一株從百香果根際土壤中篩選的具有強抑草作用真菌的製作方法
2023-05-08 02:39:39 2
本發明屬於農作物病害防治領域，具體涉及一株從百香果根際土壤中篩選的具有強抑草作用真菌。
背景技術：
百香果(passifloraedulis)又名西番蓮、雞蛋果，是一種種植在熱帶、亞熱帶的藤本植物，其果汁具有助消化和滋補作用備受人們喜愛。據估計，目前世界百香果的種植面積已經達到2萬多公頃，但是由於百香果越來越受歡迎，市場的需求量在不斷的增加，百香果的種植面積也在不斷的增加。有統計表明，80年代初世界對百香果的需求已經超過25萬噸，但生產量也僅為12萬噸，需求遠遠大於供給。在我國最初是20世紀初引進，主要的種植地有福建、臺灣、海南、廣東、雲南等地。但由於長期的百香果種植，導致百香果種植土壤理化性質以及土壤微生態發生變化，從而致使百香果的幼苗和成株容易受到根腐病的危害。目前對於根腐病的研究認為其致病菌主要包括鐮刀菌和腐黴菌等病原菌。根際微生物種類豐富、數量龐大，並且，根與土壤微生物之間基於共同進化的壓力，通常它們之間具有專性。此外，根系分泌物的種類會影響到根際微生物群落結構。
雜草是影響作物產量提高的重要因素，現在已經成為世界性的難題。目前主要的除草方式是利用化學除草劑來進行農田的雜草防治。但長期、大量、非選擇性的施用化學除草劑會導致土壤和地下水汙染，雜草也會產生抗性。高濃度的化學除草劑也會增加農作物中有害物質的殘留。因此，我們需要一種更為生態友好的方法來進行雜草的防治。生物除草劑是用於生物除草的植物病原微生物或微生物植物毒素，它具有環境安全、相容性好、在土壤中無殘留等優點，是現在的一個研究熱點。
化感作用是指植物、藻類、細菌、真菌、放線菌產生並釋放次生代謝產物來影響周圍其他植物的生長發育（抑制或促進作用）和農業系統。這些次生代謝產物主要包括：酚酸、萜類、黃酮類、脂肪酸等等。這些化感物質的含量決定了化感作用的強弱。
本發明利用植物化感作用原理和根際微生態的理論，在長期種植百香果的果園並感染根腐病的百香果植株根際篩選對植物有害的病原菌，為雜草防治減少化學除草劑使用提供一個新的思路。
技術實現要素：
本發明提供一株從百香果根際土壤中篩選的聚多麴黴及其應用，該聚多麴黴發酵液中含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、水楊酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，因此其發酵液具有抑草作用。本發明具有環境安全、環境相容性好，在土壤中無殘留等優點。
為實現上述目的，本發明通過如下技術方案實現：
一株從桉樹根際土壤中篩選的聚多麴黴，所述聚多麴黴為aspergillussydowiifj-01-bxg-08；已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國，武漢，武漢大學，保藏日期為2017.4.19，保藏號為cctccm2017198。
所述聚多麴黴fj-01-bxg-08的菌體及發酵液均對萵苣、禾本科的稗草和狼尾巴草的生長具有抑制作用。
本發明的另一目的在於提供一種利用上述從桉樹根際土壤中篩選的聚多麴黴作為抑草真菌的方法，其使用方法如下：
（1）取菌株fj-01-bxg-08進行發酵培養；
（2）取發酵液稀釋1-100倍；
（3）將稀釋發酵液澆於種子或植株周圍即可。
本發明的優點在於：
該真菌菌株發酵液中含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、水楊酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，其具有環境安全、環境相容性好，在土壤中無殘留等優點；且對稗草和萵苣的根長和株高都有很強的抑制率。
附圖說明
圖1菌株fj-01-bxg-08發酵液中酚酸hplc色譜圖；其中，峰1為原兒茶酸；峰2為對羥基苯甲酸；峰3為香草酸；峰6為水楊酸；峰7為肉桂酸。
圖2菌株fj-01-bxg-08形態圖；圖2a為菌株分生孢子圖(10×40)，圖2b為菌落圖。
圖3菌株fj-01-bxg-08-itsi區目的條帶電泳圖；圖3a中泳道1為真菌菌株fj-01-bxg-08-itsi區目的條帶電泳圖，泳道2為dl10000dnamarker，圖3b為dl10000dnamarker標準電泳條帶示意圖。
圖4菌株fj-01-bxg-08利用nj法（鄰接法）構建的發育樹。
圖5不同濃度菌株fj-01-bxg-08發酵液對小稗生長的影響。
具體實施方式
實施例1
菌株發酵液的抑草能力生物測試
分別在組培瓶中放一張濾紙，取稀釋50倍的發酵液5ml加入到組培瓶中，每個組培瓶中播入5粒剛冒白的萵苣，蒸餾水做對照，並將其置28℃恆溫培養箱中培養，每個實驗設置3次重複。培養3d後測定萵苣的根長和株高。抑制率計算按公式：ir=（1-tr/ck）×100%。其中，ir：抑制率(inhibitionrate)；tr：處理(treatment)；ck：對照(control)。
再分別以稗草和狼尾巴草為實驗對象進行發酵液抑草能力測試。以稗草為實驗對象，發酵液稀釋20倍；以狼尾巴草為實驗對象，菌液稀釋50倍進行抑草能力測試。抑草能力生物測試實驗步驟同上，抑草能力測試結果見表1。
表1fj-01-bxg-08菌株發酵液稀釋後對受體植株的影響
試驗結果表明，fj-01-bxg-08菌株發酵液稀釋50倍後對萵苣的根長和株高都有很強的抑制作用，分別為80.08%和37.98%。對狼尾巴草的根長的抑制率達到45.15%，但對其株高抑制率只有9.93%。對於抗性較強的稗草，菌株發酵液稀釋20倍後對其根長和株高也有很強的抑制作用，抑制率分別達到58.41%和34.43%。
實施例2菌株鑑定
1、形態學鑑定
菌落的形態學觀察
在pda固體培養基平板中間接入用直徑0.8cm的打孔器打下的菌餅，28℃連續培養7d，每天觀察菌落邊緣和表面的質地、顏色紋飾等形態特徵。
顯微鏡形態觀察
將在pda固體培養基平板上培養3d的菌落用解剖針挑出一點菌落，放在中間滴有無菌水的載玻片上，然後用兩隻解剖針儘量的把菌落分散開，蓋上蓋玻片，用吸水紙把載玻片周圍的水吸乾，在光學顯微鏡下觀察分生孢子梗和孢子等形態。
形態學鑑定依據菌落的特徵，根據魏景超的《真菌鑑定手冊》和c.j.alexpoulos的introductorymycology對菌株進行初步的鑑定。
其分生孢子圖及菌落形態如圖2所示，其中，圖2a為菌株fj-01-bxg-08的分生孢子圖，圖2b為其菌落形態圖。菌落在pda培養基上恆溫28℃培養5d，直徑達3.00-4.00cm，菌落質地為絲絨狀至絮狀，緻密有同心環，邊緣白色；初生顏色呈灰綠色，老後顏色呈淡褐色；背面為乳白色或暗褐色，表面無滲出物。小分生孢子似青黴狀，呈疏鬆柱形或散亂。
2、真菌菌株的分子生物學鑑定
利用ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒提取純化的真菌的基因組dna。選用下列真菌通用引物對菌株itsi區進行pcr擴增測序：
上遊引物its1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，
下遊引物its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；
pcr擴增體系為25μl，其中2×takarataqtmhsperfectmix3.7μl，上下遊引物(20μmol·ml-1)各0.5μl，dna0.5μl，補充滅菌去離子水至25μl。反應條件為94℃4min預變性後進入循環，循環參數為94℃45s、55℃45s、72℃1min，30個循環後，72℃終延伸10min。取pcr產物5μl，在1%wt瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果見圖3，目的片段fj-01-bxg-08-itsi區大小約為542bp。pcr產物fj-01-bxg-08-itsi區經膠回收試劑盒純化後委託生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，並將序列信息經ncbi資料庫分析比對。
菌株its測序結果顯示，其序列大小為542bp，通過與ncbi（blast）中的數據進行同源性比較，該菌株與aspergillussydowii的序列相似率達99%以上，推斷該菌株是aspergillussydowii（聚多麴黴屬）。利用mega5.05軟體進行系統發育分析。採用鄰接法(neighbor-joining，nj)構建系統發育樹如圖4所示。
通過形態學和its鑑定結果表明該菌株是aspergillussydowii（聚多麴黴屬）中的一種。
實施例3菌株發酵液中酚酸測定
取發酵液100ml，用磷酸調節ph到4.00，後加入8g的nacl，溶解後溶液待用。取cleanertpep固相萃取小柱分別經蒸餾水-甲醇-蒸餾水(8ml-8ml-6ml)浸潤和淋洗活化，後去除甲醇殘餘備用。將已經處理過的發酵液加到已經活化的pep固相萃取小柱中，當發酵液都流完後，加入2ml的蒸餾水衝洗，再加入10ml的甲醇洗脫，並收集洗脫液後冷凍乾燥。用1ml的甲醇（色譜純）溶解後，用0.22μml濾膜過濾於上樣瓶中，即為發酵液上樣樣品。
分別取原兒茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、水楊酸、對羥基苯甲酸等7種酚酸作為標準物質（均購於阿拉丁公司），用甲醇（色譜純）配置成1mg/ml的母液備用。母液稀釋成7個濃度梯度的混合溶液作為標準曲線，標準曲線方程見表2。
表2酚酸物質的標準曲線方程
高效液相色譜的程序參照文獻鄭新宇等，略做調整，簡述為：高效液相色譜儀為日本島津（cbm-20a，lc-20ad，spd-20a），色譜柱為sunfiretw-c18(4.6mm×250mm,id5μm)；流動相:a-甲醇（色譜純）和b-0.1%磷酸溶液（分析純）；洗脫條件：0-5min，a：b=27:73，5-10mina：b=27:73，10-15mina：b=50:50，檢測波長為280nm；流速為1.6ml/min；進樣量10μl；柱溫為30℃。
測試溶液的譜圖與混合標樣譜圖對照，按保留時間確定物質，按標準曲線法計算各物質的相對含量；試驗結果如圖1所示，各物質含量如表3所示。
表3菌株fj-01-bxg-08的菌液酚酸含量分析
菌株fj-01-bxg-08菌液的hplc檢測結果見表2，菌液中含原兒茶酸0.078mg/l，含對羥基苯甲酸1.05mg/l，含香草酸4.19mg/l，含水楊酸28.17mg/l，含肉桂酸最高33.39mg/l。
實施例4菌株抑草潛力驗證-盆栽實驗
實驗室的培養箱中進行，溫度28℃，12h光照。取稻田土自然晾乾，碾碎後去除土中的碎石和雜物，過篩。稱取過篩後的細土500g置於塑料盆（直徑12cm，高6cm）中。將已催芽的小稗5粒播入土壤表層。對fj-01-bxg-08菌株在28℃，180rpm/min,培養7天的發酵液進行3個梯度稀釋，共4個處理。處理1：原液，處理2：稀釋5倍，處理3：稀釋20倍，處理4：稀釋50倍。分別將各梯度的30ml稀釋液澆於種子周圍。對照為蒸餾水。每個處理重複3次。每天用噴霧器添加20ml蒸餾水以保持土壤溼潤。種植5d後測定受體植株的根長和株高。
菌株發酵液對土培條件下的小稗的影響見表4，結果表明不同濃度梯度的菌株發酵液對小稗幼苗的生長是有影響的。對稗草株高的抑制率最高的達到56.53%。
表4發酵液對土培稗草的影響
菌株發酵液對土培條件下的小稗的影響見表4，結果表明不同濃度梯度的菌株發酵液均可抑制小稗幼苗的生長，其抑制率高於40%；可用於抑制雜草生長。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
sequencelisting
福建農林大學
一株從百香果根際土壤中篩選的具有強抑草作用真菌
3
3
patentinversion3.3
1
19
dna
上遊引物its1
1
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2
20
dna
下遊引物its4
2
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3
584
dna
fjfafu-bxg01-itsi區
3
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