提高HepGL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法

2023-05-08 12:24:16 1

提高HepGL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法
【專利摘要】本發明公開一種提高HepGL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法，包括步驟：將HepGL肝癌細胞中提取的CPS1基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理；對根據處理後DNA擴增的CPS1啟動子區域進行甲基化特異性基因擴增；將擴增出的甲基化序列進行測序；根據甲基化位點周圍的鹼基序列構建TALENs表達質粒及與甲基化位點同源的非甲基化同源質粒，其中，同源質粒中同源非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列；將TALENs表達質粒和同源質粒轉染至HepGL肝癌細胞中；篩選發生轉染的HepGL肝癌細胞，並對其進行Q-PCR和蛋白質印跡法處理，以檢測細胞中CPS1的mRNA及蛋白的表達量。本發明方法能夠增強HepGL肝癌細胞代謝氨的能力。
【專利說明】提高HepGL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法。
【背景技術】
[0002]目前肝性腦病的治療，主要在於降低患者的血氨含量，以減少或避免有毒物質未經肝臟處理而進入血液循環。原因為血氨含量高會引起中樞神經系統功能紊亂，導致以中樞神經系統代謝紊亂為特點並出現意識行為改變或昏迷的臨床症候群。
[0003]現有肝性腦病的治療方式主要有藥物控制、肝移植和生物人工肝。但此三種治療方式都有其局限性，如:藥物控制需考慮患者自身機體是否能承受藥物治療所導致的其他機體器官功能的衰竭，當出現多器官功能衰竭時，是否還能進行藥物治療；目前供體肝臟數量有限，且每年供肝量無明顯增長的情況下，肝移植的治療範圍相對有限；生物人工肝雖無限制，但由於人工肝種子細胞相較於原代肝細胞在清除氨和合成尿素方面有明顯的功能差距，故目前該治療方法主要集中在如何提高種子細胞功能。
[0004]氨基甲酸憐酸合成酶I (carbamyl phosphate synthetaseI,CPSl)是尿素循環的第一個限速酶，其功能是結合ATP、碳酸氫鹽及氨基甲醯磷酸參與到鳥氨酸循環，使得氨最終代謝為尿素，經腎臟排洩出，以降低血氨。CPSl主要位於肝細胞和小腸上皮細胞的線粒體嵴，其中，乙醯穀氨酸為其變構輔助因子。CPSl的編碼基因位於2號染色體長臂第35號染色區間，其cDNA長度為4503bp。
[0005]以肝細胞為例，研究發現肝癌細胞中有很多功能蛋白的編碼基因及抑癌基因出現異常的甲基化，尤其在這些基因的啟動子區域，異常甲基化的情況更為明顯。同時，研究發現肝癌細胞在CPSl的編碼基因完整的情況下，出現CPSl表達缺失。
`[0006]如何提高H印GL肝癌細胞CPSl的表達，進而提高生物人工肝中種子細胞的除氨能力，是目前亟待解決的問題之一。

【發明內容】

[0007]本發明主要解決的技術問題是提供一種提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法，能夠增強HepGL肝癌細胞代謝氨的能力。
[0008]為解決上述技術問題，本發明採用的一個技術方案是:提供一種提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase,CPS)表達的方法,包括步驟:提取IfepGL肝癌細胞的CPSl基因組DNA，並將DNA進行重亞硫酸鹽處理；以處理後的DNA為模板，擴增CPSl的啟動子區域序列；以啟動子區域序列為模板，進行甲基化特異性基因擴增；將擴增出的甲基化序列進行測序，並與正常肝細胞的CPSl的啟動子區域序列進行比對；根據甲基化序列中甲基化位點周圍的喊基序列構建TALENs表達質粒及與所述甲基化位點同源的非甲基化同源質粒，其中，同源質粒中同源非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列；將TALENs表達質粒與同源質粒分別導入感受態大腸桿菌，並進行單克隆培養以獲取較多的TALENs表達質粒和同源質粒；將TALENs表達質粒和同源質粒轉染至H印GL肝癌細胞中；篩選發生轉染的H印GL肝癌細胞；設等量的2組H印GL肝癌細胞進行Q-PCR和蛋白質印跡法處理，以比較各組細胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達差異，具體為設置實驗組和陰性對照組2組處理，其中，實驗組為轉染後的IfepGL肝癌細胞，陰性對照組為加入PBS的H印GL肝癌細胞。
[0009]其中，CPSl的啟動子區域的引物序列為 5』 -GGAAAITTAAAG-3』，5』 -ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3，。
[0010]其中，以啟動子區域序列為模板，進行甲基化特異性基因擴增的引物包括針對甲基化DNA的弓丨物和針對非甲基化DNA的引物。
[0011 ]針對甲基化 DNA 的弓丨物序列為 5 』 -ATGGAAATTTAAAGATCGTTG TGTA-3 』，5 』 -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，。
[0012]針對非甲基化DNA 的引物序列為 5』 -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3』，5』 -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3』。
[0013]其中，提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法在生物人工肝種子細胞中用於提高CPSl表達的應用。
[0014]本發明的有益效果是:區別於現有技術的情況，本發明根據CPSl啟動子區域甲基化位點周圍的鹼基序列構建TALENs表達質粒，並將TALENs表達質粒及與甲基化位點同源的非甲基化序列轉染至HepGL肝癌細胞中，其中，同源非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列。通過上述方法，可將甲基化位點切除，然後切除埠重組同源性的非甲基化序列，由於該同源非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列，因此可使CPSl啟動子區域異常甲基化的基礎消失，從而提高CPSl的啟動子活性，使CPSl的mRNA及蛋白表達水平提高，最終提高HepGL肝癌細胞對氨的清除能力。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
[0016]本實施例的研究材料為IfepGL肝癌細胞。
[0017]在本實施例中，首先驗證CPSl的甲基化是否對其mRNA和蛋白的表達存在影響，具體驗證方法如下:
[0018]將HepGL肝癌細胞分為實驗組與對照組，在實驗組培養基中加入地西他濱(5umol/ml)，對照組中加入與地西他濱等量的PBS，每24小時換一次液，連續培養3天後，進行Q-PCR、蛋白質印跡法(western blot)檢測，以確認對照組與實驗組之間CPSl的mRNA及蛋白是否存在表達差異。實驗證明，CPSl的甲基化對其mRNA和蛋白的表達存在影響，具體為，對照組CPSlmRNA和蛋白的表達低於實驗組。
[0019]因此，消除CPSl的甲基化，提高H印GL肝癌細胞CPSl的表達，進而提高IfepGL肝癌細胞代謝氨的能力，對肝癌細胞的治療具有重要作用。
[0020]在本實施例中，提高H印GL肝癌細胞CPSl表達的方法，包括以下步驟:
[0021]1、提取H印GL肝癌細胞的CPSl基因組DNA。
[0022]利用Wizard Genomic DNA 分離試劑盒(Promega Madison WI)提取 HepGL 肝癌細胞的CPSl基因組 DNA。[0023]2、將提取的DNA進行重亞硫酸鹽處理。
[0024]米用試劑盒(EZDNA Methylation Direct Kit; Zymo Research, Orange, CA)對提取的DNA進行重亞硫酸鹽處理。具體方法如下:
[0025]a.取I μ gDNA溶解於36 μ I的ddH20中，加入新鮮配製的4 μ 13M NaOH,且使NaOH的最終濃度為0.3Μ，37°C水浴15分鐘，對DNA進行變性。
[0026]b.新鮮配製的IOmM對苯二酚30 μ I和3.6Μ (ΡΗ5.0)重亞硫酸鈉520 μ I加入上述變性後的溶液中，輕輕搖勻，55°C水浴16小時。
[0027]c.修飾後的DNA用脫鹽柱(Wizard DNA clean-up system)進行脫鹽,具體為首先把滅菌的3ml注射器活塞拔出，注射器桶接上脫鹽柱。取Iml Wizard脫鹽樹脂加入含有已修飾的DNA的1.5ml離心管中，輕柔倒置進行混合。
[0028]然後用微量移液管吸取離心管中的混合液到已滅菌的3ml注射器桶內，插入注射器活塞緩慢而輕柔地把混合液推入脫鹽柱中。從脫鹽柱取下注射器，拔出活塞，再把注射器桶接上脫鹽柱，吸取80%的異丙醇2ml加入到注射器桶中，插入活塞把異丙醇溶液推入脫鹽柱中清洗脫鹽柱。取下注射器，把脫鹽柱放在1.5ml離心管中，10000 X g，離心2分鐘，甩幹樹脂。
[0029]最後把離心後的脫鹽柱放入另一個已滅菌的1.5ml離心管，在脫鹽柱中加入70°C滅菌的雙蒸水50μ 1，等待I分鐘，10000 X g，離心20秒，洗提DNA。
[0030]3、以處理後的DNA為模板，擴增CPSl的啟動子區域序列。
[0031]針對重亞硫酸鹽處理後的DNA，設計引物以擴增CPSl啟動子區域序列。其中，設計的弓 I 物為序列 5 』 -GGAAATTTAAAG-3 』，5 』 -ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3 』。
[0032]擴增出的CPSl啟動子序列再經QIAquick膠抽提試劑盒進行膠純化。
[0033]4、以啟動子區域序列為模板，進行甲基化特異性基因擴增。
[0034]針對甲基化DNA 的弓丨物序列為:5 』 -ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3 』，5 』 -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，。
[0035]針對非甲基化DNA 的引物序列為:5』 -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3』，5』 -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3』。
[0036]若針對甲基化DNA的引物擴增出片段，則說明被檢測的位點存在甲基化，若針對非甲基化DNA的引物擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化。
[0037]擴增出片段後測序，並以原代肝細胞CPSl啟動子基因作為對照組進行比對。在本實施例中，針對甲基化DNA的引物擴增出甲基化序列，對擴出的甲基化序列進行測序。
[0038]5、根據甲基化序列中甲基化位點周圍的鹼基序列構建TALENs表達質粒及與所述甲基化位點同源的非甲基化同源質粒。
[0039]在本實施例中，甲基化位點周圍的鹼基序列為，L:agttgctttcttagga,R:catgaatttgatgaggtο
[0040] 本實施例構建表達質粒的試劑盒為上海斯丹賽生物技術有限公司生產的TALEN試劑盒(TALEN-kit)。利用該試劑盒構建表達質粒的方法如下:
[0041]a.從試劑盒中取出相應編號的模塊,每個模塊取1.5μ I,加入同一 PCR管中。
[0042]b.將試劑盒中標有溶液1、溶液2的EP管從_20°C冰箱裡取出置於冰盒上，溶液3放置於37°C水浴鍋中溶解。[0043]c.在步驟a的PCR管中加入相應的TALEN骨架載體，然後再依次加入溶液3、溶液I和溶液2，最後加水補至20 μ 1，短暫離心混勻。
[0044]d.將混勻後的PCR管放入PCR儀中進行連接反應。
[0045]e.連接反應後，取出PCR管並加入1μ I溶液4、0.5μ I溶液5，溶液5需37°C預先融化，混勻，在PCR儀或水浴鍋中37°C孵育I小時。
[0046]f.取孵育後的產物20μ I加入含感受態細胞(預先融化)的EP管中，混勻，在冰上放置30min，然後放入42°C水浴鍋中熱激45s，再迅速放置於冰上3min。
[0047]g.在超淨工作檯中向步驟f的EP管中加入500 μ I SOC溶液，然後將EP管置於37°C、250rpm的搖床中培養30min。
[0048]h.培養完成後取出EP管，將其在4000rpm的離心機中離心5min。
[0049]1.在超淨工作檯中棄去EP管中的大部分上清，留下約100 μ I上清，並將沉澱輕輕吹打混勻，然後均勻塗布於卡納黴素抗性(Ka+)的平板中，置於37°C培養箱中培養12-16小時。
[0050]j.培養後挑取24個單克隆，將單克隆接種於裝有5ml LB培養液(含Ka+)的15ml離心管中，然後置於37°C、250rpm的搖床中培養16h左右。
[0051]g.培養後，提取TALENs表達質粒。
[0052]同時，構建的同源質粒也導入感受態大腸桿菌進行單克隆培養，以獲得較多的同源質粒。·
[0053]6、將TALENs表達質粒和同源質粒轉染至H印GL肝癌細胞中，其中，同源質粒中同源的非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列。
[0054]在本實施例中，轉染至H印GL肝癌細胞中的TALENs表達質粒特異性結合於CPSl轉錄起始位點-9位的左邊和125位的右邊，用於使用核酸內切酶進行切割，使得DNA雙鏈斷裂。同時，結合轉染至HepGL肝癌細胞中的與切割的甲基化位點同源的非甲基化序列，誘使DNA出現同源性重組。DNA同源重組使異常甲基化的基礎消失，從而提高CPSl的啟動子活性，使CPSl的mRNA及蛋白表達水平提高，最終提高該細胞對氨的清除能力。
[0055]轉染的具體步驟如下:
[0056]a.轉染前I天將0.5~2X IO5個H印GL肝癌細胞接種於24孔培養板，並加入500ul不含抗生素的完全培養基，以保證轉染時細胞匯合達90~95%。
[0057]b.複合物的製備
[0058]①將0.8ugTALENs表達質粒和同源質粒稀釋於50ul無血清、無抗生素的培養液中，輕輕混勻。
[0059]②將2ul Lipofectamine2000稀釋於50ul無血清、無抗生素的培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5min。此過程在25min內進行。
[0060]③步驟①和步驟②中混勻的液體,5min後混合,室溫孵育20min。
[0061]c.吸去24孔培養板中的培養基，用PBS或無血清培養基清洗IfepGL肝癌細胞2次。
[0062]d.將步驟b製備的複合物IOOul加入24孔培養板的培養孔中，前後搖動培養板使複合物分布均勻。
[0063]e.將培養板放入培養箱孵育4~6h後，更換含血清培養基以去除複合物。[0064]f.換含血清培養基24h後，將H印GL肝癌細胞以1:10的比例傳代，I天后更換篩選培養基進行篩選，具體為吸出含血清培養基，用G418選擇性培養基稀釋H印GL肝癌細胞，進行篩選。
[0065]g.將篩選的發生轉染的IfepGL肝癌細胞進行克隆。
[0066]此方法處理得到的HepGL肝癌細胞可置於含氯化銨20mmol/ml或50mmol/ml的培養基中培養，通過MTT法或臺盼藍實驗檢測細胞的增值或凋亡情況，也可抽取隔日培養基檢測培養基中氨的濃度以檢測細胞對於氨的清除能力。
[0067]7、設等量的2組H印GL肝癌細胞進行Q-PCR和蛋白質印跡法處理，以比較各組細胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達差異，具體設有實驗組和陰性對照組，實驗組為轉染後的HepGL肝癌細胞，陰性對照組為加入磷酸鹽緩衝液的IfepGL肝癌細胞。
[0068]在本實施例中，還可在上述2組IfepGL肝癌細胞中分別加入20mmol/L的氨，以檢測其除氨能力。
[0069]本發明方法耗時較短，轉入DNA序列短，且成功率高，同時DNA轉入後可整合入細胞染色體中形成穩定表達，利於推廣使用。
[0070]本發明提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法可應用於生物人工肝種子細胞，使生物人工肝種子細胞中CPSl的表達提高，增強種子細胞的除氨能力。
[0071]以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護`範圍內。
【權利要求】
1.一種提高H印GL肝癌細胞氨基甲醯磷酸合成酶表達的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 提取H印GL肝癌細胞CPSl基因組DNA序列，並將所述DNA進行重亞硫酸鹽處理； 以所述處理後的DNA為模板，擴增CPSl的啟動子區域序列； 以所述啟動子區域序列為模板，進行甲基化特異性基因擴增； 將擴增出的甲基化序列進行測序，並與正常肝細胞的CPSl的啟動子區域序列進行比對； 根據所述甲基化序列中甲基化位點周圍的鹼基序列構建TALENs表達質粒及與所述甲基化位點同源的非甲基化同源質粒，其中，所述同源質粒中同源非甲基化序列為CG突變為CA的突變序列； 將所述TALENs表達質粒與同源質粒分別導入感受態大腸桿菌，並進行單克隆培養以獲取較多的TALENs表達質粒和同源質粒； 將所述TALENs表達質粒和同源質粒轉染至H印GL肝癌細胞中； 篩選發生轉染的IfepGL肝癌細胞； 設等量的2組H印GL肝癌細胞進行Q-PCR和蛋白質印跡法處理，以比較各組細胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達差異，具體為設置實驗組和陰性對照組2組處理，其中，實驗組為轉染後的IfepGL肝癌細胞，陰性對照組為加入PBS的IfepGL肝癌細胞。
2.根據權利要求1所述 的方法，其特徵在於，擴增所述CPSl的啟動子區域的引物序列為 5，-GGAAATTTAAAG-3，，5，-ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3，。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，以所述啟動子區域序列為模板，進行甲基化特異性基因擴增的引物包括針對甲基化DNA的引物和針對非甲基化DNA的引物； 所述針對甲基化 DNA 的弓丨物序列為 5 』 -ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3 』，5 』 -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，； 所述針對非甲基化DNA的引物序列為5』 -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3』，5』 -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3』。
4.權利要求1所述的方法在生物人工肝種子細胞中用於提高CPSl表達的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK103710360SQ201310643626
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】高毅, 姜錫男, 李陽 申請人:南方醫科大學珠江醫院