一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法
2023-05-08 01:23:51
專利名稱：一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物代謝研究方法，具體涉及一種用模式生物斑馬魚快速研究藥 物代謝的新方法。
背景技術：
藥物代謝是研究藥物在機體作用下發生的化學結構轉化特點和規律的一門科學。 結構變化包括氧化、還原、分解、結合等方式。經過代謝，其藥理作用被減弱和消失。藥物代 謝研究對藥動學、藥效學、毒理學及其他生物醫學學科發展有重大影響。藥物代謝研究方法常包括體內實驗法和體外實驗法，體內實驗法動物給藥後，在 一定時間內將動物處死，取消化道各部分內容物進行分析，並檢查血液、尿、糞便、膽汁，檢 測代謝物的結構變化，研究藥物的代謝轉化，並推斷其在消化道內的代謝過程。體內代謝試 驗能客觀的反應藥物在體內的轉化，但一般藥物用量較大，不利於少量藥物的快速代謝研 究；有些體內成分含量低微，即使採用現代分析手段有時也難以滿足體內複雜體系的檢測 需求，而加大藥量或進一步富集、純化樣本等手段對結果的改善也是有限的；體內代謝勞動 強度相對較大，常需多人合作完成。體外實驗法體外肝細胞代謝和胃腸道菌群代謝。肝細 胞代謝取肝勻漿、肝細胞微粒體或細胞色素P450酶與藥物共孵育，檢查原型成分及其代 謝物的種類和含量，是研究肝臟對藥物代謝的有效體外方法。胃腸道菌群代謝糞便溫孵法 和離體消化道內容物溫孵法是研究藥物在消化道內代謝的方法。許多藥物成分是在消化道 菌叢作用下代謝的，特別是腸道內細菌的苷鍵水解酶或人的糞便孵液與藥物在厭氧條件下 溫孵，檢查原型成分及其代謝物的種類和含量，是研究腸內菌對藥物代謝的有效方法。體外 實驗法雖然較有效的模擬了藥物在體內代謝的不同環節，有益於富增、製備代謝產物，但脫 離了完整的代謝體系對藥物的作用，難以體現在體代謝的綜合結果；體外實驗條件要求相 對較高，一般實驗室難以進行。因此，建立一種既能體現在體代謝的綜合效應，又能實現條 件簡單，低勞動強度，化合物用量少的高通量代謝研究方法具有重要意義。斑馬魚是一種極好的模式生物，是取代青蛙、果蠅、小白鼠等作為研究對象的優良 試驗模式魚。斑馬魚餵養和維持的費用更便宜，所需空間場地不大，易於室內大規模繁殖。 成體魚長3 4cm，養殖成本僅為養小鼠的0. 1%-1%。斑馬魚同人類基因的相似度與小鼠 相當，且在蛋白質水平上，其關鍵部位的同源性幾乎是100%，所以可用斑馬魚模擬人類疾 病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol，4，504-12 (2004)]。目前，人們已成功的用斑馬魚 建立許多人類疾病模型，如神經系統、循環系統、聽覺、視覺、癌症等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT :TARGETS，3，89-96 (2004).]。如中國專利 200810019040. 5 公開了一種用 斑馬魚研究藥物毒性的方法，專利200780051025. 2公開了一種通過幹細胞營養進行的器 官的形成和以及酒精損傷器官的再生方法，200310108710. 8公開了利用斑馬魚基因治療 截癱等疾病。並且斑馬魚具有藥物代謝的P450s相關酶系目前已克隆到的斑馬魚P450s 基因主要包括CyplA、Cyp2K6、Cyp3a65 和 Cyp3Cl、CyplIal、Cyp 19, Cyp26Al、Cyp26Bl 和 Cyp26Dl幾個家族的成員，它們與人類相應基因的同源性約為40% 73% [P. Collodi,C. L. Miranda, X. Zhao, D. R. Buhler, D. W. Barnes. Xenobiotica, 24 (6)，487-493 (1994) ]。 ■ 馬魚具有完整的代謝器官系統和代謝酶系，以及與哺乳動物相似的系統及基因，為研究人 類許多常見疾病的發病機制提供了理想的實驗模型，同時也為藥物的作用機制、安全性評 價及代謝研究提供了理想的實驗模型。因此可將它作為具有完整代謝體系的理想模式生物 用於藥物的代謝研究。國內在這方面的研究尚屬空白。
發明內容
發明目的本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種操作方 便、成本低、化合物用量少、勞動強度低，且僅需在一般實驗室就可進行的快速模式生物斑 馬魚研究藥物代謝的新方法。技術方案為了實現以上目的，本發明採取的技術方案為一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，它包括以下步驟(1)取斑馬魚的成體魚放入盛有水的容器裡，分為空白溶液組，空白魚組、空白藥 物組和藥物魚組，空白溶液組和藥物魚組斑馬魚數量相等，將受試藥物配成所需濃度，加入 到藥物魚組的水溶液中，空白對照組加入等量的溶媒，空白魚組只加等量溶媒不放斑馬魚、 空白藥物組加溶媒溶解的等量藥物不放斑馬魚，在藥物魚組的斑馬魚暴露於藥液後Oh 24h內不同時間點將魚取出，用純淨水迅速洗滌2 3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重， 於-70°C冰箱放置，並取各時間點魚藥液，於-70°C冰箱放置，空白溶液組，空白魚組和空白 藥物組於Oh和24h時同法取樣，備用；(2)取步驟⑴得到的各時間點魚藥液冷凍乾燥，殘渣加適量溶劑溶解，過 0. 45 μ m或0. 22 μ m濾膜或15000轉/min離心，取濾液或上清液進行高效液相色譜HPLC分 析或高效液相色譜與質譜聯用LC-MS分析；取各時間點斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿 液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心後直接用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合併萃 取液，過0. 45 μ m或0. 22 μ m濾膜或約15000轉/min離心，濾液或上清液進行HPLC分析或 LC-MS分析。作為優選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其中步驟 (1)中的空白溶液組，空白魚組、空白藥物組和藥物魚組均平行設3個組，保證實驗的科學 性。作為優選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，步驟(1) 中藥物魚組的斑馬魚暴露於藥液後0h，lh, 2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時間點將魚取出，取 魚體，並在這些時間點取魚藥液。採用連續時間間隔點取樣可以充分明確藥物的代謝方式 和代謝特點，為指導藥物的臨床用藥和藥物劑型的選擇提供科學依據。作為優選方案，其中步驟(1)所述的溶媒為水或者是含有0 二甲基亞碸助溶 劑的水溶液。對於水溶性較差的藥物，採用二甲基亞碸助溶，可以有效提高藥物的水溶性， 使藥物均勻分散於水溶中。作為優選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，步驟(2) 根據被分析藥物的性質，根據相似相溶原則選擇溶劑溶解或萃取受試藥物，如藥液殘渣加 甲醇溶解，斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心後直接 用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合併萃取液，氮氣吹乾，殘渣加溶劑溶解。
本發明考察了將藥液減壓回收至幹及直接冷凍乾燥兩種方法，結果表明將藥液直 接凍幹可最大限度的減少樣品處理過程的損失及誤差，實驗結果更準確，因此步驟(2)將 各時間點魚藥液冷凍乾燥，然後過濾或離心處理後上高效液相色譜HPLC分析或高效液相 色譜與質譜聯用LC-MS分析。本發明所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，作為優選方案，其中步 驟(2)採用Agilent 1100型系列高效液相色譜儀或採用靈敏度高的Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效液相色譜-質譜聯用儀來測定斑馬魚水溶液中藥物和斑馬魚體內組織 中藥物的含量和結構的變化情況，具有靈敏度高，檢測限低的優點。作為優選方案，本發明所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，篩選的 受試藥物可為化學藥品、中藥及其提取物、中藥複方及其提取物、天然藥物，或它們的組合 物，作為進一步的優選方案，所述的受試藥物為丹參酮類化合物、丹參藥材或含有丹參的中 藥複方、中成藥等。丹參為一種良好的心血管用藥，具有活血調經，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養 血安神功效，主治月經不調，經閉痛經，症瘕積聚，胸腹刺痛，熱痺疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不 眠；肝脾腫大，心絞痛，臨床在心血管用藥上非常廣泛，含有中藥丹參的中藥複方藥物多達 上百種，丹參中起藥效的物質主要有菲醌類的隱丹參酮、丹參酮IIA或丹參酮I，這些活性 成分是丹參起藥效的物質基礎，因此研究隱丹參酮、丹參酮IIA或丹參酮I的代謝情況可以 有效了解丹參或是含有丹參中藥複方等藥物的體內代謝情況。與小鼠、大鼠、犬等哺乳動物不同，斑馬魚的體積較小，口服或注射給藥方式很困 難，因此，步驟(1)中本發明將受試藥物溶解於斑馬魚所生活的水中，斑馬魚會自主連續的 從溶液中吸收受試藥物並在體內進行代謝，藥物的代謝物也會隨著斑馬魚的排洩物被連續 的排到水中，這樣就可通過分析溶液中藥液的成分變化來掌握藥物的部分代謝信息；斑馬 魚成體魚長約3 4cm，其體內血液量極微量，難以實現採血，通過取血來分析血樣的可行 性存在問題，而對整體魚內成分進行分析也能掌握藥物在魚體內的變化情況，這樣，就能通 過定時取樣分析藥物在斑馬魚體內及體外的變化規律來較為全面的探索斑馬魚對藥物的 代謝情況，此法簡單可行。有益效果本發明提供的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法和現有技術相 比具有以下優點本發明提供的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，選用斑馬魚作為藥物代 謝研究的對象，通過優化的實驗分組方法，保證實驗結果的準確性，尤其是對藥物給藥方式 的優選、藥物經斑馬魚代謝後提取方法和分析方法的優選，整個實驗方法可操作性強，能客 觀的反應藥物在體內的真實代謝情況，實驗結果準確度高，能克服一般體外代謝實驗難以 體現在體代謝綜合結果的缺點，且能克服一般體內代謝實驗所用藥量大、勞動強度大的缺 點，且實驗方法可重複性強，尤其是所需受試藥物量少，成本低，勞動強度低，應用範圍廣 泛，且可成批量進行實驗研究，工作效率高。
圖1隱丹參酮藥液Oh時隱丹參酮提取離子流2隱丹參酮質譜圖
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圖3隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後中隱丹參酮提取離子流4隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內隱丹參酮提取離子流5隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內隱丹參酮質譜6隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後脫氫產物丹參酮IIA提取離子流7隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內脫氫產物丹參酮IIA提取離子 流8隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內脫氫產物丹參酮IIA質譜9隱丹參酮藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內脫氫產物丹參酮IIA的羥基化 產物質譜10隱丹參酮藥液經斑馬魚作用18h後隱丹參酮的羥基化產物離子流11丹參酮IIA藥液Oh時丹參酮IIA提取離子流12丹參酮IIA質譜13丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後中丹參酮IIA提取離子流14丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內丹參酮IIA提取離子流15丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後斑馬魚體內丹參酮IIA質譜16丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後丹參酮IIA羥基化產物離子流17丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後丹參酮IIA羥基化產物質譜18丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用18h後斑馬魚體內丹參酮IIA羥基化產物質 譜19丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用24h後羥基化丹參酮IIA脫氫產物離子流20丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用18h後斑馬魚體內羥基化丹參酮IIA脫氫產 物離子流21丹參酮IIA藥液經斑馬魚作用18h後斑馬魚體內羥基化丹參酮IIA脫氫產 物質譜22丹參酮I藥液Oh時丹參酮IIA提取離子流23丹參酮I質譜24丹參酮I藥液經斑馬魚作用24h後中丹參酮I提取離子流25丹參酮I藥液經斑馬魚作用18h後斑馬魚體內丹參酮I提取離子流26丹參酮I藥液經斑馬魚作用18h後斑馬魚體內丹參酮I質譜圖
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例一用模式生物斑馬魚研究丹參中隱丹參酮的代謝1.材料與儀器受試藥物丹參中隱丹參酮化合物配製方法稱取相當於隱丹參酮1 2mg溶於IOml 二甲亞碸(DMSO)中，加IOOOml 樂百氏純淨水，搖勻。
動物斑馬魚，由南京大學模式生物研究所提供。試劑乙腈、甲酸為色譜純(德國，Merck公司)，二甲基亞碸(DMS0，國藥集團化學 試劑有限公司)，超純水樂百氏純淨水。儀器Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1313A 自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器；Chemstation 6. 01色譜工作站(美國， Agilent公司)。Waters Alliance 2695-ZQ 2000液相色譜-質譜聯用儀，包括雙高壓泵， 自動進樣器，柱溫箱，電噴霧離子化接口，2695型液相色譜儀，Masslynx 4. 0色譜工作站 (美國，Waters 公司)。METTLER TOLEDO AB135-S 分析天平(瑞士，METTLERT0LED0 公司)， KQ3200DE型數控超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)。LABC0NC0冷凍乾燥機(美 國，LABC0NC0公司)，TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。2.實驗方法2. 1給藥與取樣方法取斑馬魚，分別置於含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12組，每組5條魚。其中 1組為1 % DMSO純淨水(空白魚組)，其它為隱丹參酮10Z0 DMSO純淨水溶液(藥物魚組)。 同時設空白溶液組(1 % DMSO純淨水)和空白藥物組(1 % DMSO隱丹參酮純淨水溶液)。藥 物魚組分別於斑馬魚暴露藥液後0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時間點將魚取出，用純 淨水迅速洗滌3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，於_70°C冰箱放置。並取各時間點魚藥液 SmL (各3份)，分別混合，於-70°C冰箱放置。空白溶液組，空白魚組和空白藥物組於0h，24h 時同法取樣。2. 2樣品處理藥液處理將不同時間點魚藥液各8mL，冷凍乾燥，殘渣加ImL甲醇溶解，過 0. 22 μ m濾膜，濾液進樣20 μ L進行HPLC-MS分析。斑馬魚體處理取各時間點斑馬魚平行組間混合，剪碎，稱取lg，加5mL生理鹽水 勻漿，3500r/min離心lOmin，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，氮氣吹乾，殘 渣加ImL甲醇溶解製成Ig魚/mL的溶液，過0. 22 μ m濾膜，濾液進樣20 μ L進行HPLC-MS 分析。2. 3分析條件液相條件色譜柱ZorbaxExtend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m, Agilent)和 C18 預 柱(4.6X12. 5mm ID,5ym)；柱溫25°C ；流動相A為樂百氏純淨水(與質譜聯用時改為 0. 05%甲酸水)，B為乙腈，A + B= 100%，採用梯度洗脫0 5min，45% B，5 lOmin， 45 50% B, 10 30min，50 90% B，30 35min，90 100% B ；流速1. OmL/min ；檢測 波長270nm ；記錄時間35min ；進樣量為20 μ L。質譜條件毛細管電壓2. 50kV,錐孔電壓30V，乾燥氣流速350L/h，離子源溫 度120°C，輔助氣溫度350°C ；離子檢測方式全掃描檢測(SCAN)，離子極性正離子 (positive)，離子化方式氣動輔助電噴霧離子化(ESI)，掃描範圍100-800m/z。3.實驗結果採用HPLC-MS法檢測丹參中隱丹參酮經斑馬魚作用後的代謝產物。發現24h內斑 馬魚藥液中隱丹參酮或斑馬魚體內中的隱丹參酮發生羥基化、脫氫代謝產物(具體實驗結 果見表1)。結果與已有隱丹參酮代謝研究文獻報導一致丹參中隱丹參酮在動物體內的代謝途徑主要為脫氫和羥基化，基中脫氫產物丹參酮IIA是隱丹參酮的主要代謝產物，[Sim JH, Yang M，Han J，Wang BR, Ma XC, Xu M，Liu P，Guo DA. Rapid Commun Mass Spectrom， 21 (14) ,2211-2226 (2007)]，表明採用本發明提供的用模式生物斑馬魚研究中藥丹參代謝 實驗結果準確可靠，實驗方法可行。且實驗檢測結果表明，斑馬魚藥液中隱丹參酮或斑馬魚 體內中的隱丹參酮在4h始能檢測到代謝產物丹參酮IIA，可為臨床劑型和臨床用藥提供科 學依據。如將丹參酮類化合物製備成口服或靜脈注射給藥製劑提供參考依據。表1丹參中隱丹參酮經斑馬魚作用後的代謝產物鑑定
保留代謝產物時間 tR(mi η)分子量 MW[Μ+Η}+[M+Na}+代謝途徑魚外 藥液魚體 內鑑定 方式質譜圖隱丹參酮22.32296297.31319.30原型成分++對照如圖1-5
品 對照丹參酮IIA27.6294295.23317.22隱丹參酮 脫氫++對照 品 對照如圖6-8丹參酮IIA 羥基化產物11.203310311.30333.23丹參酮IIA 羥基化+文獻 對照如圖9隱丹參酮 羥基化產物14.76312313隱丹參酮 羥基化+文獻 對照如圖10隱丹參酮 羥基化產物26.22312313隱丹參酮 羥基化+文獻 對照如圖10隱丹參酮 羥基化產物37.08312313隱丹參酮 羥基化+文獻 對照如圖10實施例二用模式生物斑馬魚研究丹參中丹參酮IIA的代謝1.材料與儀器受試藥物丹參中丹參酮IIA化合物配製方法稱取相當於丹參酮IIA 1 2mg溶於IOml 二甲亞碸(DMSO)中，加 IOOOml樂百氏純淨水，搖勻。動物、試劑、儀器同實施例一。2.實驗方法2. 1給藥與取樣方法取斑馬魚，分別置於含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12組，每組5條魚。其中 1組為DMSO純淨水(空白魚組)，其它為丹參中丹參酮IIA 1% DMSO純淨水溶液(藥 物魚組)。同時設空白溶液組(1 % DMSO純淨水)和空白藥物組(1 % DMSO丹參酮IIA純淨 水溶液)。藥物魚組分別於斑馬魚暴露藥液後0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時間點將 魚取出，用純淨水迅速洗滌3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，於_70°C冰箱放置。並取各時 間點魚藥液8mL(各3份)，混合，-70°C冰箱放置。空白溶液組，空白魚組和空白藥物組於0h，24h時同法取樣。2. 2樣品處理藥液處理將不同時間點魚藥液各8mL，冷凍乾燥，殘渣加ImL甲醇溶解，過 0. 45 μ m濾膜，濾液進樣20 μ L進行HPLC-MS分析。斑馬魚體處理取各時間點斑馬魚平行組間混合，剪碎，稱取lg，加5mL生理鹽水 勻漿，3500r/min離心lOmin，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，氮氣吹乾，殘 渣加ImL甲醇溶解製成Ig魚/mL的溶液，過0. 45 μ m濾膜，濾液進樣20 μ L進行HPLC-MS 分析。2. 3分析條件同實施例一。3.實驗結果採用HPLC-MS法檢測丹參中丹參酮IIA經斑馬魚作用後的代謝產物。發現24h內 斑馬魚藥液中丹參酮IIA或斑馬魚體內中的丹參酮IIA的羥基化、脫氫代謝產物(具體實 驗結果見表2)。結果與已有丹參酮IIA代謝研究文獻報導一致丹參酮IIA在動物體內的 代謝途徑主要為羥基化和脫氫[Sun JH, Yang Μ, Han J, Wang BR, Ma XC, Xu M，Liu P，Guo DA. RapidCommun Mass Spectrom，21(14)，2211—2226(2007) ；Li P,Wang GJ,Li J,Hao HP, and Zheng CN. J. of Mass Spectrom,41(5),670-684(2006) ；Li P,Wang GJ,Li J, Hao HP, Zheng CN. Chromatogr. A, 1104 (1-2)，366-369 (2006)]。進一步表明本發明提供的用模式生 物斑馬魚研究中藥丹參中丹參酮類化合物代謝實驗結果準確可靠。且實驗檢測結果表明， 斑馬魚藥液中丹參酮IIA或斑馬魚體內中的丹參酮IIA在12h始能檢測到羥基化產物代謝 產物，可為臨床劑型和臨床用藥提供科學依據。如將丹參酮類化合物製備成口服或靜脈注 射給藥製劑提供參考依據。表2丹參酮IIA經斑馬魚作用後的代謝產物鑑定
權利要求
一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)取斑馬魚的成體魚放入盛有水的容器裡，分為空白溶液組，空白魚組、空白藥物組和藥物魚組，空白溶液組和藥物魚組斑馬魚數量相等，將受試藥物配成所需濃度，加入到藥物魚組的水溶液中，空白對照組加入等量的溶媒，空白魚組只加等量溶媒不放斑馬魚、空白藥物組加溶媒溶解的等量藥物不放斑馬魚，在藥物魚組的斑馬魚暴露於藥液後0h～24h內不同時間點將魚取出，用純淨水迅速洗滌2～3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，於 70℃冰箱放置，並取各時間點魚藥液，於 70℃冰箱放置，空白溶液組，空白魚組和空白藥物組於0h和24h時同法取樣，備用；(2)取步驟(1)得到的各時間點魚藥液冷凍乾燥，殘渣加適量溶劑溶解，過0.45μm或0.22μm濾膜或15000轉/min離心，取濾液或上清液進行高效液相色譜HPLC分析或高效液相色譜與質譜聯用LC MS分析；取各時間點斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心後直接用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合併萃取液，氮氣吹乾，殘渣加溶劑溶解，過0.45μm或0.22μm濾膜或約15000轉/min離心，濾液或上清液進行HPLC分析或LC MS分析。
2.根據權利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，步驟(1)中藥物魚組的斑馬魚暴露於藥液後0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時間點將魚取出，並取魚藥液。
3.根據權利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，步 驟(1)所述的溶媒為水或者是含有0 二甲基亞碸助溶劑的水溶液。
4.根據權利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，步 驟(2)根據被分析藥物的性質選擇溶劑溶解或萃取。
5.根據權利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，步 驟(2)採用Agilent 1100型系列高效液相色譜儀或Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效 液相色譜-質譜聯用儀。
6.根據權利要求1至5任一項所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特 徵在於，所述的受試藥物為化學藥品、中藥、中藥複方、天然藥物或它們的組合物。
7.根據權利要求6所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特徵在於，所 述的受試藥物為丹參酮類化合物、丹參藥材或含有丹參的中藥複方、中成藥。
全文摘要
本發明公開了一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，該方法通過選用斑馬魚作為藥物代謝研究的對象，通過優化的實驗分組方法進行實驗分組設計，採用優選的藥物給藥方式進行給藥，並採用優選的方法提取經斑馬魚代謝後的藥物代謝物，並採用優選的分析方法對代謝物進行分析，整個實驗方法可操作性強，能客觀的反應藥物在體內的真實代謝情況，實驗結果準確度高，能克服一般體外代謝實驗難以體現在體代謝綜合結果的缺點和一般體內代謝實驗所用藥量大、勞動強度高的缺點，實驗方法可重複性強，所需受試藥物量少，成本低，勞動強度低，應用範圍廣泛，且可成批量進行實驗研究，工作效率高。
文檔編號A61P25/20GK101957346SQ201010258459
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者彭蘊茹, 李萍, 賈曉斌, 聞曉東, 陳君, 韋英傑, 齊煉文 申請人:江蘇省中醫藥研究院;中國藥科大學