用乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛藥的hplc特徵圖譜的構建方法
2023-05-08 10:10:16
用乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛藥的hplc特徵圖譜的構建方法
【專利摘要】本發明涉及用乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛藥的HPLC特徵圖譜的構建方法，包括供試品溶液的製備，對照品溶液的製備，藥材溶液的製備，陰性對照品溶液的製備，色譜條件限定，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液各20μl注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得HPLC特徵圖譜。本發明的積極效果是：在同一色譜條件下同時檢測兩味藥材化學成分，從指紋圖譜的相似度判斷批量之間的質量一致性。還可追根溯源，尋找工藝操作中的問題。指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大於0.9，能有效的反映成品批與批之間的質量，有利於全面監控產品的質量。避免了質量控制的單一性和片面性。並具有方便、快捷、穩定、精密、重現性好等特點。
【專利說明】用乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛藥的HPLC特徵圖譜的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種治療風溼痺痛製劑的質量控制方法。
【背景技術】
[0002]中藥特徵圖譜能全面、綜合的反映所含成分的相對關係，較好的體現中藥成分的複雜性和相關性，具有特徵明顯、專屬性強、重現性好等特點，隨著中醫中藥的推廣應用，特徵圖譜作為中草藥及其提取物質量控制方法，目前已成為被國內外廣泛接受的一種對中藥質量進行評價的技術。
[0003]此前，用雞血藤、穿山龍、乾薑製成的治療風溼痺痛藥(商品名稱:骨骼風痛片)的質量檢測方法，多採用標準號:WS-10720 (2D-0720)-2002-2007中給出的方法，即採用薄層色譜法對乾薑、穿山龍進行鑑別，含量測定採用高效液相色譜法對穿山龍薯蕷皂苷進行含量測定。中國專利CN1857705A中公開了一種骨骼風痛製劑的質量檢測方法，包括採用薄層色譜法對乾薑、雞血藤、穿山龍進行鑑別，採用重量法對總皂苷進行含量測定。前述檢測方法存在的不足之處有:
[0004]1、在專利CN1857705A中，含量測定方法採用重量法對水溶性總皂苷的含量進行測定，沒有對其中多味藥材的主要化學成分進行全面、系統的檢測。
[0005]2、現行標準的質量檢測方法不能全面的監控原料藥材、中間體、成品的質量。
[0006]綜上所述，現有技術中對骨骼風痛製劑的檢測方法存在方法繁瑣、不能快速、全面的對骨骼風痛製劑進行檢測和鑑定等缺陷。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種用雞血藤、穿山龍、乾薑製成的治療風溼痺痛藥的HPLC特徵圖譜的構建方法，克服現有的檢測方法存在的前述不足。
[0008]本發明的HPLC特徵圖譜的構建方法包括:
[0009]1、供試品溶液的製備:取骨骼風痛製劑10g，精密稱定，加水50?100ml，充分攪拌，靜止I?3小時後，離心，取上清液過濾，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合併乙酸乙酯液，80°C水浴蒸乾，殘渣加水20ml使溶解，用環己烷振搖提取3次，每次20ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，用甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0010]2、對照品溶液的製備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg置25ml量瓶中，用甲醇溶解並定容至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0011]3、藥材溶液的製備:分別取雞血藤藥材、乾薑藥材各10g，粉碎，分別加水20?30ml，精密稱定重量，超聲提取20?30分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環己烷振搖提取3次，每次30ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。[0012]4、陰性對照品溶液的製備:按照骨骼風痛片的工藝，分別製備缺少雞血藤藥材、乾薑藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、乾薑陰性樣品各10g，按供試品溶液製備方法製備，即得。
[0013]5、色譜條件:色譜柱GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX250mm);流動相為乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液的混合物，其中乙腈佔流動相體積的30-35%，等度洗脫；檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。
[0014]6、測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照溶液各20μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到用雞血藤、穿山龍、乾薑製成的治療風溼痺痛藥(骨骼風痛製劑)的HPLC特徵圖譜。
[0015]本發明的HPLC特徵圖譜的最佳構建方法如下:(以下技術方案中所記載的各物質的用量或用量範圍，旨在表明各物質間的用量比例關係，並不限定在記載的具體數量上。)
[0016]1、供試品溶液的製備:取骨骼風痛製劑10g，精密稱定，加水100ml，充分攪拌，靜置2小時後，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合併乙酸乙酯液，80°C水浴蒸乾，殘渣加水20ml使溶解，用環己烷振搖提取3次，每次20ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，用甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0017]2、對照品溶液的製備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液作為對照品溶液。
[0018]3、藥材溶液的製備:分別取雞血藤藥材、乾薑藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環己烷振搖提取3次，每次30ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0019]4、陰性對照品溶液的製備:按照骨骼風痛片的工藝，分別製備缺少雞血藤藥材、乾薑藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、乾薑陰性樣品各10g，按供試品溶液製備方法製備，即得。
[0020]5、色譜條件:色譜柱GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液混合物，其中乙腈含量佔流動相體積的32% ;檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。
[0021]6、測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液各20μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到得到用雞血藤、穿山龍、乾薑製成的治療風溼痺痛藥(骨骼風痛製劑)的HPLC特徵圖譜。
[0022]其中供試品指紋圖譜採用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004Α版》進行評價，供試品批與批間的相似度均大於0.90。
[0023]其中所述骨骼風痛製劑的HPLC特徵圖譜中共有12個特徵共有峰，其中歸屬於雞血藤的特徵圖譜具有3個特徵共有峰:3號峰、7號峰、10號峰；歸屬於乾薑的特徵圖譜具有6個特徵共有峰:1號峰、2號峰、8號峰、9號峰、11號峰、12號峰。
[0024]前述的骨骼風痛製劑的HPLC特徵圖譜的構建方法，在280nm波長檢測下利用各標準品對主要峰進行比較確定；7號峰為芒柄花素、12號峰為6-姜酚。
[0025]與現有技術相比，本發明有益效果如下:[0026]該方法採用高效液相色譜法，在同一色譜條件下同時檢測複方中的兩味藥材化學成分，從指紋圖譜的相似度判斷骨骼風痛製劑批與批之間的質量一致性。還可依據成品、半成品、原料藥材的特徵圖譜變化來追根溯源，尋找工藝操作中的問題。
[0027](I)用本發明所提供的方法構建的骨骼風痛製劑指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大於0.9，能有效的反映成品批與批之間的質量，有利於全面監控產品的質量。
[0028](2)本發明採用高效液相色譜法，在同一色譜條件下同時檢測複方中的兩味藥材成分，對有效成分既能定性又能定量，並通過骨骼風痛製劑的特徵圖譜，獲得原料與成品之間的相關性，避免了骨骼風痛製劑質量控制的單一性和片面性。
[0029](3)本發明具有方便、快捷、穩定、精密度高、重現性好等特點，可準確可靠的控制骨骼風痛製劑的質量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是骨骼風痛片的指紋圖譜
[0031]圖2是骨骼風痛片的對照圖譜(採用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》選擇中位數法生成)
[0032]圖3是骨骼風痛片中雞血藤藥材特徵峰歸屬圖譜
[0033]圖4是骨骼風痛片中乾薑藥材特徵峰歸屬圖譜
【具體實施方式】
[0034]實施例1:骨骼風痛片特徵圖譜方法的建立。
[0035]I儀器:HITACHI高效液相色譜儀，紫外檢測器；Mettler AE240十萬分之一分析天平(上海梅特勒-託利多儀器有限公司)；AB204-E電子天平(上海梅特勒-託利多儀器有限公司)等。
[0036]2試劑與試藥
[0037]2.1試劑:乙酸乙酯、環己烷、磷酸、甲醇等為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。
[0038]2.2試藥:芒柄花素對照品、6-姜酚對照品。骨骼風痛片(批號:20120901、20120902、20120903、20120904、20120905、20121001、20121002、20121003、20121004、20121005)由修正藥業集團通藥製藥股份有限公司提供。
[0039]3方法與結果
[0040]3.1 色譜條件:色譜柱 GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(32:68);檢測波長:280nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min。
[0041]3.2溶液的製備
[0042]3.2.1供試品溶液的製備:取骨骼風痛片10g，精密稱定，加水100ml，充分攪拌，靜置2小時後，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合併乙酸乙酯液，80°C水浴蒸乾，殘渣加水20ml使溶解，用環己烷振搖提取3次，每次20ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，用甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0043]3.2.2對照品溶液的製備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液作為對照品溶液。
[0044]3.2.3藥材溶液的製備:分別取雞血藤藥材、乾薑藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環己烷振搖提取3次，每次30ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0045]3.2.4陰性對照品溶液的製備:按照骨骼風痛片的工藝，分別製備缺少雞血藤藥材、乾薑藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、乾薑陰性樣品各10g，按供試品溶液製備方法製備，即得。
[0046]3.3 色譜條件:色譜柱 GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(32:68);檢測波長:280nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min。
[0047]3.4測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液20 μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到骨骼風痛製劑的特徵圖譜。
[0048]3.5指紋圖譜的建立
[0049]採用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004Α版》對10批骨骼風痛片進行相似度評價，見圖1。選擇中位數法生成對照圖譜，見圖2。結果表明，10批供試品指紋圖譜與生成的對照圖譜(S)的相似度均大於0.90。相似度比較結果見表1。
[0050]表1骨骼風痛片相似度比較結果
[0051]
【權利要求】
1.用乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛藥的HPLC特徵圖譜的構建方法，其特徵是包括下述步驟: (1)供試品溶液的製備:取骨骼風痛製劑10g，精密稱定，加水50~100ml，充分攪拌，靜止I~3小時後，離心，取上清液過濾，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合併乙酸乙酯液，80°C水浴蒸乾，殘渣加水20ml使溶解，用環己烷振搖提取3次，每次20ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，用甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得； (2)對照品溶液的製備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg置25ml量瓶中，用甲醇溶解並定容至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得； (3)藥材溶液的製備:分別取雞血藤藥材、乾薑藥材各10g，粉碎，分別加水20~30ml，精密稱定重量，超聲提取20~30分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環己烷振搖提取3次，每次30ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得； (4)陰性對照品溶液的製備:按照骨骼風痛片的工藝，分別製備缺少雞血藤藥材、乾薑藥材的陰性樣品，分別取雞血藤陰性樣品、乾薑陰性樣品各10g，按供試品溶液製備方法製備，即得； (5)色譜條件:色譜柱GraceSmartRP18 (5 μ m, 4.6mmX250mm);流動相為乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液的混合物，其中乙腈佔流動相體積的30~35%:，等度洗脫；檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。 (6)測定:分別精密吸取步驟(1)所得的供試品溶液和步驟(2)所得的對照品溶液、步驟(3)所得的藥材溶液、步驟(4)所得的陰性對照溶液各20μ I注入步驟(5)所限條件的液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得HPLC特徵圖譜。
2.根據權利要求1所述的由乾薑、穿山龍、雞血藤製成的治療風溼痺痛製劑的HPLC特徵圖譜的構建方法，其特徵是: (1)供試品溶液的製備:取骨骼風痛製劑10g，精密稱定，加水100ml，充分攪拌，靜置2小時後，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合併乙酸乙酯液，80°C水浴蒸乾，殘渣加水20ml使溶解，用環己烷振搖提取3次，每次20ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，用甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得； (2)對照品溶液的製備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液作為對照品溶液； (3)藥材溶液的製備:分別取雞血藤藥材、乾薑藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環己烷振搖提取3次，每次30ml，合併環己烷液，80°C水浴蒸乾，甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得； (4)陰性對照品溶液的製備:按照骨骼風痛片的工藝，分別製備缺少雞血藤藥材、乾薑藥材的陰性樣品，分別取雞血藤陰性樣品、乾薑陰性樣品各10g，按供試品溶液製備方法製備，即得； (5)色譜條件:色譜柱GraceSmartRP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈和濃度為.0.1%的磷酸水溶液的混合物,其中乙腈佔流動相體積的32%:;檢測波長:280nm ;柱溫40°C;流速 0.8ml/min ； (6)測定:分別精密吸取步驟(1)所得的供試品溶液和步驟(2)所得的對照品溶液、步驟(3)所得的藥材溶液、步驟(4)所得的陰性對照溶液各20μ I注入步驟(5)所限條件的液相色譜儀，照高效液相色譜法`測定，得HPLC特徵圖譜。
【文檔編號】G01N30/02GK103675146SQ201310699362
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】徐雲, 徐建, 白冰, 付成國, 王婷婷, 徐國強, 任晶, 趙俞 申請人:吉林修正藥業新藥開發有限公司