一種疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法

2023-05-08 02:55:31

專利名稱：一種疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法
技術領域：
本發明屬於生物分離技術領域，具體涉及一種疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法。
背景技術：
胞二磷膽鹼(⑶P-choline) (I)為核苷衍生物，是磷脂醯膽鹼的前體物質，可增加 中樞神經系統的去甲腎上腺素和多巴胺水平。臨床上廣泛用於治療各種腦血管疾病，老年 性痴呆症、抑鬱症，還對帕金森氏綜合症、神經性耳聾和耳鳴，遲發性運動障礙、小腦與脊髓 小腦共濟失調有一定療效。 在⑶P-choline的全細胞催化轉化液中，存在某些理化特性相似的化合物和中 間代謝產物如胞苷一磷酸、胞苷二磷酸和胞苷三磷酸等，以及沒有被轉化完的底物如無機 磷酸鹽和葡萄糖等，另外還有細胞自溶產生的雜質如蛋白和核酸等化合物，分離難度極 大。關於⑶P-choline的分離純化，國內外報導的較少，傳統的分離工藝普遍存在著工藝 冗長、產量收率低，分離成本高的缺點，並且離子交換過程採用乙醇-水的洗脫方式，有易 燃、易爆特性，給生產帶來安全隱患。藤原好孝等(日本特公昭62-16497)對化學法合成 的⑶P-choline溶液，使用強酸性離子交換樹脂RHPK-25. 4 60 (H型)柱和弱鹼性離子 交換樹脂RWA-30 (0H型)柱兩道工序分離純化，經過液相色譜檢測⑶P-choline純度可達 98%，收率未報導。張劍等(CN101130797A)提出將轉化液上碳柱，用純水衝洗碳柱，再用乙 醇鹼溶液將CDP-choline洗脫下來，並收集；再將洗脫液汽化濃縮，將濃縮液稀釋上大孔離 子交換樹脂柱，結束後水洗柱子，再洗脫並將洗脫液濃縮，然後將收集到的CDP-choline溶 液加熱送至超濾器除雜、脫色，加入乙醇攪拌，並放置冷庫過夜；再將結晶液進行離心分離、 真空乾燥，烘乾後裝袋稱重密封乾燥保存。該工藝流程繁瑣，產品損失率高。村田英城等 (W02007/018259A1.)用強酸性(H型)離子交換柱和活性碳柱分離純化細胞轉化液，產品 收率僅為80%。徐仁華等(CN1944661A.)在上述基礎上加以改進以活性碳為吸附載體，以 Cl—型離子交換樹脂為分離載體分離純化細胞轉化液，產品收率略有提高。這些方法雖然都實現了⑶P-choline的分離，但均要使用兩道樹脂或活性炭柱， 導致生產工藝冗長，產品損失率居高不下，成為其發展的瓶頸。邱蔚然等(CN101096380A.)首次提出了採用離子交換樹脂組合層析法，分離CDP-choline，並同時回收未反應完的胞苷 酸，該方法可以回收細胞轉化液中少量的未反應的胞苷酸，但純化過程CDP-choline的收 率僅為80. 9%，同樣沒能解決分離效率低，產品收率低的問題。⑶P-choline分子由膽鹼和磷酸胞嘧啶核苷酸組成，經X光衍射測定，整個分子式 高度捲起，多個分子聚合在一起，以5』 -磷酸胞嘧啶核苷酸為核心，磷酸和膽鹼部分暴露於 外，與周圍的水分子鬆散的結合，呈現一定的疏水性。利用這一特性，本發明將CDP-choline 和疏水介質相結合，5』 -磷酸胞嘧啶核苷酸基團會帶動磷酸和膽鹼部分有離開水相進入非 極性相的趨勢，即疏水性吸附。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種疏水層析法分離純化胞二磷膽鹼的方法， 通過對⑶P-choline轉化液進行離心、超濾等處理後，再進行上柱吸附、洗脫過程，可得到 高收率、高純度的⑶P-choline溶液。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下疏水層析法分離純化胞二磷膽鹼，包括如下步驟(1)胞二磷膽鹼轉化液經酶滅活、離心和超濾預處理；(2)將預處理後的胞二磷膽鹼轉化液調pH2. O 14. O後，加入無機鹽配製成含有 0. 01 5mol/L無機鹽和0. 1 40g/L胞二磷膽鹼的上柱液，經疏水層析樹脂吸附，再經 pH2. O 14. O的純水洗脫；(3)將洗脫液經納濾脫鹽濃縮、結晶得到胞二磷膽鹼。步驟(1)中，調節胞二磷膽鹼轉化液pH值至2. O 3. O使酶滅活，再經6000 12000rpm離心分離10 60min，取上清液經截留分子量為3000 8000Dolton的超濾膜超 濾。優選的是，調節胞二磷膽鹼轉化液PH值至2. 0使酶滅活，再經8000 IOOOOrpm離心 分離15 20min，取上清液經截留分子量為5000 6000Dolton的超濾膜超濾。最優選的 是，調節胞二磷膽鹼轉化液PH值至2. 0使酶滅活，再經SOOOrpm離心分離20min，取上清液 經截留分子量為5000Dolton的超濾膜超濾。上述超濾膜優選中空纖維超濾膜，膜材料為聚 碸膜，超濾壓力一般控制在0. 1 1. 5MPa。通過上述預處理可將⑶P-choline轉化液中的 菌體不溶物以及大分子蛋白質等進行去除。步驟(2)中，所述的無機鹽為無機鈉鹽或無機鉀鹽或無機銨鹽，例如可以使氯化 鈉、硝酸鈉、硫酸鈉、氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硝酸鉀或硫酸鉀等。步驟(2)中，所述的疏水層析樹脂為以聚苯乙烯、聚丙烯酸或縮聚酚醛為惰性 骨架，以磺酸基、磷酸基、砷酸基或硒酸基作為功能基團的樹脂，例如可以是CAD-40、X-5、 H103、ADS-17、AB-8、NKA-II或NKA-9。所述的疏水層析樹脂需經過0. 01 5mol/L無機鹽 水溶液浸泡1 48h後使用，優選1 2mol/L無機鹽水溶液浸泡2h。所述的無機鹽為無機 鈉鹽或無機鉀鹽或無機銨鹽，例如可以使氯化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉、氯化銨、硫酸銨、磷酸二 氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硝酸鉀或硫酸鉀等。浸泡樹脂的無機鹽與加入上柱液中的無機 鹽可以相同或不同，優選使用相同的無機鹽。步驟(2)中，優選的方案是將預處理後的胞二磷膽鹼轉化液調PH2.0 5.0後，加 入無機鹽配製成含有1 3mol/L無機鹽和5 15g/L胞二磷膽鹼的上柱液，經疏水層析樹
4脂吸附，再經PH7. 0 10. 0的純水洗脫。步驟⑵中，吸附流速為10 lOOmL/min，洗脫流速為5 50mL/min。優選的是， 吸附流速為30 50mL/min，洗脫流速為10 20mL/min。步驟(2)中，吸附和洗脫的溫度為10 40°C。步驟(3)中，所述的納濾，其納濾膜截留分子量為100 300Dolton，優選截留分子 量為 150Dolton。本發明中提及的胞二磷膽鹼轉化液其製備方法為全細胞催化合成法，具體參見 「一種胞二磷膽鹼的製備方法」(200810019854. 9)。本發明中並不對結晶方法進行任何限制，常規的能將胞二磷膽鹼結晶析出的方法 都可以，優選方法參見「一種胞二磷膽鹼的鹽析_溶析結晶方法」(200810019855. 3)。有益效果本發明將膜分離技術與疏水層析技術相結合，將CDP-choline轉化液 離心、超濾處理後經一道非極性樹脂進行分離，大大縮減了分離過程，簡短了各工藝步驟的 損失；本發明採用純水洗脫方式，避免了傳統工藝中乙醇-水式帶來的安全隱患。本工藝簡 化了工藝流程，減低了產品損失率，提高了分離效率和產物收率。上述的分離工藝與傳統的 分離工藝相比，具有工藝流程簡單，成本低廉的優點。通過上述的樹脂吸附分離過程得到的 ⑶P-choline溶液的純度超過98%，收率超過90%。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例中⑶P-choline轉化液的製備按如下方法操作酵母培養基(g/L)葡萄糖40，尿素2. O,磷酸二氫鉀1. 5，七水合硫酸鎂0. 5，七 水合硫酸鋅4. OX 10_3，七水合硫酸亞鐵3. OX 10_3，四水合氯化錳0. 3X 10_3，無水氯化鈣 1.0父10-3，生物素0.05\10-3。釀酒酵母接種量10%，於30°C下120rpm搖床培養24小時， 離心4000rpm，20分鐘。取酵母泥，_7°C保藏備用。在容量為15L的反應槽中，調製由60mM氯化膽鹼、0. 20M磷酸二氫鈉、30mM CMP、 0. 3M葡萄糖、50mM硫酸鎂、ImM氯化鉀、2mM半胱氨酸、上述方法培養的2800克釀酒酵母泥、 十六烷基三甲胺·溴化銨10克和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH至6. 8，於37°C條 件下低速攪拌反應10h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析。實施例1 按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中 CDP-choline 的濃度為 9. 47g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至2. 0滅酶活，經8000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為5000Dolton，超濾膜工作壓力為IMPa。(2)超濾透過液中加入氯化鈉，配製成含有2. 5mol/L氯化鈉、5g/L CDP-choline 的上柱液，用鹽酸調pH至4. 0。磺酸基聚苯乙烯樹脂預先經2. 0mol/L的氯化鈉浸泡lh，再
5裝填成柱(高徑比為10 1，以下實施例高徑比相同)。上柱液進入填充磺酸基聚苯乙烯樹 脂的疏水層析柱吸附，吸附流速為SOmL/min，當吸附流出液中CDP-choline的濃度達到進 樣濃度的5%時，認為到達穿透點，停止吸附；用pH8. 0的純水進行洗脫，洗脫流速為40mL/ min。吸附和洗脫溫度為10°C，洗脫完畢經測得整個樹脂分離過程⑶P-choline的收率為 89. 6%，純度為 97. 3%。(3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為lOODolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為99. 1 %的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。實施例2 按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中 CDP-choline 的濃度為 10. 75g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至3. 0滅酶活，經10000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為3000Dolton，超濾膜工作壓力為1. 5MPa。(2)超濾透過液中加入硫酸銨，配製成含有0. 01mol/L硫酸銨、5g/L CDP-choline 的上柱液，用鹽酸調PH至2. 0，磷酸基聚丙烯酸樹脂預先經0. 03mol/L的硫酸銨浸泡48h， 再裝填成柱。上柱液進入填充磷酸基聚丙烯酸樹脂的疏水層析柱吸附，吸附流速為IOOmL/ min，當吸附流出液中⑶P-choline的濃度達到進樣濃度的5%時，認為到達穿透點，停止吸 附；用pH7. 0的純水進行洗脫，洗脫流速為50mL/min。吸附和洗脫溫度為10°C，洗脫完畢經 測得整個樹脂分離過程⑶P-choline的收率為87. 5%，純度為96. 3%。(3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為150Dolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為98. 7%的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。實施例3 按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中 CDP-choline 的濃度為 12. 8g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至2. 0滅酶活，經8000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為8000Dolton，超濾膜工作壓力為0. 5MPa。(2)超濾透過液加入磷酸二氫鉀，配製成含有lmol/L磷酸二氫鉀、IOg/ IXDP-choline的上柱液，用鹽酸調pH至4. 0。砷酸基縮聚酚醛樹脂預先經1. 5mol/L的磷 酸二氫鉀浸泡8h，再裝填成柱。上柱液進入填充砷酸基縮聚酚醛樹脂的疏水層析柱吸附，吸 附流速為40mL/min，當吸附流出液中⑶P-choline的濃度達到進樣濃度的5%時，認為到達 穿透點，停止吸附；用PH10. 0的純水進行洗脫，洗脫流速為20mL/min。吸附和洗脫溫度為 25°C，洗脫完畢經測得整個樹脂分離過程⑶P-choline的收率為92. 7%，純度為99. 1%。(3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為300Dolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為99. 4%的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。實施例4 按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中CDP-choline 的濃度為 10. 2g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至3. 0滅酶活，經8000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為5000Dolton，超濾膜工作壓力為IMPa。(2)超濾透過液加入氯化銨，配製成含有2. 5mol/L氯化銨、10g/L CDP-choline的 上柱液，用鹽酸調pH至5. 0。磺酸基聚丙烯酸樹脂預先經2. 5mol/L的氯化銨浸泡2h，再裝 填成柱。上柱液進入填充磺酸基聚丙烯酸樹脂的疏水層析柱吸附，吸附流速為50mL/min，當 吸附流出液中⑶P-choline的濃度達到進樣濃度的5%時，認為到達穿透點，停止吸附；用 pH7. 0的純水進行洗脫，洗脫流速為25mL/min。吸附和洗脫溫度為25°C，洗脫完畢經測得整 個樹脂分離過程⑶P-choline的收率為91. 6%，純度為98. 4%。(3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為150Dolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為99. 0%的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。實施例5:按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中 CDP-choline 的濃度為 16. 6g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至2. 0滅酶活，經8000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為6000Dolton，超濾膜工作壓力為0. 5MPa。(2)超濾透過液加入硫酸鈉，配製成含有3mol/L硫酸鈉、15g/L CDP-choline的上 柱液，調PH至3.0。磺酸基聚丙烯酸樹脂預先經3mol/L的硫酸鈉浸泡2h，再裝填成柱。上 柱液進入填充磺酸基聚丙烯酸樹脂的疏水層析柱吸附，吸附流速為30mL/min，當吸附流出 液中⑶P-choline的濃度達到進樣濃度的5%時，認為到達穿透點，停止吸附；用pH9. 0的 純水進行洗脫，洗脫流速為lOmL/min。吸附和洗脫溫度為40°C，洗脫完畢經測得整個樹脂 分離過程CDP-choline的收率為91. 9%，純度為99. 2%0(3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為200Dolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為99. 4%的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。實施例6 按照上述的全細胞催化合成方法，製備⑶P-choline轉化液15L，其中 CDP-choline 的濃度為 15. 3g/L。處理工藝如下(1)將全細胞催化轉化液用鹽酸調節pH至2. 0滅酶活，經8000rpm、20min離心後 去除固體雜質。取離心上清液經超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚碸膜，超濾 膜截留分子量為5000Dolton，超濾膜工作壓力為IMPa。(2)超濾透過液加入硝酸鉀，配製成含有1. Omol/L硝酸鉀、15g/L CDP-choline的 上柱液，用鹽酸調pH至5. 0。磺酸基聚丙烯酸樹脂預先經3. 0mol/L的硝酸鉀浸泡2h，再裝 填成柱。上柱液進入填充磺酸基聚丙烯酸樹脂的疏水層析柱吸附，吸附流速為40mL/min，當 吸附流出液中⑶P-choline的濃度達到進樣濃度的5%時，認為到達穿透點，停止吸附；用pH7. 0的純水進行洗脫，洗脫流速為lOmL/min。吸附和洗脫溫度為40°C，洗脫完畢經測得整 個樹脂分離過程⑶P-choline的收率為92. 6%，純度為98. 7%。 (3)洗脫液經納濾處理除鹽濃縮，納濾膜截留分子量為200Dolton，再按專利 200810019855. 3的方法結晶，得到純度為99. 1 %的胞二磷膽鹼鈉鹽晶體。
權利要求
一種疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)胞二磷膽鹼轉化液經酶滅活、離心和超濾預處理；(2)將預處理後的胞二磷膽鹼轉化液調pH2.0～14.0後，加入無機鹽配製成含有0.01～5mol/L無機鹽和0.1～40g/L胞二磷膽鹼的上柱液，經疏水層析樹脂吸附，再經pH2.0～14.0的純水洗脫；(3)將洗脫液經納濾脫鹽濃縮、結晶得到胞二磷膽鹼。
2.根據權利要求1所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(1) 中，調節胞二磷膽鹼轉化液PH值至2. 0 3. 0使酶滅活，再經6000 12000rpm離心分離 10 60min，取上清液經截留分子量為3000 8000Dolton的超濾膜超濾。
3.根據權利要求2所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(1) 中，調節胞二磷膽鹼轉化液PH值至2.0使酶滅活，再經8000 IOOOOrpm離心分離15 20min，取上清液經截留分子量為5000 6000Dolton的超濾膜超濾。
4.根據權利要求1所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(2) 中，所述的無機鹽為無機鈉鹽或無機鉀鹽或無機銨鹽。
5.根據權利要求1所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(2) 中，所述的疏水層析樹脂為以聚苯乙烯、聚丙烯酸或縮聚酚醛為惰性骨架，以磺酸基、磷酸 基、砷酸基或硒酸基作為功能基團的樹脂，所述的疏水層析樹脂經過0. 01 5mol/L無機鹽 水溶液浸泡1 48h後使用。
6.根據權利要求5所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於所述的無 機鹽為無機鈉鹽或無機鉀鹽或無機銨鹽。
7.根據權利要求1所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(2) 中，將預處理後的胞二磷膽鹼轉化液調PH2. 0 5. 0後，加入無機鹽配製成含有1 3mol/ L無機鹽和5 15g/L胞二磷膽鹼的上柱液，經疏水層析樹脂吸附，再經pH7. 0 10. 0的純 水洗脫。
8.根據權利要求1或7所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟 (2)中，吸附流速為10 lOOmL/min，洗脫流速為5 50mL/min。
9.根據權利要求8所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(2) 中，吸附流速為30 50mL/min，洗脫流速為10 20mL/min。
10.根據權利要求1所述的疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於步驟(3) 中，所述的納濾，其納濾膜截留分子量為100 300Dolton。
全文摘要
本發明公開了一種疏水層析分離純化胞二磷膽鹼的方法，該方法包括如下步驟(1)胞二磷膽鹼轉化液經酶滅活、離心和超濾預處理；(2)將預處理後的胞二磷膽鹼轉化液調pH2.0～14.0後，加入無機鹽配製成含有0.01～5mol/L無機鹽和0.1～40g/L胞二磷膽鹼的上柱液，經疏水層析樹脂吸附，再經pH2.0～14.0的純水洗脫；(3)將洗脫液經納濾脫鹽濃縮、結晶得到胞二磷膽鹼。本發明的方法分離工藝簡單，樹脂洗脫結束後經再生處理，可反覆利用，分離成本低廉，產品容易結晶，可得到高純度、高收率的CDP-choline產品。
文檔編號C07H19/10GK101906126SQ20101010782
公開日2010年12月8日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者周錫群, 應漢傑, 張磊, 柏建新, 沈素芹, 熊健, 苑巍, 金乃純 申請人:南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司