一種基因傳遞系統的三維納米支架及其製備與應用的製作方法

2023-05-08 12:07:51 2

專利名稱：一種基因傳遞系統的三維納米支架及其製備與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及三維非病毒基因傳遞系統，具體地說，涉及三維納米支架、種子細胞的 培養及其基因轉染。
背景技術：
基於組織工程三維支架的非病毒基因傳遞系統(3 dimensional scaffolds genedelivery system, 3DS-GDS)已經成為非病毒型⑶S研究的又一重要方向。種子細胞， 三維支架及生長因子是組織工程研究的三大要素，三維支架和生長因子構成細胞賴以生存 的微環境。細胞培養過程中，生長因子往往直接加入培養液中，由於生長因子半衰期短，易 被稀釋和降解，這種「外加法」需要反覆大劑量給藥，繁瑣且價格非常昂貴。通過轉基因技 術將生長因子基因導入種子細胞後，可使細胞自身表達生長因子，這種「內加法」無疑是有 利於組織的修復與再生。傳統的基因傳遞技術，無論是病毒型還是非病毒型，一般只是瞬時 轉染，難以實現生長因子持續高效的表達。為此，人們嘗試在三維支架中包嵌DNA，以便基 因隨著支架的逐步降解緩慢釋放，持續轉染細胞(參見StorrieH，Mooney DJ. Sustained delivery of plasmid DNA from polymeric scaffolds fortissue engineering. Adc Drug Deliv Rev. ,2006,58 (4) 500~514 ；Tabata Y.Regenrative inductive therapy based on DDS technology of protein and gene. JDrug Target,2006,14(7) :483_495)。 目前可用於基因緩釋的支架材料有(參見CaptioRM，Sepctor Μ. Collagen scaffolds for nonviral IGF-I gene delivery in articularcartiIage tissue engineering[J]. Gene Ther. 2007,14(9) 721-32 ；Yuanyuan W, Li L, Shengrong G. Characterization of biodegradable and cytocompatiblenano-hydroxyapatite/poly caprolactone porous scaffolds in degradation in vitro [J].Polymer Degradation and Stability, 2009,1-7)細胞外基質(Extracellularmatrix，ECM)、天然或合成的高分子及其共聚 物等，其中 ECM (參見SepidehHeydarkhan-Hagval 1, Katja Schenke-Layland，Andrew P.Dhanasopon, et al. Three-dimensional electrospun ECM-based hybrid scaffolds for cardiovasculartissue engineering[J]. Biomaterials,2008,29 (19) 2907-2914) 是由鄰近細胞分泌的蛋白纖維、蛋白聚糖和非纖維蛋白等成分通過化學和物理交聯組成的 具有三維結構的網狀結構，為組織和細胞的生長提供支撐和彈性，與細胞特別親合、易於模 擬體內環境。Capito等將胰島素樣生長因子的基因與脂質體轉染試劑複合後，與ECM(膠 原-氨基聚糖)三維支架交聯，在兩周培養期內僅釋放出約1%，連續表達的胰島素樣生 長因子可顯著促進組織的再生(參見Captio RM, Sepctor M. Collagen scaffolds for nonviralIGF-I gene delivery in articular cartilage tissue engineering[J]. Gene Ther. 2007，14(9) :721_32)。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種基於組織工程三維支架的非病毒基因傳遞系統及其在非病毒基因傳遞系統中的應用。本發明的技術方案如下一種基因傳遞系統的三維納米支架，它是由膠原、殼聚糖以及纖維粘結蛋白 (Fibronectin, FN)組成的三維納米支架，其特徵是它包含有載有基因的磷酸鈣複合納米 粒，它是一種疏鬆多孔的三維納米支架，所述的膠原、殼聚糖、纖維粘結蛋白和交聯劑戊二 醛的質量比為1 1 0. 0005 0.0124 1 100 0. 08 0. 24，所述的纖維粘結蛋 白為含有天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的纖維粘結蛋白，所述的載有基因的磷酸鈣 複合納米粒是球形的、粒徑小於50nm的載有治療基因的磷酸鈣納米粒，其含量為三維納米 支架總質量的0.01% -1%。一種製備上述的基因傳遞系統的三維納米支架的方法，它是在膠原醋酸溶 液0. 1 Iml中加入殼聚糖醋酸溶液0. 1 1ml，加入0. 25%戊二醛50yL Iml 交聯，室溫過夜，冷凍乾燥，緩衝液(PBS)洗滌三次，細胞培養基(Dulbecco，s Modified EagleMedia, DMEM)浸泡過夜後再冷凍乾燥，用PBS洗滌，加入載有治療基因的磷酸鈣納米 粒0. 6 μ g 60 μ g和纖維粘結蛋白(FN) 0. 05 μ g 8 μ g，冷凍乾燥得到基因傳遞系統的三 維納米支架。本發明的基因傳遞系統的三維納米支架在非病毒基因傳遞系統中的應用。實驗表明應用本發明的基因傳遞系統的三維納米支架的非病毒基因傳遞系統具 有高效緩釋的特性，其所負載的基因的表達可達到外加因子的水平。本發明的有益之處是本發明是在三維支架中加入如含有RGD序列的FN及磷酸 鈣-TGFi3 1複合納米粒，形成新型三維非病毒納米基因傳遞系統，這種新型的傳遞系統具 有高效緩釋的特性，其所負載的基因的表達可達到外加因子的水平。為非病毒基因傳遞及 組織工程修複方面提供了新的思路。


圖1自製載有治療基因磷酸鈣納米粒的電鏡2為膠原_殼聚糖-FN三維支架掃描電鏡圖(不含載基因的磷酸鈣納米粒)。圖3為含有載基因磷酸鈣納米粒的三維支架掃描電鏡圖(箭頭所示為複合納米 粒)。圖4為三維非病毒納米基因傳遞系統接種細胞的掃描電鏡圖(箭頭所示為細胞)。圖5為ELISA法測定三維納米支架與游離DNA+支架在不同時間(3_15天)細胞 蛋白表達濃度。(*P > 0. 05，**P < 0. 05，***P 0. 05，**P < 0. 05，_P < 0. 01)。
具體實施例方式本發明通過實施例作進一步的說明。實施例1 載有治療基因的磷酸鈣納米粒的製備(1)製備將0. IM Igepal C0-520溶於25ml環己烷，加入1. 36M氯化鈣，攪拌混勻形成微乳1;將0. IM Igepal C0-520, 50 μ ITis-HCL (pH 7.4)溶於25ml環己烷，加入磷酸氫二鈉和TGF-β 1質粒，加入磷酸氫二鈉的質量為3. 4785 μ g，磷酸氫二鈉與質粒的質量 比為0. 1 1 10 1，攪拌形成微乳2，將微乳2緩慢滴加到微乳1中，攪拌lOmin，形成 載有基因的磷酸鈣複合納米粒的乳液。(2)載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離(a)層析柱的預處理
取90g矽球加入含有0. 336nL氨基丙基三乙氧基娃烷(aminopropyltriethoxysilane, 八卩5)，1.511^冰乙酸，7.51^雙蒸水的150mL乙醇溶液中，攪拌過夜，70°C烘乾備用；(b)載有基因的磷酸鈣複合納米粒的分離將上述製得的載有基因的磷酸鈣複合納米粒乳液過矽膠層析柱，先用無水乙醇洗 脫環己烷及游離的質粒和鹽，然後用濃度為5X10_4mol/L的NaCl的70%乙醇溶液洗脫載 基因的磷酸鈣複合納米粒；(c)載有基因的磷酸鈣複合納米粒乙醇液的濃縮將步驟2所得的含有載有基因的磷酸鈣複合納米粒的乙醇液在37°C旋轉減壓蒸 發6h除去乙醇，濃縮液置於12KD的透析袋中，置於磷酸鹽緩衝液中，4°C透析過夜，即得到 載有基因的磷酸鈣複合納米粒。得到的載有基因的磷酸鈣複合納米粒的電鏡照片見圖1。實施例2 —種作為對比的三維支架的製備取膠原醋酸溶液0. Iml加入殼聚糖溶液0. 1ml，冷凍乾燥，加入0. 25 % 戊二醛50 μ L交聯，室溫過夜，冷凍乾燥，PBS洗滌三次，冷凍乾燥，加入纖維粘結蛋白 (FN) 1 μ g，得到不含載有治療基因的磷酸鈣納米粒的三維支架，其電鏡照片見圖2。實施例3 本發明的三維納米支架的製備取膠原醋酸溶液0. Iml加入殼聚糖溶液0. 1ml，冷凍乾燥，加入0. 25 % 戊二醛50yL交聯，室溫過夜，冷凍乾燥，PBS洗滌三次，20min/每次，細胞培養基 (Dulbecco' sModified Eagle Media, DMEM)浸泡過夜；PBS 洗滌三次，20min/每次，加入實 施例1製得的載有基因的磷酸鈣複合納米粒1 μ g和FNl μ g，冷凍乾燥得到本發明的三維納 米支架，其電鏡照片見圖3。實施例4 本發明的三維納米支架的製備取膠原醋酸溶液0. Iml加入殼聚糖溶液10ml，冷凍乾燥，加入0. 25 % 戊二醛Iml交聯，室溫過夜，冷凍乾燥，PBS洗滌三次，20min/每次，細胞培養基 (Dulbecco' sModified Eagle Media, DMEM)浸泡過夜；PBS 洗滌三次，20min/每次，加入實 施例1製得的載有基因的磷酸鈣複合納米粒60 μ g和FN8 μ g，冷凍乾燥得到本發明的三維 納米支架，其形貌和性能同實施例3製得的三維納米支架。實施例5 大鼠間質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)的培養將SD大鼠拉頸處死，體積分數為75%乙醇浸泡3 5min，無菌條件下取出脛骨 和股骨；將其兩端幹骺端切除，顯露骨髓腔，用無菌注射器吸取適量PBS徹底衝洗骨髓腔； 反覆吹打衝出的骨髓，使骨髓細胞充分分散；所獲骨髓單細胞懸液沿管壁緩慢滴加於預加 的Percoll分離液(相對體積質量1. 073)的離心管中，骨髓單細胞懸液與分離液的比例為 1 1 ;2000rpm，離心20min，吸取中間雲霧狀細胞層，用PBS洗滌3次；重新懸起細胞，加入 完全培養基(含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養基)，置於培養瓶中，37°C體積分數 為5%的CO2培養箱中培養。
實施例6 三維納米支架的體外轉染(1)取適量實施例3製得的三維納米支架置於24孔板中，將MSC按2X 104/mL接 種於支架上，加入完全培養基至500μ L，置37°C、5% CO2培養箱中培養；分別在3、6、9、12、 15d收集上清培養液於-20°C保存，細胞繼續用完全培養基進行培養。接種有細胞的三維支 架電鏡照片見圖4。(2)對照組一取適量的三維支架置於24孔板中，將MSC按2 X 104/mL接種於支架 上，加入完全培養基至500 μ L，置37°C、5% CO2培養箱中培養；24h，吸棄前一天鋪板的培養 液，加入游離質粒以及無血清的DMEM培養液至500μ L，置37°C、5% CO2培養箱中培養；分 別在3、6、9、12、15d收集上清培養液於-20°C保存，細胞繼續用完全培養基進行培養。(3)對照組二 取適量的三維支架置於24孔板中，將MSC按2 X 104/mL接種於支架 上，加入完全培養基至500 μ L，置37°C、5% CO2培養箱中培養；24h，吸棄前一天鋪板的培養 液，用PBS洗滌後，加入市售轉染試劑脂質體lipfeCtamineTM2000以及無血清的DMEM培養 液至500 μ L，繼續培養6h ；換用完全培養基繼續培養。分別在3、6、9、12、15d收集上清培養 液於-20°C保存，細胞繼續用完全培養基進行培養。
實施例7 體外轉染細胞的轉染效率測定收集細胞培養物上清，離心，加到酶標板中。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。 除空白孔外，餘孔分別加標準溶液或待測樣品lOOul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加 上蓋，37°C反應120分鐘。棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液lOOul， 37°C，60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩幹。每孔加檢測溶液B工作液lOOul, 37°C，60分 鍾，洗板5次，甩幹。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光顯色30分鐘(此時肉眼可見標準 品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，後3-4孔梯度不明顯)。依序每孔加終止溶液50ul，終止 反應(此時蘭色立轉黃色)。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長測量各孔的光密度(0D值)， 測定目的蛋白表達量，其結果見圖5和圖6。三維納米支架在3-15天內，蛋白表達水平維持在lOng/ml左右，顯著高於對照 組一(游離DNA+三維支架)(P < 0. 01)。從第6天開始，對照組二(市售轉染試劑脂質 體lipfectamine 2000+三維支架)的蛋白表達水平遠低於三維納米支架(P < 0. 05或P < 0.01)，說明嵌合有載有基因的磷酸鈣複合納米粒的三維納米支架具有明顯的長效、緩釋 特徵。
權利要求
一種基因傳遞系統的三維納米支架，它是由膠原、殼聚糖以及纖維粘結蛋白(Fibronectin，FN)組成的三維納米支架，其特徵是它包含有載有基因的磷酸鈣複合納米粒，它是一種疏鬆多孔的三維納米支架，所述的膠原、殼聚糖、纖維粘結蛋白和戊二醛的質量比為1∶1∶0.0005∶0.0124～1∶100∶0.08∶0.24，所述的纖維粘結蛋白為含有天門冬氨酸序列的纖維粘結蛋白，所述的載有質粒的磷酸鈣複合納米粒是球形的、粒徑小於50nm的載有治療基因的磷酸鈣納米粒，其含量為三維納米支架總質量的0.01％～1％。
2.一種製備權利要求1所述的基因傳遞系統的三維納米支架的方法，其特徵是它是 將質量百分濃度為的膠原醋酸溶液加入殼聚糖，使殼聚糖的質量百分濃度達到1%，冷 凍乾燥，加入0. 25%，50 y L戊二醛交聯，室溫過夜後再冷凍乾燥，用緩衝液洗滌，加入載有 治療基因的磷酸鈣納米粒0. 6 ii g 60 ii g和纖維粘結蛋白0. 05 ii g 8 ii g，冷凍乾燥得到 基因傳遞系統的三維納米支架。
3.根據權利要求1所述的基因傳遞系統的三維納米支架在非病毒基因傳遞系統中的 應用。
全文摘要
一種基因傳遞系統的三維納米支架，它是由膠原、殼聚糖以及纖維粘結蛋白組成的三維納米支架，其特徵是它包含有載有基因的磷酸鈣複合納米粒，它是一種疏鬆多孔的三維納米支架，所述的膠原、殼聚糖、纖維粘結蛋白和戊二醛的質量比為1∶1∶0.0005∶0.0124～1∶100∶0.08∶0.24，所述的纖維粘結蛋白為含有天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的纖維粘結蛋白，所述的載有質粒的磷酸鈣複合納米粒是球形的、粒徑小於50nm的載有治療基因的磷酸鈣納米粒，其含量為三維納米支架總質量的0.01％～1％。本發明的基因傳遞系統的三維納米支架在3-15天內，蛋白表達水平維持在10ng/ml左右，說明嵌合有載有基因的磷酸鈣複合納米粒的三維納米支架具有明顯的長效、緩釋特徵。
文檔編號A61L31/16GK101829367SQ20091026411
公開日2010年9月15日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者餘江南, 徐希明, 曹霞, 蘇偉燕 申請人:江蘇大學