一種製備豬α-幹擾素的方法

2023-05-08 13:11:51 1

專利名稱：：一種製備豬α-幹擾素的方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程
技術領域：
，涉及用高分泌型枯草芽孢桿菌表達系統製備豬a-幹擾素的方法。
背景技術：
：幹擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，並不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的複製；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，並增強抗病毒能力，替代部分抗生素的使用。1966—1971年，Friedman發現了幹擾素的抗病毒機制，而後，千擾素的免疫調控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗腫瘤作用逐漸被人們認識。豬ot-幹擾素基因有2個亞型，至少有17個亞種，定位於豬的l號染色體上，目前只有部分被測序和表達。豬a-幹擾素是由10多個相關功能基因編碼的蛋白質家族，與豬-co幹擾素亞型之間有高度的同源性。豬a-幹擾素的全基因為570bp，編碼189個胺基酸，其中誘導分泌表達的信號肽由23個胺基酸組成，豬a-幹擾素無內含子。早在1986年，Lefevre等得到了一個含a-幹擾素基因的片段，序列分析表明其中有一連續的含190個密碼子的開放閱讀框，起始密碼子上遊有約IOO個核苷酸的5'區域，具TATTTAA序列，被認為是經修飾的HognessGoldberg盒。此基因編碼的成熟豬a-幹擾素的70-80位胺基酸有一個潛在的N-糖基化位點。此基因與人IFN-al核苷酸的編碼序列有78.5。/。同源，編碼的胺基酸與人IFN-al有64M同源，是所有已知動物IFN-(x基因中與人類IFN-a基因同源性最高的。隨著豬幹擾素基因的克隆成功，對其重組產物的臨床應用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，Lefevre等人在大腸桿菌中表達了IFN-a基因，得到了一個含189個胺基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個胺基酸的信號肽後，得到了具有完全天然IFN-a生物學活性的產物，並且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細胞產生的幹擾素的6倍。重組豬a-幹擾素的抗病毒能力是後續研究的一個熱點，如對偽狂犬病毒(Janetal,1991)、水泡性口膜炎病毒、流感病毒(Horisberger，1992)、傳染性胃腸炎病毒(Jordanetal,1994)、豬呼吸與繁殖綜合症病毒(Albinaetal，1998)和口蹄疫病毒(Chinsangarametal,2001)等。國內對豬(x-幹擾素的研究也比較早，劉萬鈞等(1998)用Vero傳代細胞對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)進行幹擾試驗，證明豬白細胞幹擾素能有效地抑制PEDV的繁殖活性，在IFN劑量為100U/ml時可明顯抑制，1000U/ml可顯著抑制，2500U/ml幾乎可完全抑制。其它研究人員對豬-a幹擾素基因進行了克隆和表達，並獲得了具有抗病毒活性重組蛋白，陳濤(2002)將克隆的豬a-幹擾素基因進行了定點突變，第86位的CyS突變為Tyr，同時將N端首位胺基酸(CyS)的密碼子TGT同義突變為大腸桿菌偏愛的密碼子TGC，並將在大腸桿菌BL21中表達，獲得的重組蛋白比未突變的重組蛋白抗病毒能力有所提高。謝海燕等(2004)在大腸桿菌BL21(DE3)中對豬a-幹擾素進行了融合表達，經western-blotting檢測，重組融合蛋白具有良好的反應源性；豬幹擾素是一類具有抗病毒和免疫調節活性的細胞因子，是豬體抵禦病原入侵的重要早期防禦系統之一。應用基因工程的方法通過大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統等表達的重組豬幹擾素可以具有與天然幹擾素高度相似甚至更高的抗病毒等生物學活性。因此，作為一類具有高效的抗病毒和免疫調節作用的生物製劑，重組豬a-幹擾素在養豬業有廣泛的應用前景。1980-1982年，科學家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內獲得了幹擾素，從每1升細胞培養物中可以得到20-40毫升幹擾素。從1987年開始，使用基因工程方法生產幹擾素。但目前的豬a-幹擾素存在著穩定性差、產品活性低等難題。
發明內容本發明的目的在於提供一種製備豬a-幹擾素的方法，通過以下技術方案實現(1)設計一對在大腸桿菌中表達豬a-幹擾素成熟肽基因的表達引物，克隆豬a-幹擾素成熟肽基因，得到重組質粒；SEQNOh5Eifn5，-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3'SEQNO2:3Eifn5，-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3'胸I豬a-幹擾素基因序列見SEQNO3。(2)載體構建將重組質粒和表達載體用五COl和^"I進行雙酶切，回收酶切片段，與表達載體連接，轉化，篩選陽性質粒，然後進行PCR和酶切鑑定；(3)豬a-幹擾素在枯草芽孢桿菌中的表達製備芽孢桿菌感受態細胞，將重組質粒經過點擊轉化導入其中，作進一步培養，並抽提質粒後進行和^d雙酶切檢驗；(4)重組工程菌的蛋白電泳菌液上清進行濃縮，用銀染對SDS-PAGE進行染色；(5)豬a-幹擾素標的產物產量和活性的研究；(6)菌種製備將豬a-幹擾素基因工程菌菌株接種到含氨苄青黴素鈉的LB液體培養基中培養，將菌液接種於發酵罐中，溫度3(TC，pH為7.0，攪拌速度200-220rpm，培養6小時後增溫至45"C誘導，豬a-幹擾素開始表達，至28小時表達量達到最大值，在此期間質粒穩定性良好；(7)獲得產品離心收集菌體，用緩衝液衝洗菌體，冰浴超聲破碎，取上清液，收集包涵體沉澱，用洗滌液洗滌，取上清液，加入復性液，調節pH用復性液透析，取上清液濃縮；(8)產品純化利用DEAE陰離子交換纖維柱梯度洗脫，收集含豬a-幹擾素的洗脫液，超濾濃縮，得到產品。本發明提供的方法，不僅提高豬a-幹擾素的穩定性，降低其生產成本，提高其生產效率，而且能提高豬a-幹擾素的單位體積的活性。具體體現在(1)構建的載體整合到芽孢桿菌中，十分穩定，不易丟失。(2)發酵初期採用不含甲醇的LB培養基，培養後期採用1.0%甲醇誘導培養基培養，使芽孢桿菌的生長和蛋白表達有效分開，從而使得幹擾素表達量可維持在較高的水平，不易分解。(3)本發明是一種用高分泌型枯草芽孢桿菌表達系統生產豬a-幹擾素的新工藝，這種新工藝通過目的基因克隆、構建芽孢桿菌表達載體、克隆啟動子和信號肽序列並研究其對外源基因表達和分泌的影響，從而構建構建高效分泌型芽孢桿菌表達系統。通過改進豬a-幹擾素基因工程菌發酵條件，提高其表達量；在復性液中添加與鹽酸胍有相似結構的精氨酸，促進蛋白質溶解，不影響蛋白質活性，來提高豬a-幹擾素的比活性。從而生產出具有高效、價廉、安全、無潛在病毒汙染、穩定性高、單位體積活性效價高等優點的豬C-幹擾素，這為工業化生產豬a-幹擾素，並應用於我國的養豬事業奠定了基礎。圖1為基因克隆示意圖。圖2為豬a幹擾素基因PCR擴增電泳。圖3為豬a-幹擾素基因在枯草芽孢桿菌中的表達。圖4為含有限制性酶切位點Sa/I和^^1的PoIFN基因擴增。圖5為枯草桿菌陽性表達子的雙酶切產物電泳。圖6為豬a-幹擾素基因在枯草桿菌中表達產物的蛋白質電泳。具體實施例方式本發明結合附圖和具體實施例作進一步的說明。實施例l:豬OC-幹擾素生產用芽孢桿菌種的構建一材料與方法(一)實驗材料(1)目的基因擴增設計一對在大腸桿菌中表達豬(X-幹擾素成熟肽基因的表達引物，在上、下遊引物的5'端分別引入EcoiI和iVWl酶切位點序列，引物序列如下SEQN01:5Eifn5，-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3，Eco/ISEQN02:3Eifn5，-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3，胸I豬a-幹擾素基因序列見SEQN03。(2)載體構建將按照上述方法得到的重組質粒和表達載體用和^Z^I進行雙酶切，回收酶切片段，將經雙酶切的基因片段與表達載體連接，轉化，篩選陽性質粒，然後提取重組表達質粒，進行PCR和酶切鑑定，以稀釋10倍的重組表達質粒為模板，5'Pifn和3'Pifn為引物擴增豬a-幹擾素基因，反應體系如下，PCR反應體系_tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7PCR產物經割膠回收與pEGM-T載體連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplO並塗LB平板(塗有IPTG和X-gal，含Amp)過夜培養。挑取白斑於LB培養基中，37QC培養12-14h，提取質粒進行PCR鑑定，結果參見圖l，圖2。圖2中1為基因組DNA作模板PCR擴增產物，2為豬a幹擾素基因組，M為DNAMarker。(3)豬a-幹擾素在枯草芽孢桿菌中的表達表達策略參見圖3，製備芽孢桿菌感受態細胞，將重組質粒經過點擊轉化導入其中，在含Amp和Kan雙抗的平板上挑取表達子，進行PCR鑑定，參見圖4，圖4中M為DNAmarker,l為陰性對照，2-3為含SalI和Xbal酶切位點的PoIFN基因的擴增。將篩選到的疑似重組子作進一步培養，並抽提質粒後進行Sa/I和力d雙酶切檢驗，參見圖5，圖5中1為重組質粒(SalI/Xbal)雙酶切產物，2為質粒pBESl未酶切，3為pBESl(SalI/XbaI)雙酶切產物，M為500bp(marker)。(4)重組工程菌的蛋白電泳菌液上清進行濃縮，需要用靈敏度更高的銀染對SDS-PAGE進行染色，菌液在約19KD處有一條特異性條帶，說明重組a-幹擾素基因已在枯草桿菌中成功表達，參見圖6，圖6中M為蛋白marker,l-2為濃縮的重組蛋白，3為含有pEBSl空質粒的枯草桿菌。(5)豬a-幹擾素標的產物產量和活性的研究活性檢測結果表明，利用本工藝生產的豬(x-幹擾素，具有較高的抗病毒能力，純化後活性約為1.8xl06U/ml。實施例2:豬oc-幹擾素工業化發酵一、實驗材料(1)菌種芽孢桿菌(2)發酵罐(3)分光光度計(4)培養基及其他試劑LB培養基；人肝癌細胞(BEL-7402)細胞由浙江大學飼料科學研究所提供，豬腎細胞，水皰性口炎病毒(VSV)由浙江省農科院畜牧科學研究所提供。二、發酵方法(1)菌種製備將豬a-幹擾素基因工程菌(&"7^w^'to菌株由中科院微生物研究所提供，編號為1.1629，分離號為BR151-CM1)菌株接種到含氨苄青黴素鈉的LB液體培養基中，於37。C，220r/min恆溫震蕩培養12h，至OD600約為1.2。(2)生產條件將菌液接種於發酵罐中，溫度3(TC，pH為7.0，攪拌速度200-220rpm，培養6小時後增溫至45。C誘導，豬a-幹擾素開始表達，至28小時表達量達到最大值，在此期間質粒穩定性良好。(3)獲得產品離心收集菌體，用pH7.0的0.1mol/L的Tris-HCl，衝洗菌體，懸浮於裂解液中(4倍體積)，冰浴超聲破碎，1000rpm離心10分鐘取上清液，10000rpm離心10分鐘，收集包涵體沉澱，用洗滌液(50mmol/LTris-HCl、5mmol/LEDTA、8mmol/L尿素、20mmol/L卩-巰基乙醇、0.015mol/LNaCl、pH8.5)4°C條件下洗滌3次，每次1小時，12000rpm離心15min，取上清液，加入復性液中(0.5mmol/LL-精氨酸、50mmol/LTris-HCl、5mmol/LEDTA、6mol/L鹽酸胍、10%蔗糖、20mmol/Lp-巰基乙醇、0.1mmol/L氧化型穀胱甘肽、lmmol/L還原型穀胱甘肽，pH8.0)，4r攪拌，調節pH8.4，用不含穀胱甘肽和(3-巰基乙醇的復性液透析，每2h換一次，共換4次，所得透析液12000rpm離心15min，取上清液濃縮。(4)產品純化利用DEAE陰離子交換纖維柱用0.1-0.3mol/LNaCl、20mmol/LTris-HCl緩衝液梯度洗脫，收集含豬a-幹擾素的洗脫液，超濾濃縮，用S-200凝膠層析柱，pH為7.6Tris-HCl洗脫，收集成分，得到產品。實施例3:利用微量細胞病變抑制法檢測豬a-幹擾素抗病毒活性。a復性重組蛋白對人肝癌細胞(BEL-7402)的影響1)重組蛋白來源於透析剩餘物；2)指數生長期的人肝癌細胞(BEL-7402)，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化後用RPMI-1640培養基(含15。/。新生小牛血清)製成單細胞懸液，以5x1(WmL細胞濃度100pl/孔接種於96孔培養板中培養；3)細胞懸液培養24h後，棄原培養液，加入新鮮培養液904)設對照組，不同濃度重組測試組，每組設四個重複；5)測定孔加IOpl不同濃度復性的濃縮蛋白，對照孔加入等量的RPMI-1640培養液；6)將培養板置於370C，5%(302飽和溼度條件下培養箱中培養，培養24h後取出一塊培養板，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。經過不同濃度復性蛋白處理的人肝癌細胞(BEL-7402)培養過夜後，在Olympus倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，與對照組相比，經復性的濃縮蛋白處理的人肝癌細胞的細胞質發生了濃縮，表現出細胞凋亡的特徵b重組豬a-幹擾素對病毒的抑制待豬腎細胞在96孔培養板中長成單層後，傾去營養液，分別將倍比稀釋的大腸桿菌表達重組幹擾素和枯草芽孢桿菌表達重組幹擾素10^d和9(^l細胞維持液加到孔中，每一稀釋度做4個重複。將細胞培養板置於5%(:02、37^C培養箱中繼續培養過夜，傾去孔內液體，用維持液洗兩遍，加入100個TCID5(/ml的病毒稀釋液，同時設空白和陰性對照，37^繼續在C02培養箱中培養過夜，在倒置顯微鏡下觀察結果。在病毒抑制實驗中體現出相應的抗病毒活性。實施例4:實驗動物21日齡斷奶仔豬240隻。實驗方法本工藝產得幹擾素產品，按照600U/Kg劑量，通過飲水詞喂，對斷奶仔豬進行7天連續飼喂，飲用含本工藝生產出的幹擾素飲用水，觀察斷奶仔豬的生長情況，沒有發現異常現象和病例變化。實施例5:實驗動物選自80Kg育肥豬240隻實驗方法本工藝產得幹擾素產品，按照600U/Kg劑量，通過飲水飼喂，對育肥豬進行7天連續飼喂，飲用含本工藝生產出的幹擾素飲用水，觀察育肥豬的生長情況，沒有發現異常現象和病例變化。本發明涉及的序列杭州萬得富生物技術有限公司—種製備豬a-幹擾素的方法3128DNA人工序列1TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA28233DNA人工序列2GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT333680DNA豬a-幹擾素全長基因片段(thenucleotidesequencesofporcinealphainterferongene)3TCACAGAGTCACCCACCTTAGCCAGGACAGAAGATTCTGCMGGTCCCCAATGGCCCCATCCTCAACTTT70CCTCACGGTCCTGGTGCTGCTCAGCTGCAATGCCATCTGCCTTCTGGGCTGCAACCTGCCTCAGACCCAC140AGCCTGACTCATACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACMATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGG210ACCACAGAAGGGACTTTGATCCCCTCATGAGGCTTTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCMGCCATG280GCTGCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCCTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGG350GATGAGAGCCCCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGMGCCTGTGTCA420TGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTT490CCACAGACTCACCCTCTATCTGCAGGAGAAGAACTACAGCCTCTGTGCCTGGGAGATCATCAGGGCAGM560GTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAMCCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGACAGACACCTG630GTTCATCTCGGAMTGCTTCTCACAGACTAACAAGCCCATTCTTCCTCCT680權利要求1.一種製備豬α-幹擾素的方法，通過以下技術方案實現(1)設計一對在大腸桿菌中表達豬α-幹擾素成熟肽基因的表達引物，在上、下遊引物的5』端分別引入EcoRI和NotI酶切位點序列；(2)載體構建將重組質粒和表達載體用EcoI和XbaI進行雙酶切，回收酶切片段，與表達載體連接，轉化，篩選陽性質粒，然後進行PCR和酶切鑑定；(3)豬α-幹擾素在枯草芽孢桿菌中的表達製備芽孢桿菌感受態細胞，將重組質粒經過點擊轉化導入其中，作進一步培養，並抽提質粒後進行SalI和XbaI雙酶切檢驗；(4)重組工程菌的蛋白電泳菌液上清進行濃縮，用銀染對SDS-PAGE進行染色；(5)豬α-幹擾素標的產物產量和活性的研究；(6)菌種製備將豬α-幹擾素基因工程菌菌株接種到含氨苄青黴素鈉的LB液體培養基中培養，將菌液接種於發酵罐中，溫度30℃，pH為7.0，攪拌速度200-220rpm，培養6小時後增溫至45℃誘導，豬α-幹擾素開始表達，至28小時表達量達到最大值，在此期間質粒穩定性良好；(7)獲得產品離心收集菌體，用緩衝液衝洗菌體，冰浴超聲破碎，取上清液，收集包涵體沉澱，用洗滌液洗滌，取上清液，加入復性液，調節pH用復性液透析，取上清液濃縮；(8)產品純化利用DEAE陰離子交換纖維柱梯度洗脫，收集含豬α-幹擾素的洗脫液，超濾濃縮，得到產品。2.根據權利要求l所述的一種製備豬(x-幹擾素的方法，其特徵在於引物序列為SEQN01:5Eifn5，匿TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3'SEQN02:3Eifn5，-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3'胸I3.根據權利要求l所述的一種製備豬a-幹擾素的方法，其特徵在於所述豬a-幹擾素基因序列為SEQN03。全文摘要本發明提供一種製備豬α-幹擾素的方法，通過目的基因克隆、構建芽孢桿菌表達載體、克隆啟動子和信號肽序列並研究其對外源基因表達和分泌的影響，從而構建高效分泌型芽孢桿菌表達系統。通過改進豬α-幹擾素基因工程菌發酵條件，提高其表達量；在復性液中添加與鹽酸胍有相似結構的精氨酸，促進蛋白質溶解，不影響蛋白質活性，來提高豬α-幹擾素的比活性，從而生產出具有高效、價廉、安全、無潛在病毒汙染、穩定性高、單位體積活性效價高等優點的豬α-幹擾素，本發明設計合理，適於工業化生產。文檔編號C07K14/435GK101434958SQ20081016361公開日2009年5月20日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者餘東遊,劉韶娜,姜禮輝,陳偉東申請人:浙江大學;杭州萬得富生物技術有限公司