Gln Arg Gly Cys Thr Leu Lys His Asp Ley Cys Ala Ala Ala Gln100 105 110Glu Asn Thr Arg Val Ile Val Glu Met Ile His Phe Lys Asp Leu115 120 125Leu Leu His Gly Pro Tyr Val Asp Leu Val Asn Leu Leu Leu Thr130 135 140Cys Gly Glu Glu Val Lys Glu Ala Ile Thr His Ser Val Gln Val145 150 155Gln Cys Glu Gln Asn Trp Gly Ser Leu Cys Ser Ile Leu Ser Phe160 165 170Cys Thr Ser Asp Ile Gln Lys Pro Pro Thr Ala Pro Pro Glu Arg175 180 185Gln Pro Gln Val Asp Arg Thr Lys Leu Ser Arg Ala His His Gly190 195 200Gly Arg Arg Thr Ser Pro Pro Arg Ala Gln Glu205 210(2) SEQ ID NO3信息(i) 序列特點(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO3GACTACATGTGTGCCGAGCGGCTGGG26(2) SEQ ID NO4信息(i) 序列特點(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO4GACTAGATCTCTCCTGGGCTCTGGGAGGTG30(2) SEQ ID NO5信息(i) 序列特點(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO5GACTAAGCTTATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 31(2) SEQ ID NO6信息(i) 序列特點(A)長度60鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO6GACTTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTCCTGGGCTCTGGGAGGT 60(2) SEQ ID NO7信息(i) 序列特點(A)長度37鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO7GACTGGATCCGCCACCATGTGTGCCGAGCCGGCTGGGC 37(2) SEQ ID NO8信息(i) 序列特點(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO8GACTGGTACCCTACTCCTGGGCTCTGGGAGG 3權利要求
1.一種分離的多核苷酸，所說的多核苷酸選自於下述一組(a)編碼具有圖1的推導的胺基酸序列的多肽或所說多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由包含在ATCC保藏號75831中的cDNA編碼的胺基酸序列的多肽或所說多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為DNA。
3.權利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為RNA。
4.權利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為基因組DNA。
5.權利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼具有圖1的推導的胺基酸序列的多肽。
6.權利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由ATCC保藏號75831的cDNA編碼的多肽。
7.權利要求1的多核苷酸，其具有圖1所示多肽的密碼序列。
8.一種包含權利要求2的DNA的載體。
9.一種用權利要求8的載體遺傳工程化的宿主細胞。
10.一種生產多肽的方法，包括從權利要求9的宿主細胞表達由所說DNA編碼的多肽。
11.一種生產能夠表達多肽的細胞的方法，包括用權利要求8的載體遺傳工程化細胞。
12.與權利要求2的DNA可雜交並編碼具有司登尼亞鈣蛋白-α活性的多肽的分離的DNA。
13.一種多肽，選自下列一組(i)具有圖1的推導的胺基酸序列的多肽及其片段，類似物和衍生物和(ii)由ATCC保藏號75831的cDNA編碼的多肽和所說多肽的片段，類似物和衍生物。
14.權利要求13的多肽，其中的多肽具有圖1的推導的胺基酸序列。
15.抗權利要求13的多肽的抗體。
16.抗權利要求13的多肽的拮抗劑。
17.權利要求13的多肽的刺激劑。
18.治療需要使用人司登尼亞鈣蛋白-α的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求13的多肽。
19.治療需要抑制人司登尼亞鈣蛋白-α的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求16的拮抗劑。
20.權利要求18的方法，其中所說的治療有效量的多肽以提供給患者編碼所述多肽的DNA並在體內表達所說多肽的方式給藥。
21.一種鑑定刺激劑和拮抗劑的方法，包括製備在其細胞表面表達司登尼亞鈣蛋白-α受體的哺乳動物細胞；在任選地存在司登尼亞鈣蛋白-α的條件下組合哺乳動物細胞，標記的鈣和待篩選的化合物；和測定化合物是否刺激或抑制鈣吸收。
22.診斷與人司登尼亞鈣蛋白-α多肽的低水平表達有關的疾病或疾病易感性的方法，包括從來源於宿主的樣品中分離編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的核酸序列；和測定人司登尼亞鈣蛋白-α核酸序列中的突變。
全文摘要
本發明披露了人司登尼亞鈣蛋白-α和編碼此多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術生產此多肽的程序。本發明還披露了此多肽用於治療導致腎，骨和心臟疾病的電解質紊亂、骨質疏鬆症和Paget氏病的方法。還披露了抗此多肽的拮抗劑及其對治療血鈣過少和骨質疏鬆症的用途。還公開了將司登尼亞鈣蛋白-α序列用作檢測與司登尼亞鈣蛋白-α的突變體形式相關的疾病或疾病易感性的診斷劑的用途。
文檔編號C07K14/585GK1167490SQ9419521
公開日1997年12月10日 申請日期1994年11月10日 優先權日1994年11月10日
發明者亨裡克·奧森, 羅伯特·D·弗雷施曼 申請人:人體基因組科學有限公司