極端耐旱齒肋赤蘚4個dreb轉錄因子及其編碼基因的製作方法

2023-05-08 16:05:36 1

極端耐旱齒肋赤蘚4個dreb轉錄因子及其編碼基因的製作方法
【專利摘要】本發明提供了極端耐旱齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子基因及其編碼基因，所述4個轉錄因子具有SEQIDNO:5-8所示的胺基酸序列，4個轉錄因子基因核苷酸序列如SEQIDNO:1-4所示，其基因編碼區長分別是ScDREB5-3為685bp，ScDREB5-6為681bp，ScDREB5-8為519bp，ScDREB5-10為1165bp；4個轉錄因子基因均為脫落酸依賴型，並且對乾旱、高鹽、低溫和高溫四種非生物脅迫有響應，但響應模式不盡相同。此外，轉化這4個轉錄因子基因的酵母菌在乾旱、高鹽、冷、熱脅迫下的存活率都高於對照非轉基因酵母菌，說明極端耐旱蘚類齒肋赤蘚4個DREB類轉錄因子基因ScDREB5-3，ScDREB5-6，ScDREB5-8，ScDREB5-10均具有非生物脅迫的抗性。本發明可以用於作物非生物脅迫轉基因育種研究。
【專利說明】極端耐旱齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種極端耐旱蘚類植物齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子及編碼基因，4個極端耐旱蘚類植物齒肋赤蘚DREB轉錄因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10及其編碼基因，利用該基因在提高酵母抗旱、高鹽、耐低溫及高溫脅迫等抗逆性方面的應用，屬於植物基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]DREB 轉錄因子(Dehydration Responsive Element Binding protein),即乾旱應答元件結合蛋白，屬於AP2/EREBP類基因家族，特異存在於植物中。DREB與抗逆基因啟動子區域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)順式作用兀件結合，其核心序TACCGACAT，啟動下遊一系列的有DRE順式作用元件的抗逆基因的表達，廣泛參與乾旱、高鹽，熱等脅迫應答反應，從而能從整體上提高植物的抗逆性。
[0003]自1994年Yamaguch1-Shinozaki從擬南芥中首次檢測到DRE作用的蛋白因子並命名為DREB1，到1997年Stockinger等首次從擬南芥cDNA文庫中克隆到AtCBFl以來，DREB / CBF轉錄因子基因的克隆一直是植物分子生物學的熱點。目前已從擬南芥、水稻、玉米、小麥、黑麥、大豆、西紅菜，棉花，蘆薈等幾十種植物中分離並鑑定出調控幹早、高鹽及低溫耐性的DREB基因，並利用這些基因得到了抗逆性增強的擬南芥、菸草、油菜、西紅柿、小麥等轉基因植株。從文獻報導來看，目前關於抗逆轉錄因子DREB的功能及轉錄調控的研究大部分來自模式植物擬南芥及經濟作物水稻，小麥等，而對自然界天然存在的抗逆能力極強的植物資源卻嘗試較少，以天然抗逆性強的野生植物資源為基因克隆材料將是一個有價值的嘗試。此外，目前有關DREB基因的研究多局限於草本植物領域，對於較為低等的苔蘚植物中DREB的研究很少，僅見於模式蘚類小立碗蘚中的一例報導(Liu等，2007)。
[0004]另外，以往服務於分子育種的DREB基`因的克隆和轉化研究主要是針對單個DREB基因，沒有比較和篩選，因此往往出現供轉化基因有限及轉化後轉基因效果不理想等問題。這也是目前大部分的轉基因研究費錢，費時，費力的主要原因所在。因此，要想避免下遊應用研究的盲目性，必須對上遊基因的克隆和篩選工作嚴加把關，挑選優質的(抗逆性增強且不影響生物量和產量)抗逆基因資源進行下一步的作物抗逆分子改良育種。以基因家族為比較研究單位，系統全面的克隆和分析特定基因家族，從眾多家族成員中篩選最有潛力的抗逆基因，有方向有重點的對一個或少數幾個優質基因進行轉化將是一條新的思路，能有效地解決一直以來對單個基因研究的局限性及用單個基因轉化農作物育種研究的盲目性的問題。
[0005]綜上，植物中還存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其從天然極端抗逆的荒漠苔蘚植物中克隆DREB基因並進行抗逆育種鮮見報導且頗具潛力(Xu等，2011)。同時，站在DREB基因家族的高度，通過比較與篩選進而克隆得到功能更為強大的基因元件用於作物的遺傳改良，避免的基因克隆的盲目性，具有更為準確、高效的意義，是一條值得嘗試的全新道路。[0006]齒肋赤蘚(SyntrichiaCaninervis,又名 Tortula Caninervis),隸屬叢蘚科赤蘚屬，為典型的旱生苔鮮植物，是構成古爾班通古特沙漠蘚類生物結皮的優勢種(張等，2006)。該蘚具有極強的綜合抗逆性，如抗旱，抗高溫，低溫等，是優良的開展抗逆研究的好材料。齒肋赤蘚自然乾燥狀態下呈灰黑色，似一層「殼」分布在沙漠表面，形成有重要生態意義的苔蘚生物結皮(Putzer等，2002), 一旦遇到降水,齒肋赤蘚即在30s內迅速通過再水化過程而「復原」呈鮮活的綠色，並開始執行光合作用，是典型的復甦植物代表。其迅速的復水過程及抗旱性、耐熱性等的分子調控機制已成為國內外相關科學的研究熱點。目前，本項目組還建立了齒肋赤蘚莖葉體脫水狀態(24h)以及復水0.5、6、12h的4個轉錄組以及相應的4個蛋白譜數據，為在基因家族高度研究抗逆相關基因，比較其功能，篩選最強的抗逆基因奠定基礎。
[0007]因此，在比較篩選基礎上，開展極端耐旱蘚類齒肋赤蘚抗旱相關DREB轉錄因子基因的克隆，對於深入理解該種的耐旱機理及開發利用抗逆基因資源，定向培育植物新品種均有重要價值。

【發明內容】

[0008]本發明的第一個目的在於為了解決目前可利用的DREB轉錄因子比較少的問題，提供極端耐旱蘚類植物齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5-10，其胺基酸序列由SEQ ID N0:5_8所示。
[0009]本發明的第二個目的在於提供編碼齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子編碼基因ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5_10 基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1-4 所 [0010]本發明的第三個目的在於，所述4個齒肋赤蘚ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10轉錄因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物脅迫生物品種中的應用。
[0011]本發明所述的一種極端耐旱齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子及編碼基因，該基因4個 DREB 轉錄因子為 ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8 和 ScDREB5_10，它們具有 SEQ IDNO:5-8所示的胺基酸序列為:
[0012]SEQ ID N0:5ScDREB5-3 胺基酸序列
[0013]MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAWCLRGSNAELNFPDSPPRWPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAV
[0014]SEQ ID N0:6ScDREB5-6 胺基酸序列
[0015]MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEMRAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVMLQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQMDEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYP
[0016]SEQ ID N0:7ScDREB5-8 胺基酸序列
[0017]MPGMAPSAWRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGA⑶ASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTffEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF
[0018]SEQ ID N0:8ScDREB5-10 胺基酸序列
【權利要求】
1.一種極端耐旱齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子及編碼基因，其特徵在於該基因4個DREB轉錄因子為 ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8 和 ScDREB5_10，它們具有 SEQ ID NO: 5-8 所示的胺基酸序列為: SEQ ID N0:5ScDREB5-3 胺基酸序列
MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAVVCLRGSNAELNFPDSPPRVVPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAVSEQ ID N0:6ScDREB5-6 胺基酸序列
MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEAARAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVAALQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQAADEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYPSEQ ID N0:7ScDREB5-8 胺基酸序列
MPGMAPSAffRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGAGDASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTffEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF SEQ ID N0:8ScDREB5-10 胺基酸序列
MAGEEAPSTLCRIWSAITPLMRFKNKIREHLWASSLLNDPDLHRETETASTLPEQHYYDASSQAFEAASPPAVTASFYDNP⑶LATQLQAMQRNAHAEPEVYMSLDDFPVELISQPISADSYHRSTSEPISEDSYDRSISEPISEDSYDRSMSQPISEDSYLRSMSQPIEEDFTSDGADDDQSSEMMDTGAESSDLRRESSAEEWQQIMFFRHFFGMDSTVPPVPGWTVVVGIVSVFKRITGLIRQRRQERAQNQVAVVPRPRRRRAVVVTRYKGIRPRNGKWVSEIRIGGTKEKVffLGSYNTEKEAALAFDAGKHHCSLLRRTRGFNFNDSPRFLGPPQRFEHLTSEKRRENIKRLAEEHALTYASADIR。
2.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於4個齒肋赤蘚轉錄因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5_8、ScDREB5_10的胺基酸序列，其中轉錄因子ScDREB5_3基因編碼224個胺基酸，ScDREB5-6基因編碼226個胺基酸，轉錄因子ScDREB5_8基因編碼172個胺基酸，ScDREB5-10基因編碼371個胺基酸。
3.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於4個基因核苷酸序列SEQID N0:l-4所示: SEQ ID N0:lScDREB5-3基因的核苷酸序列
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGT
TGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTG
AAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAG
GAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGC
GTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGT
ACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGG
CTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGC
GGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCG
CGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCA
CTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGT
CACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATT
CGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGAT
AATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGT
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於4個基因核苷酸序列SEQID NO: 1-4所示的基因編碼區長分別是ScDREB5-3為685bp，ScDREB5_6為681bp，ScDREB5_8為519bp，ScDREB5-10 為 1165bp。
5.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於將所示的核苷酸序列按常規方法進行酵母表達載體構建，酵母表達載體導入宿主，其中宿主為酵母菌株INVScl，得到具備抗逆能力的轉 ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5_10 基因的轉化體的功能測試。
6.根據權利要求1所述的極端耐旱蘚類植物齒肋赤蘚4個DREB轉錄因子及編碼基因在製備植物抗逆性育種和改良的用途。
【文檔編號】C07K14/415GK103755793SQ201410042554
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】張道遠, 李海燕, 李小雙 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所