基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的製作方法

2023-05-08 07:52:26 1

基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，包含微流控晶片、至少一種能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠以及至少一種針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體，其中，所述的微流控晶片包括玻璃晶片基底，所述的玻璃晶片基底上設有微流控通道，微流控通道內設有軟磁性微陣列。本發明可實現一次樣品進樣即可捕獲檢測多種不同類別的稀有循環腫瘤幹細胞，具有較高的靈敏度和特異性，操作方便快速，捕獲細胞易於收集，無需晶片內部微流通道複雜的一抗二抗表面修飾過程等特點。
【專利說明】基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(簡稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在中國每年新診斷的肝癌約佔全世界55 %，其死亡率在我國惡性腫瘤中列第二位。雖然手術切除是目前肝癌治療的首選方式，但即便是根治性切除5年內仍有60-70%的病人出現轉移復發。肝癌術後轉移和復發是病人術後的主要死亡原因，它已成為進一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。因此，探索肝癌轉移、復發的機制，尋找更有效的轉移早期預警及療效評估手段，以便進行早期合理幹預，已成為進一步提高肝癌生存率的關鍵。
[0003]近來研究提示循環腫瘤細胞在腫瘤轉移和復發中扮演關鍵角色。但是每天有數以千計的腫瘤細胞脫離原發瘤進入循環血中，但並不是每個循環腫瘤細胞都能成為轉移復發的「種子」。這除有環境(土壤)因素外，「種子」本身特性也決定著其能否在新環境中成功「定植」。我們在前期研究中發現具有幹細胞特性的循環腫瘤細胞的數量與肝癌切除術後早期肝內復發和肺轉移密切相關，相對於較成熟的循環腫瘤細胞而言，那些循環腫瘤幹細胞具有很強的成瘤、抗凋亡能力。因此精確地捕獲分類這些導致癌症轉移、復發的「種子」細胞具有重大的臨床和科研意義。然而這群細胞在外周血中極其稀有，平均IO7個白細胞中只有一個循環腫瘤幹細胞。目前已有的循環腫瘤細胞捕獲技術如梯度密度離心技術、濾膜技術和流式細胞技術在實現循環腫瘤幹細胞的捕獲分類方面均存在一定的缺陷。梯度密度離心和濾膜技術通過循環腫瘤細胞與血細胞之間物理特性的差異(密度、大小)實現細胞的捕獲，由於這兩種基於物理特性實現捕獲的技術其靈敏度和特異性較低，無法對捕獲細胞進行分類，細胞易丟失，限制了其在循環腫瘤細胞捕獲中的應用。流式細胞術通過對待測樣品進行特定的螢光標記，然後利用複雜的光學檢測系統進行鑑定分選，該技術雖可實現不同類別腫瘤細胞的分類收集，但是設備本身成本昂貴、檢測效率低、需專人操作，同時檢測稀有細胞靈敏度差，無法對細胞形態學進行觀察，也很難廣泛應用於循環腫瘤幹細胞的捕獲。因此亟需開發一種廉價、操作簡單，一次性使用的，具有高靈敏度、特異性和多標誌物檢測的循環腫瘤幹細胞方法。
[0004]微流控晶片技術具有檢測高效、集成化、試劑消耗量小等諸多優點正被越來越多地應用於生物醫學領域，並已發展出多種微流控細胞捕獲技術。然而目前大多數已報導的細胞捕獲晶片仍停留在單標誌物、單種細胞的捕獲，對於多標誌物、多類別細胞捕獲仍然缺乏相應的手段。它們中的代表是Nagrath S等2007年於Nature上報導的一種單標誌物循環腫瘤細胞捕獲晶片，該晶片在流道內設置圓形的微柱陣列，經過化學修飾，在流道內壁及微柱表面結合上皮細胞黏附因子抗體，通過細胞流動中與微柱的碰撞來捕獲靶細胞。這種方法捕獲細胞的成功與否完全取決於靶細胞是否碰撞微柱，因此其捕獲效率較低。該類晶片無法一次進樣實現多標誌物循環腫瘤幹細胞捕獲的功能。此外這種晶片的應用還受制於捕獲的細胞很難釋放收集和前期晶片化學修飾過程複雜等缺點。為了實現多標誌物癌細胞捕獲的目的，Xu Y等2009年在Anal Chem上提出蛇形管道劃定不同捕獲區域，在每個捕獲區域的上下遊設置進出樣開孔，利用開孔的交替開放與封閉在不同區域固定上各自不同的核酸適體，以此來達到在同一管道中並行捕獲不同癌細胞的目的。該方法雖然可以實現多標誌物細胞的捕獲，但多次重複的流道固定使晶片製備過程時間長、步驟多，又由於在同一管道內進行流動固定，容易產生上下遊的交叉汙染，使假陽性增高，而為了控制假陽性率，必須加長各區域的長度，這對晶片的進一步集成造成了障礙。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，無需對其晶片的內部進行繁複的化學修飾，具備一次樣品進樣就能對完成包括單、多標誌物循環腫瘤幹細胞的捕獲、鑑定和回收等功能，同時還具有操作簡便、集成度高的特點。
[0006]為了達到上述目的，本發明提供了一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，包含微流控晶片、至少一種能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠以及至少一種針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體，其中，所述的微流控晶片包括玻璃晶片基底，所述的玻璃晶片基底上設有微流控通道，微流控通道內設有軟磁性微陣列。
[0007]優選地，所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱構成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱交錯排列。
[0008]更優選地，所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱的距離為100 μ m,鎳鐵合金圓柱的直徑為30 μ m，每列中相鄰兩個鎳鐵合金圓柱之間的距離為50 μ m。
[0009]優選地，所述的腫瘤幹細胞生物標誌物包括EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24、⑶13、ICAM-1、SALL4、CD44 和 ALDH 的至少一種。
[0010]本發明還提供了上述基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的第一種使用方法，其特徵在於，具體步驟包括:
[0011]步驟1:裂解外周血紅細胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細胞懸液；
[0012]步驟2:將能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠摻入外周血有核細胞懸液，孵育，得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液；
[0013]步驟3:在微流控晶片底部施加外磁場，將標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液泵入微流控晶片的微流控通道中；
[0014]步驟4:將相應的針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體泵入微流控晶片的微流控通道(2)中，孵育，顯微鏡鑑定循環腫瘤幹細胞；
[0015]步驟5:撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
[0016]本發明還提供了上述基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的另一種使用方法，其特徵在於，具體步驟包括:
[0017]步驟A:裂解外周血紅細胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細胞懸液；
[0018]步驟B:將針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體摻入外周血有核細胞懸液，孵育，得到含有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液；
[0019]步驟C:將相應的能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠摻入有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液，孵育，得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液；
[0020]步驟D:在微流控晶片底部施加外磁場，將標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液泵入微流控晶片的微流控通道中，顯微鏡鑑定循環腫瘤幹細胞；
[0021]步驟E:撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
[0022]圖2中的上面一行顯示了基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的第一種使用方法的流程，其餘部分顯示了基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的第二種使用方法的流程。
[0023]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0024]本發明利用標記有循環腫瘤幹細胞標誌物的免疫磁珠摻入外周血與循環腫瘤幹細胞特異性結合，通過微流控晶片內軟磁性微陣列捕獲循環腫瘤幹細胞，實現外周血稀有循環腫瘤幹細胞的多標誌物分類檢測，撤除外加磁場後去磁化，使吸附的循環腫瘤幹細胞脫落以便於收集。本發明結合了免疫磁珠對細胞高效率結合以及微流控晶片高通量動態捕獲的這兩大優點，可實現一次樣品進樣即可捕獲檢測多種不同類別的稀有循環腫瘤幹細胞，具有較高的靈敏度和特異性，操作方便快速，捕獲細胞易於收集，無需晶片內部微流通道複雜的一抗二抗表面修飾過程等特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為微流控晶片結構示意圖；
[0026]圖2為基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒使用流程圖；
[0027]圖3為對EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24陽性的循環肝癌幹細胞檢測結果圖。右上，紅色螢光標記EpCAM+循環肝癌幹細胞，藍色螢光標記細胞核；左上，紅色螢光標記⑶133+循環肝癌幹細胞，綠色螢光標記CD45+白細胞，藍色螢光標記細胞核；右下，綠色螢光標記CD90+循環肝癌幹細胞，紅色螢光標記⑶45+白細胞，藍色螢光標記細胞核；左下，紅色螢光標記⑶24+循環肝癌幹細胞，綠色螢光標記⑶45+白細胞，藍色螢光標記細胞核。
[0028]圖4為同時使用商售CellSearch?系統和本專利方案中基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒對33例原發性肝癌患者外周血EpCAM+循環腫瘤幹細胞檢測對比結果。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例來具體說明本發明。
[0030]實施例1
[0031]1、一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，由以下組分組成:
[0032](I)微流控晶片，如圖1所示，為微流控晶片結構示意圖，所述的微流控晶片微流控晶片包括玻璃晶片基底1，所述的玻璃晶片基底I上設有長度a為50mm，寬度b為17mm的微流控通道2，微流控通道2內設有軟磁性微陣列。所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱3構成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱3交錯排列。所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱3的距離c為100 μ m，鎳鐵合金圓柱3的直徑d為30 μ m，每列中相鄰兩個鎳鐵合金圓柱3之間的距離e為50 μ m。後一列鎳鐵合金圓柱3水平中軸線到前一列鎳鐵合金圓柱3邊緣的最短垂直距離f為25 μ m。[0033](2)能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠，包括:抗 EpCAM 的免疫磁珠(Catalog n0.130-061-101.Miltenyi Biotec,Germany)、抗 CD133 的免疫磁珠(Catalog n0.130-050-801.Milteny Biotec)、抗 CD90 的免疫磁珠(Catalog n0.130-096-253, Milteny Biotec)和抗 CD24 的免疫磁珠(Catalogn0.130-095-951, Milteny Biotec)
[0034](3)針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體，包括:抗EpCAM-PE的螢光抗體(Catalog n0.130-091-253, Milteny Biotec),抗 CD133-PE 的突光抗體(Catalogn0.130-080-801,Milteny Biotec)，抗 CD90-FITC 的螢光抗體(Catalog n0.130-095-953，Milteny Biotec),抗 CD24-PE 的突光抗體(Catalog n0.130-095403, Milteny Biotec),白細胞標誌物的螢光抗體 CD45-FITC (Catalog n0.555482，BD bioscience)和CD45-PE(Catalog n0.561866, BD bioscience)；
[0035]2、製備微流控晶片:
[0036](I)在玻璃基片上濺射Ti/Cu種子層，然後通過正膠光刻得到依據軟體模擬設計的軟磁性微陣列的陽模，接著進行電鑄，獲得如圖1所示的由鎳鐵合金圓柱3構成的軟磁性微陣列，鎳鐵合金圓柱3的材料由(鎳和鐵按照80: 20的質量百分比組成)組成。
[0037](2)通過化學腐蝕的方法去除Cu/Ti種子層，獲得透明的玻璃晶片；接著劃片，獲得單個玻璃晶片基底I ;
[0038](3)通過矽片基底上的SU8膠光刻，獲得所需要的微流控通道的陰模，然後通過PDMS快速成型，製備微流控通道2 ；
[0039](4)最後採用常規方法將微流控通道2與玻璃晶片基底I進行加壓鍵合，製成微流控晶片。
[0040]3、使用基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，對肝癌患者外周血中四種不同標誌物陽性(包括EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+)的循環肝癌幹細胞進行捕獲，具體步驟為:
[0041]步驟A:採集肝癌患者8ml外周靜脈血，等分成4份，每份2ml，分別與其9X體積的紅細胞裂解液(Red blood cell lysis solutionlOX, Catalog n0.130094183,Miltenyi Biotec)室溫混勻2分鐘，加入等體積PBS緩衝液(PBS1X, pH = 7.4, Catalogn0.21-040-CVR, Corning,)終止裂紅反應，室溫以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，300 μ I PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，獲得外周血全部有核細胞(包括腫瘤細胞、白細胞、內皮細胞等)。最終獲得4份300 μ I外周血有核細胞懸液。
[0042]步驟B:將抗EpCAM-PE的螢光抗體(同上)以比例1: 100、白細胞標誌物⑶45-FITC(同上)的螢光抗體以比例1: 200與第一份300 μ I外周血有核細胞懸液混合，將抗⑶133-ΡΕ的螢光抗體以比例1: 100、白細胞標誌物⑶45-FITC(同上)的螢光抗體以比例1: 200與第二份300 μ I外周血有核細胞懸液混合，將抗⑶90-FITC的螢光抗體以比例1: 100、白細胞標誌物⑶45-ΡΕ(同上)的螢光抗體以比例1: 200與第三份300 μ I外周血有核細胞懸液混合，將抗⑶24-ΡΕ的螢光抗體以比例1: 100、白細胞標誌物⑶45-FITC(同上)的螢光抗體以比例1: 200與第四份300 μ I外周血有核細胞懸液混合，室溫孵育I小時，室溫以350g離心力離心5分鐘，去除上清，分別加入300 μ I PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，得到4份300 μ I含有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液；
[0043]步驟C:取4種抗EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24免疫磁珠各100 μ I與步驟B獲得的4份300 μ I含有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液分別充分混勻(針對肝癌幹細胞標誌物的免疫磁珠在檢測中與本次檢測中使用的腫瘤幹細胞標誌物螢光抗體相對應)，4°c孵育30分鐘，加入1mlPBS緩衝液(pH = 7.4)，以350g的離心力4°C離心5分鐘,去除上清,加入1ml PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸,得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液；
[0044]步驟D:取4塊微流控晶片，在微流控晶片底部分別施加外磁場(汝鐵硼永磁鐵)，步驟C獲得的4份Iml標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液以2ml/hr的速度勻速分別泵入微流控晶片的微流控通道2中。螢光顯微鏡下觀察捕獲的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環肝癌幹細胞。(如圖3所示)
[0045]步驟E:撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
[0046]在本實施例中檢測了 33名原發性肝癌患者外周血的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環肝癌幹細胞。同時還從這33名患者外周靜脈採集了另一份7.5ml外周血，並使用目前商售的循環腫瘤細胞檢測系統(CellSearch?, Johnson & Johnson, USA)對這33份外周血進行EpCAM+循環腫瘤幹細胞檢測。實驗結果顯示:使用本發明方案中的微流控晶片檢測EpCAM+循環腫瘤幹細胞檢出率為75.76%，而CellSearch?系統的檢出率為54.54%。(如圖4所示)。此外CellSearch?系統僅能檢測一種標誌物的循環腫瘤幹細胞。因此本發明方案的微流控晶片循環腫瘤幹細胞檢出效率顯著高於目前商售系統，並且可以實現多種標誌物循環腫瘤幹細胞檢測。
[0047]實施例2
[0048]1、一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，組成與實施例1相同:
[0049]2、微流控晶片製備同 實施例1.[0050]3、製備摻入!fep3B細胞株的血液樣本，模擬含有循環腫瘤幹細胞的血樣:
[0051](l)Hep3B細胞株(購自中科院上海生命科學園，肝細胞肝癌腫瘤細胞，表達 EpCAM、CD133、CD90 和 CD24 的！fep3B 細胞陽性率分別為 99.8 % 分、98 %,0.2 %和1%，本實施例中以Hep3B細胞作為摻入法的循環腫瘤細胞細胞)。取4X107的H印3B細胞，按每份IXlO7細胞分別與如下螢光抗體以1: 100混合⑶24-PE(Catalogn0.130-095-403, Milteny Biotec), CD90-FITC(Catalog n0.130-095-953, MiltenyBiotec), EpCAM-PE(Catalog n0.130-091-253, Milteny Biotec), CD133-PE (Catalogn0.130-080-801, Milteny Biotec)，4°C 孵育 15min，使用流式細胞儀(BD FACSAria, BDBiosciences)分別分選 EpCAM+、CD133+、CD90+ 和 CD24+ 的!fep3B 細胞各 1000 個，分別用 ImlPBS(PBS1X,Catalog n0.21-040-CVR,Corning)重懸。取4支Eppendorf 管，每個管中放入上述四種!fep3B細胞懸液各100 μ I (每個管內含有100個!fep3B細胞)，另取4支Eppendorf管，每個管中放入上述四種!fep3B細胞懸液各10 μ I (每個管內含有10個!fep3B細胞)。
[0052]將上述製備好的四種Hep3B細胞懸液分別摻入Iml健康人外周血，分別得到100個EpCAM+H印3B/Iml外周血樣本、100個CD133+Hep3B/lml外周血樣本、100個CD90+!fep3B/lml 外周血樣本和 100 個 CD24+!fep3B/lml 外周血樣本。10 個 EpCAM+H印3B/Iml外周血樣本、10個CD133+!fep3B/lml外周血樣本、10個CD90+!fep3B/lml外周血樣本和10個CD24+!fep3B/lml外周血樣本
[0053]4、使用基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，對血樣中四種不同標誌物陽性(包括EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+)的循環肝癌幹細胞進行捕獲，具體步驟為:
[0054]步驟(1):將上述製備好的血液樣本，分別與其9X體積的紅細胞裂解液(Redblood cell lysis solutionlOX, Catalog n0.130094183, Miltenyi Biotec)室溫混勻 2分鐘，加入等體積 PBS 緩衝液(PBS1X，pH = 7.4Catalog n0.21-040-CVR, Corning)終止裂紅反應，室溫以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，300 μ IPBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，獲得外周血全部有核細胞(包括腫瘤細胞、白細胞、內皮細胞等)。最終獲得8份300 μ I外周血有核細胞懸液。
[0055]步驟(2):取抗EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24免疫磁珠各100 μ I與步驟B獲得的8份300 μ I外周血有核細胞懸液分別充分混勻(針對肝癌幹細胞標誌物的免疫磁珠在檢測中單獨使用並與本次檢測中使用的腫瘤幹細胞標誌物螢光抗體相對應)，4°C孵育30分鐘，加入Iml PBS緩衝液(ρΗ7.4)，以350g的離心力4°C離心5分鐘，去除上清，加入1ml PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸,得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液。
[0056]步驟(3):取8塊微流控晶片，在微流控晶片底部分別施加外磁場(汝鐵硼永磁鐵)，將8份Iml標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液以2ml/hr的速度勻速分別泵入微流控晶片的微流控通道2中。螢光顯微鏡下觀察捕獲的EpCAM+、⑶133+、⑶90+、⑶24+循環肝癌幹細胞。
[0057]步驟⑷:將抗EpCAM-PE的螢光抗體以1: 100的比例和白細胞標誌物⑶45-PE的螢光抗體以I: 200的比例一起加入第一份600 μ I PBS緩衝液(ρΗ7.4)，將抗CD133-PE的螢光抗體以1: 100的比例和白細胞標誌物⑶45-ΡΕ的螢光抗體以1: 200的比例一起加入第二份600 μ I PBS緩衝液`(ρΗ7.4)，將抗CD90-FITC的螢光抗體以I: 100的比例和白細胞標誌物⑶45-ΡΕ的螢光抗體以1: 200的比例一起加入第三份600 μ I PBS緩衝液(ρΗ7.4)，將抗⑶24-ΡΕ的螢光抗體以1: 100的比例和白細胞標誌物⑶45-ΡΕ的螢光抗體以1: 200的比例一起加入第四份600 μ I PBS緩衝液(pH = 7.4)，室溫避光的環境下，以lml/hr的速度分別泵入含有相應的免疫磁珠的微流控晶片的微流控通道2中，直至600 μ I全部泵入(需36分鐘)，整個操作過程保持底部外加磁場存在，顯微鏡鑑定循環腫瘤幹細胞。
[0058]步驟(5):撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
[0059]本試劑盒捕獲的EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的H印3Β細胞數量分別為:摻入100個/ml細胞，每種標誌物細胞的捕獲效率高達99 %、98 %、98 %和99 %，摻入10個/ml細胞，每種標誌物細胞的捕獲效率高達100 %、80 %、90 %和90 %，。使用目前商售的MACS細胞富集系統(QuadroMACS? Separator and Starting Kits, Miltenyi Biotec, Germany),按照產品說明書對相同的血樣進行處理，摻入100個/ml細胞，每種標誌物標誌物Hep3B細胞的捕獲率分別僅為32%、25%、30%、36%。摻入10個/ml細胞，四種標誌物標誌物H印3B細胞回收效率為零。實驗結果顯示，本發明方案中微流控晶片對外周血不同標誌物循環腫瘤細胞的分類捕獲效率，尤其是外周血中極微量細胞(< 10個/ml)捕獲效率明顯高於目前商售系統。
【權利要求】
1.一種基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，包含微流控晶片、至少一種能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠以及至少一種針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體，其中，所述的微流控晶片包括玻璃晶片基底(I)，所述的玻璃晶片基底(I)上設有微流控通道(2)，微流控通道(2)內設有軟磁性微陣列。
2.如權利要求1所述的基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述的軟磁性微陣列由鎳鐵合金圓柱(3)構成，相鄰兩列鎳鐵合金圓柱(3)交錯排列。
3.如權利要求2所述的基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述的相鄰兩列鎳鐵合金圓柱(3)的距離(a)為100 μ m，鎳鐵合金圓柱(3)的直徑(b)為30 μ m，每列中相鄰兩個鎳鐵合金圓柱(3)之間的距離(c)為50μπι。
4.如權利要求1所述的基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述的腫瘤幹細胞生物標誌物包括EpCAM、⑶133、⑶90、⑶24、⑶13、ICAM-1、SALL4、⑶44和ALDH的至少一種。
5.權利要求1-4中任一項所述的基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的使用方法，其特徵在於，具體步驟包括: 步驟1:裂解外周血紅細胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細胞懸液； 步驟2:將能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠摻入外周血有核細胞懸液，孵育，得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液； 步驟3:在微流控晶片底部施加外磁場，將標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液泵入微流控晶片的微流控通道(2)中； 步驟4:將相應的針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體泵入微流控晶片的微流控通道(2)中，孵育，顯微鏡鑑定循環腫瘤幹細胞； 步驟5:撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
6.權利要求1-4中任一項所述的基於磁珠和微流控晶片的循環腫瘤幹細胞檢測試劑盒的使用方法，其特徵在於，具體步驟包括: 步驟A:裂解外周血紅細胞，離心，去除上清，重懸獲得外周血有核細胞懸液； 步驟B:將針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體摻入外周血有核細胞懸液，孵育，得到含有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液； 步驟C:將相應的能夠與循環腫瘤幹細胞特異性結合的標記有腫瘤幹細胞生物標誌物的免疫磁珠摻入有針對腫瘤幹細胞生物標誌物的螢光抗體的外周血有核細胞懸液，孵育，得到標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液； 步驟D:在微流控晶片底部施加外磁場，將標記有免疫磁珠的外周血有核細胞懸液泵入微流控晶片的微流控通道(2)中，顯微鏡鑑定循環腫瘤幹細胞； 步驟E:撤除微流控外磁場，回收循環腫瘤幹細胞以進行下遊分子生物學實驗。
【文檔編號】G01N33/533GK103869060SQ201410081509
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】樊嘉, 楊欣榮, 孫雲帆, 徐泱, 周儉 申請人:復旦大學附屬中山醫院