微生物植酸酶的克隆及表達的製作方法

2023-05-08 07:28:46 2

專利名稱：：微生物植酸酶的克隆及表達的製作方法
技術領域：
：本發明是關於微生物植酸酶產品磷是所有生物體生長所需的一種必需元素。在家畜飼養過程中，必須提供含有無機磷的飼料以使單胃動物(如豬、家禽和魚)獲得良好的生長狀況。相反，反芻動物的飼料無需添加無機磷酸鹽，因為其瘤胃中存在的微生物能產生將植酸鹽催化轉化為肌醇和無機磷酸鹽。植酸鹽作為一種貯存磷源實際上存在於所有來自植物的食物中(參見植酸，化學特性及應用，編輯E.GrafPilatus出版，美國明尼阿波利斯州，MN，(1986))。植酸鹽在所有堅果、穀物、豆科植物、油料種籽、孢子和花粉中佔1-3%。它的複合鹽是植酸鈣鎂。植酸被認為是一種抗營養因子，因為它能與鈣、鋅、鎂、鐵等無機元素螯合，並且還能與蛋白質反應，從而降低蛋白質的生物效價，減少有重要營養價值的無機元素的生物利用性。植酸鹽中的磷通過單胃動物的胃腸道排洩在糞便中。儘管在結腸中能產生一些植酸鹽的水解產物，但由此而釋放的無機磷毫無營養價值，因為這些無機磷僅僅被小腸吸收了。因此，儘管在飼料中存在有大量的具有重要營養價值的磷，但卻沒有被單胃動物所利用。植酸鹽的磷排洩在糞便中還會引起其它後果，在過去數十年中，家畜集中飼養極大地增加了，因此，產生的糞便量也相應的增加，由此而引起了世界各地的環境問題。在某種程度上，這是由於糞便中的磷酸鹽在表層水中的積累而使這些水中的養份過剩。由微生物產生的，能催化轉化植酸鹽為肌醇和無機磷，普通公知的是植酸酶，能產生植酸酶的微生物包括細菌，如枯草桿菌(BacillusSubtilis)(V.K.Paver和V.J.Jagannathan，細菌學雜誌，(1982)，151，1102-1108)和Pseudonomas(D.J.Cosgrove.澳大利亞生物科學雜誌，(1970)23，1207-1220);酵母菌，如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(N.R.Nayini和P.Markakis，(1984)LebensmittelWissenscnaftundTechnologie17，24-26);以及真菌，如土麴黴(Aspergillusterreus(K.Yamada，Y.Minoda和S.YamamotoAgric、Biol、Chem、(1986).32，1275-1282)。其它麴黴菌種也已知能產生植酸酶，這其中，由無花果麴黴Aspergillusficuum產生的植酸酶經測定是具有最高比活性的植酸酶之一，並且比由其它微生物(非公開的觀察報導)產生的植酸酶有更好的熱穩定性。向單胃動物的飼料中添加微生物植酸酶的設想已有報導(見Wave，J.H.，Bluff.L和Shieh.T.R.的US，3，297，548號專利(1967);Nelson，T.S.，Shieh.T.R.Wodzinski，R.J.和Ware，J，H.在營養雜誌(1971)上的文章，101，1289-1294)。但是迄今，這一設想的應用尚非商業可行，因為，生產微生物酶類的成本太高(見Y.W.Han，動物飼料科技(1989).24，345-350)。出於經濟原因，仍將無機磷加到單胃動物的飼料中。現已發現微生物植酸酶還有其它工業用途，這些用途的實例如用玉米和小麥之類的穀物工業化加工生產澱粉。包括由溼磨法得到的玉米谷蛋白物料在內的廢棄物是作為動物飼料出售的。在浸泡過程中，可以添加植酸酶，對真菌植酸酶，條件(T≈50℃，PH＝5.5)是理想的(參見如Alko有限公司的EP-A-0321004)。從該方法的廢棄物得到的動物飼料的優點是含有磷酸鹽而不是植酸鹽。還有一種設想是將植酸酶用於大豆加工過程中(參見FinaseTMEnzymesByAlko，Alko有限公司公開發行的產品信息小冊子，Rajamaki，Finland)，因為大豆中有較高含量的抗營養因子植酸鹽，這就使得該蛋白源不適宜用於嬰兒食品、魚、小牛、和其它非反芻動物的飼料。將這寶貴的蛋白源進行酶催化改性，可以提高它的營養和商品價值。其它研究者對各種較好特性的植酸酶和改進它們的生產過程及其應用很感興趣。Ullah發表了一種從野生型Aspergillusficuum)中提純植酸酶的方法，並且測定了按該提純方法獲得的產品的幾個生化參數(Ullah，A，(1988a)PreparativeBiochem.18，443-458)。由Ullah獲得的有關數據列在下表1中。Ullah兩次披露了A.ficuum植酸酶蛋白質的N-末端胺基酸排列順序Ullah，A.(1987年10月4-8日在加利福尼亞SantaBarbara的第Ⅸ屆酶與工程會議上(廣告或介紹)和(1988b)Prep.Biochem.18.459-471上。由Ullah獲得的胺基酸序列資料複製在下面的圖1A、序列E中。從Ullah的披露可以得到幾個有趣的觀察結果首先，按Ullah(1988a和1988b)的描述製備的「提純」物在SDS-PAGE上由二條蛋白質帶組成，而我們發現，從A.ficuum提純的植酸酶含有一汙染物和在SDS-PAGE上看到二條蛋白帶之一，由Ullah確認的植酸酶來自於該汙染物。這種差異在Ullah公開的胺基酸順序資料(1987，1988b;將圖1A，序列A和B與序列C比較)上也出現了。事實上，經我們測定，Ullah描述的植酸酶內肽胺基酸序列中的一條(見圖1B，序列E)實際上屬於汙染的100KDa蛋白質(圖1C)，該蛋白質存在於按Ullah描述的方法所得到的製備物中，並被視為SDS-PAGE上的兩帶之一。Ullah並未意識到汙染蛋白的存在，而是把它看成了植酸酶的另一種形式。回過頭來看，該汙染物的存在，對選擇和分離編碼植酸酶活性的真實核苷酸序列增加了難度。另外，該汙染物的存在降低了試驗蛋白質的比活性值。另外，關於Ullah公開的序列，值得注意的是Ullah披露的第12位上的胺基酸殘基是甘氨酸。採用蛋白質和DNA排列技術，我們一貫地發現該殘基不是甘氨酸，實際上是半胱氨酸(參見圖6和8)。最後，Ullah揭示說植酸酶是一種85KDa蛋白質，脫糖基後的分子量為61.7KDa(Ullah1988b)，這個數字比早期報導的76KDa蛋白質(Ullah.A.和Gibson.D.(1988)Prep.Biochem.17(1)63-91)低得多，後者是以水解釋放的碳水化合物的相對量及SDS-PAGE上的天然蛋白質的表觀分子量計的。但是我們發現，糖基化的植酸酶只有一個表觀分子量85KDa，而脫糖基的蛋白質根據脫糖基的程度，表觀分子量在48-56.5KDa範圍內。Mullaney等人(絲狀真菌會議，1987.4，PacificGrove，加利福尼亞，(廣告介紹))也報導了A.ficuum植酸酶的特徵，但是，該報導也包括SDS-PAGE上的兩條蛋白質帶，其一為85KDa，另一為100KDa，它們以「純的」蛋白質製備物形式存在。這些蛋白質帶被作者確認為是植酸酶的兩種形式。一種轉化微生物寄主的方法已提出，但尚未報導，克隆和分離編碼植酸酶的DNA序列也未見揭示說明。評價植酸酶的經濟生產方法，尤其對動物飼料工業來說是有極大的益處的。更經濟的生產植酸酶的一種方法是用重組DNA技術以提高各種微生物中酶的表達值，這些微生物是已知能產生高值表達的肽或蛋白質。但是，迄今為止，編碼植酸酶活性的DNA序列的分離和克隆尚未見公開報導。本發明提供了提純和分離編碼植酸酶的DNA序列的方法，編碼植酸酶的DNA序列的分離和克隆是通過採用專為本發明而研製的專門的低聚核苷酸探針而實現的。可以由真菌源，特別是麴黴屬的絲狀真菌獲得優選的編碼植酸酶的DNA序列。本發明的另一目的是提供一種包含有表達組份的載體，所說的表達組份還含有至少一條編碼植酸酶的且最好是同系DNA序列的至少一條複製物，該複製物經操作聯接在一適宜表達寄主內的能高值表達的具有植酸酶活性的肽或蛋白質的適當可調的區域。由本發明提供的表達組份可以插入一載體，最好是插入能轉化微生物寄主細胞並結合進入基因組。本發明還有一個目的是提供一種轉化體最好是被如上段所述載體轉化的微生物寄主。本發明提供的轉化的寄主是麴黴屬、木黴屬、毛黴屬和青黴屬的絲狀真菌，Kluyveromyces和酵菌屬的酵母或芽孢桿菌屬的細菌，特別優選的表達寄主是麴黴屬的絲狀真菌。轉化的寄主能經濟地以工業化規模生產高值的重組植酸酶。另一方面，本發明是關於具有植酸酶活性的糖基化或非糖基化的重組肽和蛋白質的;還涉及到上述非糖基化肽和蛋白質的生產方法，沒有雜質的植酸酶活性的肽和蛋白質;以及用這些重組或提純的蛋白質與單克隆抗體反應。按Ullah方法提純的野生型A.ficuum植酸酶與按本發明得到的進一步提純的野生型A.ficuum植酸酶的生化參數的比較匯於下表1，特別註解給出了比活性數據，其中可以看出本發明獲得的提純蛋白質比活性是Ullah公開的兩倍。本發明還提供了編碼展示植酸酶活性的蛋白質的核苷酸序列以及這些蛋白質的胺基酸排列順序。所提供的序列可用於設計低聚核苷酸探針，該探針再用於為了識別來自其它品種，特別是微生物菌種的植酸酶基因的雜交篩選研究，隨後可以進行分離和克隆。本發明提供的序列還可以用作建立「第二代」植酸酶的原料，「第二代」植酸酶是通過誘變技術(如指定位誘變)而改進的植酸酶，其特性相異於如按本發明方法所產生的野生型植酸酶或重組植酸酶的特性，例如可以改變溫度或最佳PH值，比活性或底物親和性以便更好地適用於有限的方法。在本發明範圍內，術語植酸酶指的是涉及從各種肌醇六磷酸鹽中去掉無機磷的催化反應的一族酶。可以通過眾多的檢定來測量植酸酶的活性，其中選擇何種檢定方法對本發明是無關緊要的。為了達到更詳細的說明目的，植酸酶的活性可以按下述方法測定，即在37℃，PH＝5.50，流速為1μmol/min的條件下，測定從1.5mM植酸鈉釋放無機磷的酶用量。應該指出在本說明書中術語「植酸酶」包括所有具有植酸酶活性的肽和蛋白質。這點在圖1A中有詳細說明，圖1A對序列A和B(在本發明過程中獲得的序列)與序列C(由Ullah公開的，1988b)進行了比較，該圖證明按本發明獲得的蛋白質缺少成熟A.ficuum植酸酶蛋白質的開始端四個胺基酸(序列A的蛋白質缺開始端七個胺基酸)，但是，這些蛋白質保持有植酸酶活性。從相應的核苷酸序列演繹而來的完整的植酸酶蛋白質胺基酸序列示於圖8中。按本發明生產的植酸酶可以應用於需要將植酸鹽轉化為肌醇和無機磷酸鹽的各種方法中。例如，按本發明方法生產的植酸酶可以降低微生物植酸酶的生產成本，使之十分經濟地應用於動物飼料，從而最終使整體價格/性能比例能與無機磷酸鹽競爭。另一好處是糞便中的磷含量可以大幅度降低。在價格上可與無機磷酸鹽競爭，這樣，植酸酶的應用就將可以增加配合飼料工業的自由度，從而生產出高質量的飼料。例如當向飼料中添加植酸酶時，就可以不加無機磷酸鹽，並可以提高各種含植酸鹽的物料量。除了上面討論的用於動物飼料和大豆加工外，按本發明獲得的植酸酶還可以有各種不同的工業用途，如-豬和家禽的液體飼料。普遍施行的是，在飼餵前將飼料浸泡幾小時，在此期間，酶可以將植酸鹽轉化為肌醇和無機磷酸鹽;-從植酸鹽工業化加工生產肌醇或肌醇一磷酸鹽;-用含植酸鹽的底物進行其它工業化加工如澱粉工業和發酵工業，如釀造工業，金屬離子被植酸鹽螯合可以使這些無機元素不能產生微生物，植酸鹽的酶促水解防止了這些問題的發生。本發明的種種目的及優點還將體現在下面的詳細說明中。圖1.A.確定為提純植酸酶的N-末端胺基酸序列。標記為A和B的胺基酸序列是由本發明提供的，來源於等電點分別為5.2和5.4的植酸酶派生物，序列C由Ullah(1987，1988b，前述)引證。序列A和B的第12位上的胺基酸殘基經本發明測定不是甘氨酸殘基。〔＊表示未明確識別，＊＊表示沒有檢測到殘基〕B.CNBr_分裂的內植酸酶片段的N-末端胺基酸序列。標記為A和B的胺基酸序列(表觀分子量分別大約為2.5KDa和36KDa的肽)是由本發明提供的，序列C至E引證於Ullah(1988b，前述)C.100KDa蛋白質的N-末端胺基酸序列，該蛋白質是由本發明發現找到的，其存在於粗植酸酶樣品中。圖2.A.根據圖1A，肽A至E的資料設計的低聚核苷酸探針。B.根據圖1B，肽A和B的資料設計的低聚核苷酸探針。圖3.用於分離編碼酸性磷酸酯酶的基因的低聚核苷酸探針。圖4.含A.ficuum植酸酶座位的λ-噬菌體AF201的限制圖。箭頭表示植酸酶基因的位置及轉錄方向。克隆＃表示在PAN8-1(對PAF28-1)中和PUC19(對所有其它的亞克隆)中的噬菌體AF201的指示限制酶引發的亞克隆。圖5.PAF1-1的物理圖，插入在PUC19中的10kbBamHI片段含有編碼A.ficuum酸性磷酸酯酶的全部基因。圖6.匯集了含有植酸酶染色體基因座位的質粒PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的核苷酸序列。植酸酶的編碼區在核苷酸的第210位至1713位;內含子在染色體基因的核苷酸的第254位至355位上。指示出了限制座位，植酸酶的起始和終止密碼子以及內含子的位置等有關特徵。圖7.是序列植酸酶染色體座位的詳細物理圖，箭頭指出了植酸酶的編碼區的兩個外顯子的位置。圖8.植酸酶cDNA片段的轉譯區的核苷酸序列及衍生的植酸酶蛋白質的胺基酸序列;成熟植酸酶蛋白質的開端標記為位置+1。36KDa內蛋白質片段的氨基末端位於241位胺基酸上，而2.5KDa蛋白質片段起始於第390位胺基酸。圖9.植酸酶表達盒PAF2-2S的物理圖，箭頭指明了基因的轉錄方向。圖10.A.ficuumNRRL3135轉化體中過表達的植酸酶的IEF-PAGE證據。將等體積的A.ficuum培養物的上清液(帶1)與轉化體PAF2-2SSP7(帶2)在指定條件下培養，在Phast系統(Pharmacia)及IEF-PAGE膠凝和PH4.5-6下進行分析。為了進行比較，提純至同系的A.ficuum植酸酶試樣或單獨分開(帶4)，或與培養物上清液混合(帶3)。凝膠或者用本文(A)所述的磷酸酯酶染色劑(A)染色，或用一般的蛋白質染色劑(Coomassie亮蘭，B)染色。星號表示植酸酶帶。圖11.對黑麴黴(A.niger)CBS513.88轉化體中過表達的植酸酶的IEF-PAGE證明。按圖10的說明，如用IEF-PAGE分析同樣體積的黑麴黴親代菌株的培養物的上清液(帶1)，或轉化細胞PAF2-2S＃8(帶2)，PFYT3＃205(帶3)和＃282(帶4)。凝膠用一般的磷酸酯酶活性染色劑(A)染色，或者用一般的蛋白質染色劑(B)染色。星號表示植酸酶帶。圖12.PAB6-1的物理圖。插入PUC19的14.5kbHindⅢDNA包括全部來自黑麴黴的糖澱粉酶(AG)座位。圖13.通過聚合酶連反應(PCR)，AG啟動子/植酸酶基因發生融合反應的圖解，本文給出了使用的所有低聚核苷酸引物的序列。圖14.植酸酶表達盒PAF2-2SH的物理圖。圖15.中間體PXXFYT1、PXXFYT2和植酸酶表達盒PXXFYT3的物理圖，其中XX表示主導序列(L)。在P18FYT＃和P24FYT＃中分別插有18aa和24aaAG主導序列，而在PFYT＃中，用的是植酸酶主導序列。圖16.質粒pFYT3amds物理圖。圖17.質粒pFYT31NT的物理圖。圖18.植酸酶/AG取代載體pREPFYT3的物理圖。圖19.染色體DNA的放射自顯影。用PVUⅡ(A)和BamHI(B)消化，用32P標記的A.ficuum植酸酶cDNA作為下列微生物菌種的探針進行雜交啤酒酵母菌(帶2);枯草桿菌(帶3);K.lactis(帶4);P.crysogenum(帶5);銅綠倉假單胞菌(P.aeruginosa(帶6);S.lividans(帶7)，黑麴黴1μg(帶8)，黑麴黴5μg(帶9)，空白(帶10)，C.thermocellum(帶11)。帶1標誌DNA。可以採用各種不同的方式來克隆編碼由微生物產生選擇出的蛋白質的基因。一種方法是提純所需的蛋白質，隨後測定其N-末端胺基酸序列，用以上述的N-末端胺基酸序列為基礎的DNA低聚核苷酸探針篩選上述微生物的基因組庫。該方法的成功應用例是克隆(cephalosporiumacremonium)的異青黴素N-合成酶基因(S.M.Samson等人，Nature(1985)318，191-194)以及分離出用於米麴黴編碼TAKA澱粉酶的基因(Boel等人，EP-A-0238023，1986)。已經採用上述方法償試分離了編碼植酸酶的A.ficuum基因，對蛋白質進行了提純，並測定幾個生化參數，將所得數據與Ullah公開的數據(1988a)進行比較，兩組數據均列於下表1中。表1提純的野生型A.ficuum植酸酶生化參數參數本發明Ullah比活性＊100U/mg蛋白質50U/mg蛋白質純度SDS-PAGE85KDa85/100KDaIEF-PAGE3或4條帶未做Km(親和常數)250μM40μM專一性肌醇-1-P無活性無活性肌醇-2-PKm＝3.3mM5%活性最適PH2.5和5.52.5和5.5最適溫度(℃)5058MW(KDa)＊＊8585和100MW(未糖基化)＊＊56.561.7等電點＊＊＊5.0-5.44.5＊。Ullah是在58℃而不是37℃下測定植酸酶活性。植酸酶活性單位的定義是在37℃，PH＝5.50，速率為1μmol/min時，由1.5mM植酸鈉釋放無機磷所需的酶量。比較發酵產率和比活性，對Ullah公開的活性按溫度差校正，該校正是以37℃測得的植酸酶活性與Ullah表Ⅲ(1988b)所示的58℃測得的植酸酶活性的差為基礎進行的。＊＊.用SDS-PAGE測得表觀分子量。＊＊＊用IEF-PAGE測得的結果。為了分離出編碼植酸酶的基因，首先要根據上述方法設計第一套低聚核苷酸探針(圖2A)，這些探針的設計是以胺基酸序列資料為依據的。為了對整個方法進行對照，採用同樣的步驟來分離編碼的酸性磷酸酯酶的基因，該磷酸酯酶採用的是Ullah和Cummins公開發表的蛋白質資料(1987)，Prep.Biochem.17，397-422)。對於酸性磷酸酯酶，可以毫無困難地分離出相應的基因，但對植酸酶就出現了困難。儘管進行了許多努力，其中包括採用由N-末端胺基酸序列衍生的探針，也分離不出基因DNA片段或明確顯示包括編碼植酸酶基因的基因庫的克隆。為了解決該問題，將提純的植酸酶進行CNBr-一定向分裂，然後再將所得蛋白質片段分離。測定這些片段的N-末端胺基酸序列(圖1B)，並根據新的資料設計出新的低聚核苷酸探針(圖2B)。令人驚奇的是，新的低聚核苷酸探針能標記特定的DNA片段，並適用於基因庫的克隆的沒有爭議的標記。在新克隆或分離出的DNA片段與第一套低聚核苷酸探針或用該探針分離的克隆之間未觀察到交叉雜交的現象。第二套探針也可以用於標記有關植酸酶的編碼序列。新分離出的克隆可用作Northernblot雜交的探針。當從產生菌絲體的植酸酶分離出mRNA時，僅檢測出分離的mRNA，當試圖從產生菌絲體的非植酸酶獲得RNA時，未發現雜交信號。mRNA其大小約為1800b，理論上能產生最大分子量為約60KDa的蛋白質。該值與測得的未糖基化的蛋白質的分子量是相一致的，蛋白質分子量是由DNA序列推斷出的。另外，當通過轉化引入真菌細胞時，可以證明植酸酶活性提高了，這真憑實據地表明編碼植酸酶的核苷酸序列確實被分離出來了。被確定為純的植酸酶和由此而得到的CNBr片段的胺基酸序列與由確定為克隆基因的序列推斷出的胺基酸序列同時出現，圖6和8給出了核苷酸序列和推斷出的胺基酸序列，並進一步說明編碼植酸酶的克隆序列。利用分離出來的編碼植酸酶的核苷酸序列，通過現代重組DNA技術，如基因放大、調節元素的交換、如啟動基因、分泌標誌物等手段或將這些手段結合起來就能夠十分經濟地以工業規模生產植酸酶。因此，本發明還包括能有效高值的表達具有植酸酶活性的肽或蛋白質的轉化表達寄主，如果需要，還應有效地表達出酸性磷酸酯酶。可選用的表達寄主是選自麴黴屬、木黴屬、毛黴屬如青黴素屬絲狀真菌，選自Kluyveromyces和酵母菌屬的酵母以及芽孢桿菌屬的細菌。優先選用能有效分泌內源蛋白質的表達寄主。特別感興趣的是麴黴屬的工業菌株，尤其是黑麴黴、ficuum、泡盛麴黴(awamori)或米麴黴。另外，Trichodermareesei、Mucormienei、Kluyveromyceslactis、啤酒酵母菌、枯草桿菌或地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)也可以使用。表達體包括編碼待表達酶產物的核苷酸序列，通常，寄主上有一功能性標誌序列，提供分泌產物肽或蛋白質。按照本發明，可以採用各種標誌序列。可以用與待表達的克隆核苷酸序列同系的標誌序列。另外，可以用與寄主的靶座位處的標誌基因序列同系或基本同系的標誌序列以便於同系重組。再則，還可以採用為改善選擇表達寄主的分泌作用而設計的標誌序列。例如，參閱Eur.J.Biochem.133，17-21(1983，Von.Heyne)和J.Mol.Biol.167，391-409(1983)Perlman和Halverson)。編碼標誌序列的DNA序列可以通過編碼加工標誌(分裂識別位置)的序列直接聯接到要求編碼蛋白質的序列上，或通過一短橋，通常小於十個密碼子聯接到要求編碼蛋白質的序列上。在本發明範圍內所用的優選分泌標誌序列是與待表達的克隆核苷酸序列同系的標誌序列，18胺基酸糖化酶(AG)標誌序列和24胺基酸糖化酶(AG)標誌序列，後兩個或與待表達核苷酸同系或是異種的。表達產物或感興趣的核苷酸序列可以是與表達寄主同系或異種的DNA。在此，「同系」DNA是指來源於同一菌屬的DNA，例如，麴黴用來自麴黴的DNA轉化，用這種方法可以改善已有的真菌屬的性質，而不會帶入以前不存在的新的特性。「異種」DNA是指來源於一個以上菌屬的DNA。即，如果用上段給出的例子，那麼，將來源於非麴黴屬的DNA表達在麴黴上。編碼植酸酶活性的核苷酸序列以從真菌源獲得為宜，最好是由麴黴屬獲得的編碼植酸酶的核苷酸序列，而最優選序列是由A.ficuum或黑麴黴菌種獲得的。在所感興趣的核苷酸序列的5′至開放解讀密碼區域包括了轉錄起始調節區(或啟動基因)。可以利用寄主內的功能區域，包括與待表達的編碼植酸酶的核苷酸序列同系的啟動基因。但是，在大部分情況下，利用的區域與靶座位的區域是同系的。這樣就能有效地用感興趣的表達物取代靶位點的表達物。對編碼蛋白質的靶座位的分泌和表達水平達到有效生產的程度，轉錄起始調節區一般就被認為符合要求了。但是，在一些實例中，可望比靶座位基因高的轉錄值或者可以期望用一種特定的誘導表達。在這些實例中，可以利用不同於靶座位基因區的轉錄起始調節區。已知大量轉錄起始調節區在絲狀真菌中是有作用的。這些區域包括編碼糖化酶(AG)、真菌澱粉酶、酸性磷酸酯酶、GAPDH、TrpC、AmdS、AlcA、AldA、組蛋白H2A、PyrA、PyrG、異青黴素N合成酶、PGK、酸性蛋白酶、醯基轉移酶等的基因的區域。靶座位最好是編碼高值地表達蛋白質基因，也就是說，那些表達物的基因在發酵過程終止時表達濃度至少是大約0.1g/l。發酵周期的持續特別可以改變要求得到的蛋白質產品。編碼糖化酶(AG)的基因即是這類基因的一個例證。其它感興趣的基因包括真菌α-澱粉酶、酸性磷酸酯酶、蛋白酶、酸性蛋白酶、脂酶、植酸酶和纖維二糖水解酶。特別優選的靶座位是黑麴黴的糖化酶基因、米麴黴的真菌澱粉酶基因、T.reesei的纖維二糖水解酶基因、Mucormiehei的酸性蛋白酶基因、Kluyveromyceslactis的乳糖酶基因或啤酒酵母的轉化酶基因。轉錄終止調節區域可來自感興趣的基因、靶座位、或其它任何方便的序列。其中表達體還包括從所感興趣的基因的下流的序列(沿轉錄方向)，如果轉錄終止調節區域與靶座位同系，那麼，基本上應是小於同系側面的區域。通常採用選擇標記，它可以是表達體的一部分，或獨立於表達體，因此，它可以在不同於所感興趣的基因部位整合。由於本發明的重組分子最好是轉化成能用於工業化生產的寄主菌株，所以，探查轉化過程的選擇標記最好是顯性選擇標記，即沒有突變株被引入能夠利用這些選擇標記的寄主菌株。其中的實例有能夠使轉化體在規定營養源上生長的標記(例如，A.nidulansamds基因能使黑麴黴轉化體在乙醯胺作為唯一的氮源上生長)或對抗菌素產生抗性的標記(例如，ble基因能對腐草黴素產生抗性，或hph基因，能對潮黴素B產生抗性)。選擇基因具有自己的轉錄和翻譯起始和終止調節區域，這樣就能獨立地表達標記。如前所述，已知有大量的轉錄起始調節區域，並可與標記基因聯用，其中，利用抗菌素抗體時，選擇的抗菌素濃度將根據抗菌素而改變，但一般大約為30-300μg/ml抗菌素。可以按照已知技術將各種序列連接起來，如限制作用，接合互補限制座位及連接，通過懸垂填充來平整末端和平整連接、Ba131切除、引物修復，體外誘變等等。可以用多連接子和連接物，在適當的時候，按照已知技術引入或除去以便於表達體組合，在表達體合成的每個階段，均可以克隆片段，並通過限制酶，排列順序或雜交等分析。有大量的載體可用於克隆，至於具體的選擇，不是本發明的關鍵。一般是在E.Coli中進行克隆。側區可以包括靶座位中的至少部分開放解讀密碼，特別是標誌序列，靶座位基因的調節區5′和3′，或者延長超出調節區。通常，側區至少是100bp，往往是至少200bp，並且可以是500bp或大於500bp。選擇側區是為了分裂靶基因，阻止其表達。上述目的可以通過下面方法實現將表達盒(包括被表達的核苷酸序列，並最好包括其它組分，如標記序列，轉錄起始調節區序列和/或轉錄終止調節區序列)插入最接近5′區的開放解讀密碼，用表達體全部或部分取代靶基因，或者在靶座位的轉錄起始調節區和開放解讀密碼之間進行表達體幹涉。正如已經指出的那樣，當終止調節區與靶座位的區域同系時，實際上3′一側區應該大體上大於表達體內的終止調節區。本發明還提供了建立「第二代」植酸酶的原料，所說的「第二代」植酸酶即是性質上不同於本文所說的分離出來的酶的植酸酶。第二代植酸酶改變了最適的溫度和PH，改變了比活性或對底物的親和度，或者改變了其它質量，使該酶更適用於規定的方法。E.Coli是進行誘變(如定位誘變)的最佳寄主。由於E.Coli缺少為除去可能存在於植酸酶基因中的內含子的拼接機構，所以植酸酶的cDNA克隆是被表達在E.Coli上的選擇序列。該cDNA序列能夠通過現有技術已知的方法很容易地誘變，誘變後，可將誘變基因引入要求的表達體中。所說的表達體可以轉化進入作為克隆載體的寄主中，不是線性的，即是環形的，或者如果需要，也可以從克隆載體中除去。克隆載體最好是質粒，通常，在大約1kbp所感興趣的基因內，質粒被線性化。最好是將生產本發明植酸酶的表達體整合進入選擇的表達寄主的基因組。有各種技術可以實現絲狀真菌的轉化，這些技術包括原生質體融合或轉化，電擊以及將微拋射體射入細胞。現已發現原生質體轉化成功的，可以優先採用。首先，在KCl或山梨糖醇等的滲透穩定劑參與下，通過細胞壁的酶促消化，將感興趣的真菌種的菌絲體轉化為原生質體，添加CaCl2和濃的聚乙二醇溶液來幫助原生質對DNA的吸收，添加的後一種物質能引起原生質聚集，由此，轉化DNA被包含在聚集體中，並被原生質所吸收，隨後，使原生質在固體介質中再生，所說的固體介質含有滲透穩定劑，如果需要，還含有一種選擇劑，該選擇劑是用作轉化DNA編碼抗體的。在選擇轉化體後，可以用不同的方法來測定所感興趣的基因的存在。利用抗體，其中表達產品與寄主異種，可以探測所感興趣的表達基因的存在。另外，可以用Southern或Nothernblots探測整合基因或其轉錄產品的存在。可以通過標準技術，如將多重複制表達體引入轉化載體，或用amds基因作選擇標記(如Weinans等人，CurrentGenetics(1985)，9361-368)來放大核苷酸序列或所感興趣的表達體。如上所討論的，待放大後的DNA序列可以包括或與表達寄主同系，或是異種的DNA。然後，可使細胞在任意的營養介質上生長，可以用低濃度的蛋白酶抑制劑，如苯基甲基磺醯氟、α2-巨球蛋白和抑胃肽(Pepstatin)等，常用濃度範圍是大約1μg/ml-1mg/ml。為了避免或減少所要蛋白質的降解，可以將蛋白質失活。轉化體可以在間歇，或者是連續發酵反應缶中生長，其中營養介質是分開的，並且是符合要求的提取產物。如果需要，可以採用各種不同的方法來提純產品，如氣相色譜法(例如HPLC)、溶劑萃取、電泳等，或者將這些方法組合使用。本發明還提供了一種順流加工法，其中，將發酵液(最好是提純過的)過濾，然後，進行第二次無菌過濾，隨後，將過濾的溶液濃縮，將如此獲得的濃縮液按如下使用a)在連續攪拌條件下，加入丙酮，其量為最終體積的60%(V/V)，可使植酸酶和其它蛋白質從濃縮物中沉澱出來，在真空中，35℃下乾燥沉澱物，粉碎成乾粉末後，可將酶製品做應用試驗。回收率大約90%。b)可以採用常規的噴霧乾燥技術將液態濃縮物噴霧乾燥，回收率在80%-99%範圍內變化。c)可將濃縮物與載體材料，如小麥麩混合，如此得到的混合物可以在噴霧塔或流化床中乾燥。d)通過添加如山梨糖醇，可使濃縮液滲透性穩定，可以添加苯甲酸之類的防腐劑以防止微生物汙染。上述四種配料可以出售給預混合工廠、配合飼料工業、其它銷售商和農場主。在本發明中，實施例只是進一步說明，並非是對本發明的範圍加以限制。本發明的植酸酶基因可用於異種雜交試驗，涉及從其它微生物分離編碼植酸酶基因、這些對本領域技術人員來說都是顯而易見的。實施例1A.ficuumNRRL3135的發酵由北區研究室(美國、伊利諾斯州，Peoria，NorthUniversity大街1815號，USDA)得到Aspergillusficuum菌株NRRL3135，按下面的標準技術製備真菌孢子。將孢子及隨後的細胞通過在錐形瓶中進行一系列間歇發酵，並轉移到101發酵罐，間歇培養生長後，該發酵罐內物料即作為最終500L間歇發酵的接種物。所用的培養基包括91g/L玉米澱粉(BDH化學有限公司)、38g/L葡萄糖·H2O，0.6g/LMgSO4·7H2O、0.6g/LKCl、0.2g/LFeSO4·7H2O和12g/LKNO3。通過用4NNaOH或4NH2SO4自動滴定，使PH保持在4.6±0.3。在28℃，自動控制25%空氣的溶解氧濃度條件下，培養細胞。發酵10天後，植酸酶產物達5-10U/ml的最高值。實施例2將A.ficuum植酸酶提純及特性化A.植酸酶活性測定將100μl發酵液過濾物(必要時可以稀釋)或上清液或100μldemiwater作為參照物加入到含有下列成份的培養混合物-0.25MNaAC緩衝液，PH5.5或-甘氨酸、HCl-緩衝液，PH2.5-1mM植酸，鈉鹽-demiwater達900μl將所得混合物在37℃下，恆溫培養30分鐘，加入1ml10%TCA(三氯乙酸)終止反應，終止反應後，加入2ml試劑〔50ml含3.66gFeSO4·7H2O的鉬酸銨溶液(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O和8mlH2SO4用demiwater稀釋至250ml)〕。在750nm處利用分光光度法測定蘭色強度。測定結果表明，根據磷酸鹽校準曲線釋放出的磷酸鹽量在0-1mmol/l範圍內。磷酸酯酶染色用一般磷酸酯酶染色法，通過等電點聚焦探測具有磷酸酯酶活性的組份。將凝膠用含α-萘基磷酸鹽和FastGarnetGBC色鹽(σ，分別是0.1%和0.2%(W/V))的0.6MNaAC緩衝液(PH5.5)，恆溫培養，再將出現黑色沉澱的反應物或用甲醇∶乙酸(30∶10%V/V)終止，或者當仍需要有植酸酶活性的蛋白質時，可以用蒸餾水洗滌。B.A.ficuum植酸酶的提純將來源於A.ficuumNRRL3135培養發酵液的植酸酶提純到同質性程度。首先，通過過濾使發酵液無菌，然後將所得培養過濾物在帶有30KD斷流過濾器的Filtron超濾裝置中濃縮。在提純過程中，利用10mMNaAC緩衝液(PH4.5)衝洗樣品，以調節樣品的PH和離子強度。在超濾過程中，最終濃縮約20倍。然後，將試樣加到650型水製備先進的蛋白質提純系統(WatersPreparative650AdvancedProteinPurificationSystem)中的陽離子交換器內〔20mlS-瓊脂糖速流柱(HR16/10)，由Pharmacia獲得〕。用含有NaCl(濃度梯度為0-1M)的醋酸鈉緩衝液洗脫粘結的蛋白質，植酸酶在大約250mMNaCl中洗脫。將含植酸酶活性的洗脫物收集起來，經超濾濃縮和脫鹽。再將所得溶液加入陰離子交換柱(20mlQ-瓊脂糖速流柱(HR16/10)，Pharmacia)，再次用上述的含濃度梯度為0-1MNaCl的NaAC緩衝液洗脫蛋白質，大約在200mMNaCl時，由該柱洗脫出植酸酶。經過這些提純步驟，得到比活性大約為40-50U/mg蛋白質的部分純化過的植酸酶製品，表明純度為25倍。對部分提純植酸酶純度分析表明存在有分子量約為100KDa(圖1B，序列E)的主要雜質。等電點聚焦試驗表明有大量的含磷酸酯酶活性的酶存在，包括3-4種植酸酶亞形式(等電點在5.0-5.4範圍變化)(圖1A，序列A和B)。為了獲得同質植酸酶製品，利用在LKBMultiphor系統中的AmpholinePAG板上(PH4-6.5)等電點聚焦分離部分提純過的植酸酶組分，進一步使其純度提高2倍。用前述一般磷酸酯酶染色法檢測含磷酸酯酶(包括植酸酶)的蛋白質，隨後，由凝膠中摘除感興趣的帶，通過在10mMNaAC緩衝液(PH5.5)中恆溫培養，矽膠切片16小時洗脫活性蛋白質。按實施例2所述的方法，對蛋白質部分進行植酸酶比活性分析，這樣，即從其它酸性磷酸酯酶中鑑別出植酸酶成份。植酸酶的最終提純度大約是60倍(最終製備物的比活性是100U/mg蛋白質)。在最後的提純步驟中，還可以分離出植酸酶的不同亞形式(圖1A，序列A和B)。製備針對A.ficuum植酸酶的樣品的單克隆抗體，以提供有效的提純方法。將抗體偶聯到溴化氰激活的瓊脂糖4B(5mg/ml凝膠)上，並將該基質用於免疫親合柱，基質示出粘合含有大約1mg植酸酶/ml。用PH2.5的緩衝液(100mM甘氨酸-HCl，500mMNaCl)將植酸酶從親合柱中洗脫出來，而活性不會有任何損失。該方法可一步將同質植酸酶從粗培養液過濾物中分離出來，回收率達80%，純化約60倍。C.植酸酶脫糖基用總體積為30μl，內含0.2M磷酸鈉緩衝液(其中含有2.5UN-聚糖酶(GenzymePH8.6)和10mM1，10-菲咯啉的溶液培養A.ficuum植酸酶(70μg蛋白質)。37℃下，培養16小時後，利用電泳法(Phast系統，Pharmacia)檢查脫糖程度。發現植酸酶的表觀分子量由85KDa下降到大約56.5KDa。利用鑑別天然植酸酶糖蛋白的高碘酸Schiff(PAS)糖染色法，檢測不到有殘留的碳水化合物連接在蛋白質上。利用靈敏的植物凝集素-吸印法(lectin-blotting)進一步證明碳水化合物已完全脫除。將天然的和脫糖基的植酸酶(兩份、1.5μg)在標準SDS-PAGE凝膠上試驗，並通過電泳法轉移到PVDF膜(Immobilon，Millipore)，該膜並於25mMTRIS-甘氨酸緩衝液(PH8.3)、20%(V/V)甲醇中，電壓30V，時間16小時。然後，用含有1%(W/V)牛血清清蛋白的磷酸鹽緩衝液以及用伴刀豆球蛋白A-過氧化物酶(σ，10μg/ml磷酸鹽緩衝鹽液)培養上述膜。之後，用4-氯-1-萘酚(σ)對過氧化物酶染色。用該靈敏方法也不能檢測到有任何殘留的碳水化合物連接在脫糖基的植酸酶上。脫糖基後，植酸酶完全失去了它的活性，這可能是由於酶聚集的緣故。實施例3植酸酶胺基酸排列順序的測定及低聚核苷酸探針的設計A.N-末端胺基酸序列的確定。將植酸酶用電泳法由SDS-PAGE或IEF-PAGE傳送至PVDF吸印(blotting)膜上(Immobilon，Milli-pore)在含10%(V/V)甲醇的10mMCAPS(3-環己氨基-丙磺酸)緩衝液(PH11.0)中，進行電吸印(Electro-blotting)，電壓30V，4℃，時間16小時。用考馬斯亮蘭染色蛋白質，將所感興趣的帶摘除，在甲醇中脫色，並進行氣相排列順序。利用幾個不同的製備物，進行了幾次操作。所得結果在圖1A中給出(序列A至D)。還對粗製備物中存在的100KDa蛋白質測定了胺基酸序列，所得數據列於圖1C中。該序列明顯表明與由黑麴黴分離出來的酸性磷酸酯酶是同系(MacRae等人，基因，(1988)71，339-348)。B.內胺基酸序列的測定用溴化氰進行蛋白質斷裂通過超濾(微型濃縮器Centricon30，Amicon)把純化至呈同系的植酸酶轉移到100mMNaHCO3中。接著將蛋白質冷凍乾燥，並溶於70%三氟乙酸(V/V)中，並在約過量摩爾數為300倍的CNBr存在的條件下培養6小時。通過加水稀釋該混合物使反應終結。將得到的片段再次冷凍乾燥。然後，將樣品溶於含有DTT(二硫蘇糖醇)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)樣品緩衝液中，通過PAGE測定出斷裂的程度。分析PAGE在PharmaciaPhast-Systemunit上，在20%SDS-PAGE凝膠上進行。對該凝膠進行預運行，以產生連續的緩衝液體系來改進小肽的分離(按指南)。用本領域公知的銀-著色技術檢測肽，因為考馬斯(Coomassie)亮蘭不能檢測到最小的肽。上述步驟的結果是使植酸酶完全降解為肽，其分子量＜2.5KDa、36KDa、57KDa和80KDa。通過SDS-(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)-PAGE將肽離析用於氣相排列順序，如Scnagger和Jagow(1987)分析生物化學(Anal.Biochem.)166，368-379所述，接著進行如上述的電吸印。57KDa片段的N-末端與Ullah(1988b，Supra)測定植酸酶的N-末端相同，例外的是不存在頭四個胺基酸(圖1A，序列D)。2.5KDa和36KDa肽的N-末端序列如圖1B所示，為序列A和B。C.低聚核苷酸探針基於圖1A和1B中給出的胺基酸序列，設計低聚核苷酸探針，並使用應用生物體系ABI380BDNA合成儀進行製備。圖2A和2B給出了這些低聚核苷酸。實施例4基因組吸印(genomicblots)和基因組庫(genomicli-braries)與第一套低聚核苷酸探針的雜交作用採用標準步驟(例如Yelton等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci-U.S.A，1470-1474)、通過在液氮中研磨菌絲體，從A.ficuum中分離出基因組DNA。在噬菌體載體λEMBL3上，按照標準技術(例如，Maniatis等人(1982)「分子克隆，實驗室指南」，ColdSpringHarbor實驗室，NewYork)，使用A.ficuumNRRL3135染色體DNA的Sau3A部分消化液建立基因組庫。如此得到的基因組庫含有60-70倍的A.ficuum基因組。在不通過雜交作用插入λEMBL3填充片段的條件下，檢測該基因組庫的噬菌斑是否存在。觀察到少於1%的噬菌斑與λEMBL3探針雜交。插入物的大小為13-17kb。為確定適於篩選基因組庫的條件和探針用一些限制性酶消化基因組DNA，將之在瓊脂糖凝膠上分離，並使用生產廠家的說明書將其吸印在基因篩正面。該吸印與所有低聚核苷酸探針雜交。採用嚴緊性的變化條件(6×ssc，40-60℃用於雜交;直到0.2×ssc，65℃用於洗滌)進行雜交。選擇探針1068和1024(圖2A)來篩選基因組庫，儘管不能鑑定出有與兩個探針專門雜交的普通的DNA，但是酸性磷酸酯酶探針1025(圖3)給出一種特別的而且不連續的雜交標記，因此該探針被選定用於篩選基因組庫中的酸性磷酸酯酶基因。使用全部三個探針，則可以鑑定出基因組庫中的雜交噬菌斑。對應於探針1025(酸性磷酸酯酶)的雜交標記即強又具有重現性。使用探針1024和1068(植酸酶)觀察到雜交標記的強度有變化。沒有觀察到兩種系列之間有交叉雜交。對所有三個系列的噬菌斑重新篩選，並從8個單一的，確定的雜交噬菌斑中分離出DNA(Maniatis等，Supra)。在每一系列中，可以鑑定出具有同一雜交片段的克隆，表明所述克隆的插入物相互有關且可能在同一基因組DNA區上重疊。再者，使用兩種植酸酶系列(探針1024和1068)證明沒有交叉雜交，表明儘管從蛋白質的N-末端胺基酸序列得到了用於分離兩種克隆系列所使用的兩種探針，但是不同基因組的DNA片段已經得到確定。所有三種克隆系列都與從誘導和非誘導菌絲體(實施例6)中分離出來的含有mRNA的Northern吸印雜交。酸性磷酸酯酶特別克隆以及從這些克隆中分離出的內3.1kbSalⅠ片段只與誘導mRNA樣品雜交。由酸性磷酸酯酶特別探針鑑定出的mRNA長度約為1800b，這與蛋白質的已知尺寸相符(68KDa，Ullah和Cummins(1987)Prep.Biochem.17，397-422)。無法確證植酸酶特別克隆與特別mRNA克隆有雜交作用，我們由此可以作出結論，上述方法在編碼植酸酶基因的克隆中是不成功的。還可以進一步作出結論，這一失敗並非由所用的方法所導致，因為該方法已成功應用於鑑定編碼酸性磷酸酯酶基因。含有酸性磷酸酯酶基因的λ克隆於1989年4月24日在theCentraalBureauVoorSchimmel-cultures.Baarn.TheNetherlands保藏，保藏號為CBS214·89。從噬菌體Z1中分離出10kbBamHI片段，並在PUC19中亞克隆，該亞克隆含有全部編碼酸性磷酸酯酶基因。該亞克隆PAF1-1(圖5)於1989年4月24日保藏，保藏號為CBS231.89。實施例5使用第二套低聚核苷酸探針分離編碼植酸酶基因使用由CNBr產生的片段的N-末端胺基酸序列設計出探針(圖2B，探針1295、1296和1297)，並與上述的基因組DNA雜交。通過基因組吸印與探針的Southern雜交作用對使用這些探針分離編碼植酸酶基因的可行性再次進行了研究。這次，儘管探針是由非重疊區衍生出的，但是使用所有三種探針都能鑑定出相應長度的雜交片段。發現新的一套探針與使用第一套探針分離出的克隆(實施例4)之間沒有雜交作用。因而，使用所有三種探針在獨立的試驗中，對基因組庫重新篩選。由各個單獨探針分離出的克隆的子集(λAF201、219、241和243)也與其它兩種探針雜交，表明在這種情況下，使用該三種不同探針從單一基因組區中分離出了克隆。對新分離出的克隆與探針1024和1068的雜交進行了多次試驗。在兩種情形中，在兩種探針與已成功地與用這些探針分離出的克隆雜交的條件下(見實施例4)，沒有觀察到與新分離的克隆有雜交作用。這證明新分離出的克隆與純化過的植酸酶的N-末端衍生出的探針不是同系。與所有三種探針(1295-1297)都雜交的λEMBL3-克隆命名為λAF201(圖4)，並於1989年3月9日保藏，保藏號為CBS155.89。λAF201的5.1kbBamHI片段(在PUC19中的亞克隆，稱為PAF2-3，見圖4)與所有三種低聚核苷酸探針都能雜交。它常是Northern吸印的探針。在這種情況下，鑑定出尺寸為1800鹼基的不連續的mRNA。這種mRNA只在誘導菌絲體中發現。當使用低聚核苷酸作探針時，得到了相似的結果。因而使用新的一套探針鑑定出普通DNA片段，該片段專門與誘導mRNA雜交。這種長度為(1800b)的mRNA足以用於約60KDa蛋白質的編碼，後者長度大約是非糖基化蛋白質的尺寸。明顯的是，分離的片段至少含有部分編碼植酸酶基因。實施例6「誘導」和「非誘導」mRNA的分離從文獻中得知，由A.ficuum合成植酸酶要經過磷酸基決定的嚴格的規則(Han和Callagher(1987)工業微生物雜誌(J.Indust.Microbiol.1，295-301)。因而，可以認為分離基因要受相似規則的證明，就支持所感興趣的基因已克隆的證據。為便於分離已在生產和非生產條件下合成的mRNA，按如下所述，使A.ficuumNRRL3135生長。首先，孢子先在非誘導介質中生長一夜。第二天，採集菌絲體，用無菌水洗滌，並在誘導或非誘導介質中接種。所用的介質含有(每升)20g玉米澱粉、7.5g葡萄糖、0.5gMgSO4·7H2O、0.2gFeSO4·7H2O和7.2gKNO3。為使植酸酶誘導，向介質中加入高達2g/l玉米浸泡液，而非誘導介質含有2g/LK2HPO4。菌絲體至少再生長100小時。按選定的時間間隔採取樣品。隨後用植酸酶測定產生的植酸酶，如實施例2A所述。通過電泳分離出變性mRNA，並吸印在基因篩正面。將該吸印與P32標記的PAF2-3或與在實施例4中從PAF1-1(酸性磷酸酯酶)中分離出的3.1kbSalⅠ片段雜交。結果見表2。僅當細胞是在誘導合成植酸酶和酸性磷酸酯酶的已知條件下生長時，觀察到植酸酶特別的5.1kbBamHI片段和酸性磷酸酯酶特別的3.1kbSalⅠ片段與分離的mRNA確實有雜交作用。從這些結果已得出結論，分離的基因是按照預期的植酸酶和酸性磷酸酯酶調整的。表2Nortnern吸印的雜交使用植酸酶特別的5.1kbBamHI片段(A)或酸性磷酸酯酶特別3.1kbSalⅠ片段(B)作探針，+表示存在1800b植酸酶mRNA或1800b酸性磷酸酯酶mRNA。對24小時樣品測定其相關的植酸酶活性誘導培養物比非誘導培養物的植酸酶活性高10倍。接種後誘導非誘導時間A24小時+-B24小時+-實施例7植酸酶基因克隆的證據為得到成功分離編碼植酸酶基因的確切證據，以及為研究提高克隆基因表達的可行性，將植酸酶基因在適宜的載體中亞克隆，並轉移至黑麴黴402(A.niger402)(ATCC9092)。所以，從λ克隆AF201中分離出呈10kbNruI片段的植酸酶基因，並在含有ble基因(具有腐草黴素抗性)作選擇標記物的載體PAN8-1(Mattern，I.E.和Punt，P.J.(1988)FungalGeneticsNewsletter35，25)的StuI位中克隆。將產生的表達體(Construct)命名為PAF28-1(圖4)，並按實施例9中所述的方法將其轉移至黑麴黴402中，與所述方法不同的是，原生質體沉積在Aspersillus最低限度培養介質上，該介質有30μg腐草黴素/ml的輔助成分，並用0.75%瓊脂固化。將單一轉移物純化、分離並在搖瓶上做製備試驗，如實施例1和2所述，作為對照，也試驗了只含有載體的轉移物以及未經轉移的寄主(表3)。只有含有PAF28-1的黑麴黴402表現出生成植酸酶，後者與直接抗A.ficuum植酸酶的特殊單克隆抗體發生反應。與該單克隆抗體反應的植酸酶可以從PH值為2.5的免疫親和柱上洗脫，並在分子量、糖基化程度、等電點和對A.ficuum植酸酶的比活性方面表現出同一性。這一發現，提供了下述結論的清楚證據，即轉移有PAF28-1的黑麴黴402細胞表達了植酸酶，後者實際上與A.ficuum植酸酶相同。在對照細胞的兩種類型中，都觀察到相似的表達。表3菌株在誘導條件(實施例6)下生長。在生長96小時後取樣。實施例8植酸酶基因的特徵測定通過使用多種限制性酶進行消化，分析含有植酸酶基因的λ克隆。圖4給出了包括植酸酶基因的基因組區域圖。在克隆載體PUC19中，將確定的限制性片段亞克隆，如圖4所示。如上述(實施例5)，在PAF2-3中存在的5.1kbBamHI片段至少包括部分植酸酶基因。然而，前面還看到，低聚核苷酸探針1295和1297(圖2B)與從PAF2-7(PAF2克隆的位置示於圖4)中得到的SalⅠ插入物雜交，而探針1296可能跨越PAF2-6和PAF2-7中片段間的SalⅠ位置。這些實驗的結果表明，植酸酶編碼序列位於PAF2-3的BamHI插入物的左側。然後，使用二脫氧鏈終止方法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)和Messing等(1981，Nucl.AcidsRes.9，309-321)所述的彈槍式實驗法，對質粒PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的插入物的核苷酸序列進行了全面測定。此外，在排列順序的過程中，基於得到的核苷酸序列的資料合成了特殊的低聚核苷酸。包括染色體植酸酶基因座位的克隆PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的全部核苷酸序列彙編於圖6，圖7給出了圖示代表。對全序列的蛋白質編碼容量的分析揭示了成熟蛋白質的N-末端胺基酸序列是從核苷酸381位開始編碼(Ullah公開的N-末端位於369位)。更進一步的說，發現36KDa和2.5KDa內肽片段的N-末端胺基酸序列(見圖1B-序列B和A)分別在核苷酸的1101和1548位編碼。開放解讀密碼終止於核苷酸的1713位。這些發現清楚地證明特徵染色體位置是含編碼植酸酶DNA序列的同一物。在編碼成熟的植酸酶蛋白質的染色體序列的正上遊，在與成熟蛋白質開放解讀密碼相接的開放解讀密碼中沒有發現ATG起始密碼子，但是使用內含子-外顯子邊界特性，可以假定在核苷酸的254和355位之間有一內含子，在帶成熟植酸酶編碼解讀密碼的密碼中的核苷酸210位有ATG密碼子。由該N-末端擴展衍生的胺基酸序列完全符合VonHeyne(1983，Eur.J.BioCnem.133，17-21)公開的分泌標記序列的規則。為了驗證這些假說，由特殊的植酸酶引物和將全體mRNA/cDNA群作模板通過PCR-放大作用將植酸酶cDNA按下面所述的方法分離出來。從Aapergillusficuum中分離多聚A+RNA從在如實施例6中的誘導條件下生長的A.ficuumNRRL3135中分離出全部RNA。將乾燥菌絲體用液氮冷凍並研磨。然後，在3MLiCl、6M尿素中在0℃將該粉末在Ultra-Turrax上進行均化(全速進行一分鐘)，並在4℃保持一夜，如Auffrey和Rougeon(Eur.J.Biochem.，107，303-314，1980)所述。在以16000g離心力下離心30分鐘並用苯酚∶氯仿∶異戊醇(50∶48∶2)連續進行兩次萃取後獲得了全部細胞的RNA。用乙醇使該RNA沉澱，並溶於1ml的10mMTris-HCl(PH7.4)、0.5%SDS中。為選擇多聚A+，將全部RNA樣品在60℃加熱5分鐘，調整到0.5MNaCl，然後施用於低聚(Oligo)(dT)-纖維素柱中。經含有10mMTris-HClPH7.4、0.5%SDS和0.1MNaCl溶液的幾次洗滌後，用10mMTris-HClPH7.4和0.5%SDS洗脫，收集到多聚A+RNA。mRNA/cDNA複合體的製備為合成第一cDNA鏈，將5μg的多聚A+RNA溶於16.5μlH2O中，並加入以下成份2.5μlRnasin(30U/μl)、10μl含50mMTris-HClPH7.6、6mMMgCl2和40mMKCl的緩衝液;2μl1MKCl;5μl0.1MDTT;0.5μlOligo(dT)12-18(2.5mg/ml);5μl8mMdNTP-mix;5μlBSA(1mg/ml)和2.5μlMoloneyMLV反轉錄酶(200U/ml)。將混合物在37℃培養30分鐘，通過加入10μl0.2MEDTA和50μlH2O使反應終止。用氯仿進行萃取，在離心後，向上清液中連續加入110μl5MNH4AC和440μlC2H5OH。在乾冰/C2H5OH溶液中進行mRNA/cDNA複合體的沉澱30分鐘。通過離心收集mRNA/cDNA，然後用70%冰冷C2H5OH洗滌並溶於20μlH2O中。植酸酶cDNA片段的克隆cDNA編碼植酸酶序列的分離是通過兩個片段中的聚合酶鏈反應(PCR)來實現的。基於如圖6所示的基因組的植酸酶序列設計了4個合成的低聚核苷酸引物。Oligo1:5＇-GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA-3＇Oligo2:5＇-AGT.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG-3＇Oligo3:5＇-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC-3＇Oligo4:5＇-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.GTT.TAA.AGG.G-3＇Oligo1含有植酸酶ATG起始密碼子(210位至231位)下遊的核苷酸序列，位在5′側面，由EcoRI部位鄰接;Oligo2含有SalI部位(1129位至1109位)上遊緊鄰的核苷酸序列，也由附加的EcoRI部位相接;Oligo3含有繞BamHI部位(845位至865位)的核苷酸序列和Oligo4含有位於植酸酶結尾密碼子下遊(1890位至1867位)的核苷酸序列，由附加的PstI部位相接。按Taq-聚合酶供應廠商(Cetus)，進行聚合酶鏈反應。使用含有mRNA/cDNA雜種(如上面所述)的溶液(1.5μl作為模板，並以各為0.3μg的Oligo1和2作為放大N-末端植酸酶cDNA部分的反應中的引物，以各為0.3μg的Oligo3和4作為放大C-末端植酸酶cDNA部分的反應的引物(見圖8)。在變性(在100℃7分鐘)和加入2μTaq-聚合酶後，該反應混合物在PerKin-Elmer/Cetus的DNA-放大器中經受25個放大循環(各為在55℃2′，在72℃3′，在94℃1′)。在最後的循環中，省出了變性步驟。在消化作用後(對N-末端cDNA部分由EcoRI，對C-末端cDNA部分由BamHI和BstI在適宜的PTZ18R(Promega)位置上將兩種cDNA片段克隆。採用二脫氧鏈末端技術(Sanger，supra)，對得到的兩種PCR片段測定核苷酸序列，在染色體植酸酶基因序列後使用設計的合成低聚核苷酸作引物，使用全部放大的DNA以及克隆cDNA片段做模板。在圖8中給出了對植酸酶蛋白質進行編碼的cDNA區的序列和植酸酶蛋白質衍生胺基酸序列。cDNA序列驗證了上面假設的內含子的取位，並且表明在染色體基因序列中不存在其它內含子。植酸酶基因對467胺基酸(MW51091)的初級轉譯產物進行編碼;通過斷裂標記肽處理初級轉譯產物就得到了444(MW48851)或448(含有如Ullah公開的頭四個N-末端胺基酸，MW49232)胺基酸的成熟植酸酶蛋白質。實施例9通過引入附加植酸酶基因組DNA複製品在Aspergilli中對植酸酶的過表達建立表達載體PAF2-2S採用標準生物學方法，做出全部表達體，如Maniatis等分子克隆、實驗室指南、(ColdSpringHarborLaboratory、N.Y.)所述。通過在PUC19的SmaI位置將植酸酶基因組的克隆λAF201的6kbPvuⅡDNA片段亞克隆製備出表達載體PAF2-2S。衍生的質粒命名為PAF2-2(圖4)。作為向Aspergillus轉化的選擇標記，在PAF2-2的EcoRI/KpnI位置插入含有同系的AspergillusnidulansamdS基因的質粒PGW325的EcoRI/KpnIDNA片段(WernarsK.(1986)，學位論文，農業大學，TheNetherlands)得到的表達載體命名為PAF2-2S，並示於圖9。A.在A.ficuumNRRL3135中植酸酶的過表達採用的轉化方法是在A.ficuumNRRL3135中引入質粒PAF2-2S，如Tilburn，J.等(1983)基因26，205-221以及Kelly，J.和Hynes，M.(1985)EMBOJ.，4，475-479所述，其中有以下修改-在添加有10mM精氨酸和10mM脯氨酸的Asperillus最低限度培養介質(Cove，D.(1966)Biochem.Biophys.Acta113，51-56)中，在30℃，在轉速為300rpm的搖瓶上將菌絲體生長16小時;-只有Novozym234(NovoIndustri)而沒有helicase用於生成原生質體;-在原生質體形成90分鐘後，在原生質體懸浮液中加入1體積的STC緩衝液(1.2M山梨糖醇，10mMTris-HClPH7.5，50mMCaCl2)，並在浮桶式轉頭離心機上，在4℃以2500g離心力離心10分鐘。洗滌原生質體並在STC緩衝液中以108細胞/ml的濃度重新成為懸浮液;-在TE緩衝液(10mMTris-HClPH7.5，0.1mMEDTA)中，以10μl的體積添加質粒DNA，直至成為100μl的原生質體懸浮液;-在0℃將DNA-原生質體懸浮液培養25分鐘後，滴加200μl的PEG溶液(25%PEG4000(Merck)、10mMTris-HCl、PH7.5、50mMCaCl2)。然後，緩慢加入1mlPEG溶液(60%PEG4000在10mMTris-HClPH7.5，50mMCaCl2中)，用試管反覆混合。在室溫條件下培養後，用STC緩衝液稀釋該懸浮液，通過翻轉進行混合，並在4℃以2000g的離心力離心10分鐘。將原生質體在200μlSTC緩衝液中輕輕地重新懸浮，並沉積在以10mM乙醯胺為唯一氮源並含有15mMCsCl、1M蔗糖的Aspergillus最低限度培養介質上，用0.75%細菌學瓊脂＃1(Oxoid)固化。在33℃條件下生長進行6-10天。對命名為sp4、sp7和sp8的單一轉化物進行分離、純化並在搖瓶中測試其植酸酶產量，採用在實施例1和2中所述的方法。作為對照，對只含有載體(amds基因在PUC19中)以及未轉化的寄主也進行了測試。菌株在誘導條件下生長(見實施例6)，並在生長進行96小時後提取樣品。通過測定植酸酶活性(表4)和等電點聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳(IEF-PAGE)來進行分析。從A.ficuum和A.ficuumPAF2-2Ssp7的發酵物中提取相同體積的樣品，在同一條件下生長，並塗布在IEF-PAGE凝膠(PH4.5-6，phast體系，pharmacia)上。按生產廠家的說明書進行電泳。然後，或用一般蛋白質著色Coomasse亮蘭著色(圖10B)，或用一般磷酸酯酶活性著色法著色，如實施例2所述(圖10A)。純化至呈均一性(通過如實施例7所述的免疫親和色譜法)的A.ficuum植酸酶樣品，同樣或單獨或與培養物上清液混合在一起進行塗布。在多種樣品中植酸酶以數種異構體(以星號表示)存在，如本發明已經提到的。在採用兩種著色方法(A和B)的純化的植酸酶中在帶3和4中有明顯可見的兩種主要同功酶。在親代A.ficuum菌株中植酸酶帶免強可見，而在PAF2-2Ssp7轉化體菌株中有顯著的增強。表4通過A.ficuumNRRL3135的轉化增加植酸酶的產量菌株植酸酶活性(U/ml)A.ficuum0.6A.ficuum+對照質粒0.6A.ficuumPAF2-2Ssp87.6A.ficuumPAF2-2Ssp76.7A.ficuumPAF2-2Ssp44.3B.在黑麴黴CBS513.88.中植酸酶的過表達通過如對A.ficuum所述的轉化方法，將表達載體PAF2-2S也引入到黑麴黴CBS513.88中。將單一轉化物分離、純化並在搖瓶中在誘導生長條件下測試其植酸酶產量，如實施例6所述。對一些轉化物(命名為黑麴黴PAF2-2S＃8、＃20和＃33)和對照菌株的植酸酶表達值按如實施例9A所述進行，並示於表5。黑麴黴轉化物具有與A.ficuum轉化物相類似的植酸酶表達值。這一結果還表明A.ficuum植酸酶啟動基因在黑麴黴中是有活性的。通過在phast系統(Pharmacia)PH範圍為4.5-6的IEF-PAGE凝膠上進行電泳對轉化物PAF2-2S＃8的培養介質進行進一步的分析，如上面所述。將在相同條件下生長的、相同體積的黑麴黴親代菌株培養物上清液和轉化物PAF2-2S＃8，塗布在凝膠上。所述凝膠的操作和此後的著色如上面所述。親代黑麴黴生成的植酸酶的量很少，通過凝膠電泳不能檢測到。菌株PAF2-2S＃8生成約多90倍的植酸酶，這一差別在圖11中明顯可見。檢測到植酸酶的幾種異構體(由星號表示)。一般蛋白質著色表明，植酸酶蛋白質帶的強度有顯著的增強，並沒有出現其它主要蛋白質帶。表5通過用PAF2-2S轉化黑麴黴CBS513.88生產植酸酶菌株植酸酶活性(U/ml)黑麴黴0.2黑麴黴+對照質粒0.2黑麴黴PAF2-2S＃814黑麴黴PAF2-2S＃335黑麴黴PAF2-2S＃204實施例10植酸酶在由表達載體轉化的黑麴黴中的表達，所述的表達載體含有熔接在啟動基因和/或黑麴黴澱粉葡萄糖苷酶(AG)基因上的標記序列的A.ficuum植酸酶基因。表達載體的建立為了得到植酸酶在黑麴黴中的過表達，衍生出附加的表達盒，其中A.ficuum植酸酶基因受與不同標記序列組合在一起的黑麴黴澱粉葡萄糖苷酶(AG)啟動基因的控制。在P18FYT3和P24FYT3中，來自黑麴黴中的各自的AG基因18和24胺基酸(aa)前導序列熔接在編碼成熟蛋白質的植酸酶基因片段上。在表達盒PFYT3中，AG啟動基因序列熔接在包括植酸酶前導序列的植酸酶編碼序列上。P18FYT3的建立通過聚合酶鏈反應方法實現AG-啟動基因和18aaAG-前導序列在編碼成熟蛋白質的植酸酶序列上的熔接。在PCR反應中使用了兩種不同的模板含有如上所述的全部植酸酶基因的PAF2-2S和含有來自黑麴黴的全部AG-座位的質粒PAB6-1，後者是從黑麴黴質粒庫中分離出來的，它含有PUC19中的13-15kbHindⅢ片段。在分離過程中，使用了AG-特殊OligosAG-1:5＇-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3＇AG-2:5＇-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3＇兩種都是基於黑麴黴公開的核苷酸序列(Boel等(1984)EMBOJ.3，1097-1102;Boel等(1984)，Mol.andCell.Biol，4，2306-2315)。從圍繞內含子2的序列中衍生出的低聚核苷酸探針OligoAG-1位於內含子的3′，並且具有與AGmRNA相同的極性，OligoAG-2發現其位於內含子2的上遊並選擇為與AGmRNA反向平行。質粒PAB6-1在14.5kbHindⅢ片段上含有AG基因(見圖12)。作為PCR-放大作用的引物，設計了具有下述序列的四種合成低聚核苷酸Oligo1:5＇-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3＇(圍繞ATG初始密碼子上遊約250bpEcoRI位，有－AG-特殊序列)。Oligo18-2:5＇CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3＇成熟植酸酶Oligo18-3:5＇-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3＇18aaAG－前導物成熟植酸酶Oligo4:5＇-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3＇(取位在BamHI位置在861位的植酸酶特殊序列)如Saiki等，(1988)，科學239，487-491所述進行PCR，其中進行小的修改(見實施例8)。為將AG序列熔接在植酸酶編碼序列上，進行了兩個獨立的PCR第一反應以PAB6-1為模板，以Oligo1和18-2為放大含有AG啟動基因的3′一部分的300bpDNA片段及18aaAG-前導序列的引物，該序列在3′一側面與植酸酶基因的核苷酸連接，第二個反應以PAF2-2S為模板，以Oligo18-3和4為放大600bpDNA片段的引物，所述片段含有植酸酶基因的5′部分，該基因在5′一側面與AG標記肽的18核苷酸連接。圖13給出了這些放大作用的示意圖。通過凝膠電泳和C2H5OH沉澱純化產生的兩種DNA片段，並在三個PCR中將其用作模板，以Oligo1和4產生AG-植酸酶熔接的引物。用EcoRI和BamHI消化所得到的DNA片段，並將其亞克隆在PTZ18R中。所得到的熔接為排列順序並命名為P18FYT1。通過對PAB6-1由Kpn1並部分地由EcoRI消化得到了AG-啟動基因餘下的(3.5kb)上遊區，並將其接到P18FYT1的1.1kbEcoR1/BamHI片段上，然後克隆在PTZ18R的Kpn1/BamHI部位中。如此獲得的質粒P18FYT2示於圖15。通過在PAF2-2S的EcoRI-部位(位於amds-基因側面)中插入合成片段5＇AATTCAAGCTTG3＇3＇GTTCGAACTTAA5＇引入了附加的HindⅢ限制性部位。將所得的質粒命名為PAF2-2SH(圖14)，並用作通過PCRAG-植酸酶熔接DNA片段，以交換植酸酶啟動基因序列的起始質粒。對最後的建立步驟，用KpnI並部分地用BamHI消化P18FYT2和PAF2-2SH。將P18FYT2的4.6kbDNA片段和PAF2-2SH的11kbDNA片段分離出來，並通過凝膠電泳純化，然後連接並轉移到E.Coli上。衍生的表達盒命名為P18FYT3(圖15)。P24FYT3的建立按上述建立P18FYT3的方法，通過PCR放大作用，進行AG-啟動基因和24aaAG前物序列熔接到成熟植酸酶編碼序列上，只是所用的引物有變化。合成了具有以下序列的兩種新引物Oligo24-2:5＇-CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3＇Ooigo24-3:5＇-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3＇進行兩個獨立PCR第一個反應用PAB6-1做模板，以Oligo1和24-2作為放大318bpDNA片段的引物，所述的片段含有AG-啟動基因的3′-部分和24aaAG前物序列，所述序列在3′側面由植酸酶基因的18個核苷酸連接，第二個反應以PAF2-2S作模板，以Oligo24-3和4作為放大DNA片段的引物，該片段含有植酸酶基因的5′一部分，該基因在5′一側面由24aaAG前物的18個核苷酸連接。圖13給出了這些放大作用的示意圖。為通過中間產物質粒P24FYT1和P24FYT2建立最終表達盒P24FYT3，使用了與所述的從P18FYT1和P18FYT2衍生出表達盒P18FYT3相同的克隆途徑/方法(圖15)。PFYT3的建立通過PCR-放大作用實現AG-啟動基因與植酸酶基因(包括植酸酶前物)序列的熔接，與上述建立P18FYT3的方法相同，只是所用的前物不同。製備出具有下述序列的兩個附加引物Oligofyt-2:5＇-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3＇Oligofyt-3:5＇CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3＇AG-啟動基因植物酶引物進行兩個獨立的PCR第一個反應以PAB6-1為模板，以Oligos1和fyt-2為放大282bpDNA片段的引物，該片段含有AG啟動基因的3′一部分，所述的啟動基因在3′一側面由植酸酶引物的18個核苷酸連接，第二個反應以PAF2-2S為模板，以Oligosfyt-3和4為放大DNA-片段的引物，該片段含有植酸酶基因(包括植酸酶前物)的5′一部分並且在5′一側面由AG-啟動基因的18個核苷酸連接。圖13給出了這些放大作用的示意圖。為了通過中間產物質粒PFYT1和PFYT2建立最終表達盒PFYT3，使用了與從P18FYT1和P18FYT2衍生出表達盒P18FYT3相同的克隆途徑/方法(圖15)。受黑麴黴中AG啟動基因控制的植酸酶基因的表達通過HindⅢ消化從植酸酶上述的表達盒中除出E.Coli序列之後，按照實施例9所述的方法由10μgDNA片段對黑麴黴菌株CBS513.88(保藏日1988年10月10日)進行轉化。從每個表達盒中分離出單一的黑麴黴轉化物，將孢子在選擇性乙醯胺-瓊脂板上劃線。從細胞中收集每種轉化物的孢子，所述的細胞在0.4%土豆-右旋葡萄糖(OxoidEngland)瓊脂板上在37℃條件下生長3天。在下述生長條件下在搖瓶上測試植酸酶的產量將約1×108個孢子在100ml預培養介質中接種，所述的介質含有每升1gKH2PO4;30g麥芽糖;5g酵母提取物;10g酪蛋白-水解產物;0.5gMgSO4·7H2O和3gTween80。其PH調整至5.5。在旋轉振動器上在34℃生長一夜後，將1ml生長培養物接種在100ml主培養介質中，所述的培養介質含有(每升)2gKH2PO4;70g麥芽糖糊精(MaldexMDO3，Amylum);12.5g酵母一提取物;25g酪蛋白-水解產物;2gK2SO4;0.5gMgSO4·7H2O;0.03gZnCl2;0.02gCaCl2;0.05gMnSO4·4H2O和FeSO4。其PH調節至5.6。該菌絲體至少生長140小時。按實施例2所述測定植酸酶產量。表6所示為從每種表達盒得到的幾種隨機轉化物的產量結果。表6由含A.ficuum植酸酶基因的質粒，在黑麴黴AG-啟動基因與不同前物序列組合控制下，對幾種黑麴黴CBS513.88菌株進行轉化的植酸酶製備。表達盒轉化物植酸酶活性(U/ml)P18FYT3＃24082P18FYT3P18FYT3＃24284(AG-啟動基因/P18FYT3＃2436218aaAG-前物)P18FYT3＃24443P18FYT3＃24580P18FYT3＃24682P18FYT3＃250110P24FYT3＃2568P24FYT3＃25730P24FYT3P24FYT3＃25813(AG-啟動基因/P24FYT3＃2593324aaAG-前物)P24FYT3＃26017P24FYT3＃26128P24FYT3＃26218P24FYT3＃26512PFYT3＃20550PFYT3＃282280PFYT3PFYT3＃29996(AG-啟動基因/PFYT3＃302220植酸酶前物)PFYT3＃303175PFYT3＃304150PFYT3＃305150PFYT3＃312140從該數據清楚地表明，在含植酸酶基因的黑麴黴轉化物中，在黑麴黴啟動基因的控制下，植酸酶的表達值很高。從數據中還看出，從PFYT3表達載體獲得了最高植酸酶產量，所述的載體含有植酸酶前物序列。含有無內含子植酸酶基因的相似表達載體在轉化至黑麴黴後，得到了與黑麴黴PFYT3轉化物相當的植酸酶表達值。還有，對轉化物PFYT3＃205和＃282的培養物上清液在IEF-PAGE凝膠上，以PH4.5-6進行了電泳。將在相同條件下生長的、相同體積的黑麴黴親代菌株培養物上清液和兩種轉化物塗布在凝膠上，操作和以後的著色如實施例9所述。親代黑麴黴產生的植酸酶的量少，在本實驗中不能檢測出來。菌株PFYT3＃205和＃282產生的植酸酶多約250和1400倍(與表4和5的植酸酶值相比)，這一差別在圖11中清楚可見。檢測到植酸酶的幾種異構形式(以星號表示)。一般蛋白質著色表明，植酸酶蛋白質帶的強度有明顯增強，同時也沒有其它主要蛋白質帶出現。實施例11植酸酶在以工業規模生長的A.ficuum和黑麴黴中的過表達A.A.ficuum按實施例1所述生長菌株A.ficuumPAF2-2S＃4和A.ficuumNRRL3135。與野生型菌株相比，該轉化物產生的植酸酶約多50倍。表7通過含多植酸酶基因的A.ficuum的轉化物對植酸酶的過表達。細胞的生長如實施例1所述。接種後植酸酶活性(U/ml發酵液)小時A.ficuumNRRL3135A.ficuumPAF2-2S＃400024009221421415270B.黑麴黴菌株黑麴黴PAF2-2S＃8、黑麴黴菌株CBS513.88的轉化物和親代黑麴黴菌株自身按實施例1所述方法進行生長。與原始黑麴黴親代菌株相比，轉化物生成的植酸酶約多1000倍(表8)。表8通過含多植酸酶基因的黑麴黴的轉化物對植酸酶的過表達。細胞的生長按實施例1所述的方法。接種後植酸酶活性(U/ml發酵液)小時黑麴黴CBS513.88黑麴黴PAF2.2＃80002405920.1651410.195實施例12為了建立載體PREPFYT3，通過該載體可獲得同步植酸酶表達和AG基因置換，將PFYT3用KpnI消化。得到的線性KpnIDNA片段，實現兩個獨立的連接。通過KpnⅠ-HindⅢ連接物的連接15＇－CGGGGA-3＇3＇-CATGGCCCCTTCGA-5＇KpnIHindIII通過KpnⅠ-HindⅢ＊連接物的連接2，其中HindⅢ限制性部位在連接後不再恢復5＇-CGGGGG-3＇3＇-CTAGGCCCCCTCGA-5＇KpnIHindIII*隨後，由HindⅢ對連接1進行部分消化。通過凝膠電泳除去含amdS片段後，將餘下的DNA片段通過連接進行重新成環，並轉移至E.Coli中。所得到的質粒用PFYT3amdS表示(見圖16)。對連接2也用HindⅢ進行消化，通過凝膠電泳將含amdS基因的4kbDNAHindⅢ/HindⅢ＊片段分離出來，然後將其連接到由HindⅢ部分消化的PFYT3amdS上，並轉移到E.Coli中。在植酸酶基因的3′端含amdS基因的質粒用PFYT3INT表示(見圖17)。為了將含3′-側面AG序列的PAB6-1的約6kbSalⅠ/HindⅢDNA片段引入，將PFYT3INT用HindⅢ進行部分消化，先連接到連接物5＇-AGCTAGGGGG-3＇3＇-TCCCCCCAGCT-5＇HindIII*SalI(其中HindⅢ＊限制性部位在連接後不再恢復)上，然後與PAB6-1的SalⅠ/HindⅢ片段連接。在轉化至E.Coli後，就獲得所需要的在正確位置上含有3′AG側面序列的質粒PREPFYT3(圖18)。通過AG基因置換，植酸酶在黑麴黴中的表達在用PREPFYT3轉化黑麴黴之前，通過HindⅢ消化和凝膠電泳將質粒中的E.Coli序列除去。採用實施例9所述的方法用10μgDNA片段對黑麴黴菌株CBS513.88進行轉化。轉化物的選擇和生產按實施例9所述的方法。只有稀少的選擇轉化物失去AG活性(約20%)。在AG負和植酸酶正轉化物上進行染色體DNA的Soutern分析，以驗證AGA基因確實被植酸酶基因取代。實施例13植酸酶基因在不同菌種中的保藏為了確定在微生物種中植酸酶基因是否能完好保藏，用A.ficuum植酸酶cDNAR作探針，對來自10個不同種的染色體DNA進行Soutern分析。這些染色體DNA分析在來自線狀真菌、酵母和細菌的種上進行。例如，從每組中只選出有限的數種對線狀真菌，黃青黴和黑麴黴;對酵母，啤酒酵母和Kluyveromyceslactis;對原核生物格蘭氏-陽性種，枯草桿菌、clostridumthermocellum和Streptomyceslividans以及舉例來說對格氏陰性細菌綠濃桿菌。對來自這些種的高分子量染色體DNA由PvuⅡ和BamHI分別進行消化，然後在0.7%瓊脂糖凝膠上進行電泳。在轉移到硝化纖維素過濾器中後，在低強度下(6×ssc;50℃)與32P-標記5′-植酸酶cDNA片段進行一夜的雜交(如實施例8所述)。在室溫將吸印在6×ssc中洗滌，並在X-光下曝光18小時。如圖19a和b所示，在幾乎每一通道上都可觀察到不連續的帶，預示在微生物種中植酸酶基因有高度的均一性。權利要求1.一種經純化並分離出的DNA序列，其特徵在於所述的DNA序列能對具有植酸酶活性的肽和蛋白質編碼。2.如權利要求1所述的經純化並分離出的DNA序列，其特徵還在於所述的序列是從微生物源中衍生出來的。3.如權利要求1所述的經純化並分離出的DNA序列，其特徵還在於所述的序列是從真菌源中衍生出來的。4.如權利要求1所述的經純化並分離出的DNA序列，其特徵還在於所述的序列是從麴黴源中衍生出來的。5.如權利要求1所述的經純化並分離出的DNA序列，其特徵還在於所述的序列是從Aspergillusficuum或黑麴黴源中衍生出來的。6.如權利要求1所述的經純化並分離出的DNA序列，所述的序列對表現出如下特徵的植酸酶進行編碼a)當在麴黴寄主中進行表達時，在SDS-PAGE上具有在85KDa處的單一帶;b)在去糖基化後表觀分子量的範圍為約48-56.5KDa;c)具有約100U/mg蛋白質的比活性。7.一種經純化並分離出的DNA序列，其特徵在於所述的序列至少表現出一種下述特徵a)與低聚核苷酸探針雜交，所述的探針是從如圖6中公開的DNA序列衍生出的;b)與低聚核苷酸探針雜交，所述的探針是從圖8中公開的cDNA序列衍生出的。8.一種表達體，其特徵在於將權利要求1-7所述的任一種DNA序列與調節區實現連接，所述的調節區能直接表達在適宜的表達寄主中具有植酸酶活性的蛋白質或肽。9.如權利要求8所述的表達體，其特徵還在於調節區還含有分泌前物序列，所述的序列用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。10.如權利要求9所述的表達體，其特徵在於使用AG啟動基因直接表達具有植酸酶活性的蛋白質或肽。11.如權利要求10所述的表達體，其特徵還在於使用同系的植酸酶前物序列，用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。12.如權利要求10所述的表達體，其特徵還在於使用18胺基酸AG前物序列用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。13.如權利要求10所述的表達體，其特徵還在於24胺基酸AG前物序列用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。14.如權利要求9所述的表達體，其特徵在於使用同系植酸酶啟動基因來直接表達具有植酸酶活性的蛋白質或肽。15.如權利要求14所述的表達體，其特徵還在於使用同系植酸酶前物序列用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。16.如權利要求14所述的表達體，其特徵還在於使用18胺基酸AG前物序列用於具有植酸酶活性經表達的蛋白質或肽的分泌。17.如權利要求14所述的表達體，其特徵還在於使用24胺基酸AG前物序列，用於具有植酸酶活性的經表達的蛋白質或肽的分泌。18.一種能夠轉化寄主細胞的載體，其特徵在於所述的載體含有如權利要求8-17所述的任一種表達體。19.如權利要求18所述的載體，其特徵還在於所述的載體是質粒。20.如權利要求18所述的載體，其特徵還在於所述的載體是選自下述的組中的質粒，所述的組由PAF28-1、PAF2-2S、PAF2-2、PAF2-3、PAF2-4、PAF2-6、PAF2-7、P18FYT3、P24FYT3和PFYT3所組成。21.一種轉化寄主細胞，其特徵在於所述的寄主細胞由權利要求18-20所述的任一種載體進行轉化。22.如權利要求21所述的轉化寄主細胞，它從由細菌、酵母菌和真菌組成的組中選擇。23.如權利要求22所述的轉化的寄主細胞，它由麴黴、木黴菌屬、青黴菌、毛黴、芽孢桿菌屬、Kluyveromyces和酵母菌屬所組成的組中選擇。24.如權利要求22所述的轉化的寄主細胞，它選自下述的組，所述的組由黑麴黴、Aspergillusficuum、泡盛麴黴、米麴黴、Tricnodermareessi、Mucormiehei、Kluyveromyceslactis、釀酒酵母、枯草桿菌和地衣型芽胞桿菌組成。25.一種生產具有植酸酶活性的肽或蛋白質的方法，其特徵在於在指向生產所述具有植酸酶活性肽或蛋白質的條件下，培養如權利要求21-24的任一項所述的轉化的寄主細胞。26.一種具有植酸酶活性的肽或蛋白質，其特徵在於所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白質是通過如權利要求25所述的方法生產的。27.一種植酸酶，其特徵在於該植酸酶表現出如下特徵a)當在麴黴寄主中表達時，在SDS-PAGE上，在85KDa處具有單一的帶;b)在去糖基化後表觀分子量的範圍約為48-56.5KDa;c)比活性約為100U/mg蛋白質。28.一種用於動物的飼料，其特徵在於所述的飼料含有如權利要求26和27任一項所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白質。29.如權利要求26和27任一項所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白質，用於將植酸鹽轉化成肌醇和無機磷酸鹽的用途。30.一種促進動物生長的方法，其特徵在於飼餵動物的食物包括添加有如權利要求26和27任一項所述的植酸酶的飼料。31.一種降低動物糞便中植酸酶鹽值的方法，其特徵在於飼餵動物的食物包括添加有如權利要求26和27任一項所述的植酸酶的飼料，植酸酶的添加量為能有效的將飼料中所含的植酸鹽轉化成肌醇和無機磷酸鹽。全文摘要對一種編碼植酸酶的核苷酸序列進行了分離和克隆。將編碼序列插入表達體中，後者又被插入到能轉化微生物表達寄主的載體中。轉化的微生物寄主可以用於工業規模經濟地生產植酸酶。通過本發明生產的植酸酶可以用於多種需要將植酸鹽轉化成肌醇和無機磷酸鹽的方法中。文檔編號C12R1/685GK1051058SQ9010897公開日1991年5月1日申請日期1990年9月27日優先權日1989年9月27日發明者羅伯特·F·M·V·哥修穆,威廉·V·哈裡金思德,皮特勒斯·A·V·帕裡頓,阿尼瑪裡·E·伏恩思塔,魯道夫·G·M·尤坦,吉拉多斯·C·M·西爾坦申請人:吉斯特·布羅卡德斯股份有限公司