鋅診斷/測定試劑盒及鋅的濃度測定方法
2023-07-26 12:25:21 2
專利名稱：鋅診斷/測定試劑盒及鋅的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鋅診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鋅濃 度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
鋅與生物的生長發育有關。鋅具有重要的生理功能、營養作用和臨
床診療意義。測定血清鋅及Cu/Zn比值，對評價機體鋅的營養狀況和 對許多疾病的診療均具有重要的實用價值。
鋅的測定方法包括絡合滴定法、螢光光度法、比色法、極譜法、原 子吸收分光光度法、陽極溶出伏安法和中子活化法等。
結合滴定法耗時費力，標本用量大，特異性低。
螢光光度法操作簡單，但需螢光光度計。
比色法簡單、快速、靈敏度高，可得到原子吸收法近似的結果， 但是比色法操作複雜。常用的顯色劑與鋅絡合後在最大吸收峰的摩爾 吸光係數(L mo1—1 cm—')如下:1- (2-吡啶偶氮)-2_萘酚56 000; l-[ (5-氯-2-吡啶)偶氮]-2-萘酚69 000; 4- (2-吡啶偶氮)間苯二 酚84000; 2- (5_溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙基氨基酚120 000; 2- (5-溴-2-吡啶偶氮)-5- (N-n丙基-N-3-磺化丙氨基)酚130 000。比色 法一般都要先加鹽酸胍或三氯醋酸等使鋅及其它金屬離子從蛋白結合 物中釋放出來，再加氰化物作掩蔽劑，絡合除鋅以外的金屬，加水合
氯醛作暴露劑，又避免氰化物與鋅的絡合，使鋅能特異地與吡啶偶氮 酚類化合物反應顯色。
單掃描示波極譜儀屬小型儀器，操作簡便，特異性較好，有些實驗 室對此方法較滿意。
原子吸收分光光度法(AAS)具有特異性高(幹擾小)、檢出限低(樣 品量少)、精密度好(CV<3.6%=、回收率達到99%、準確度高等優點。 該法操作較比色法和螢光法簡單的多，但儀器價格昂貴，因它能最準 確地分析鋅含量而被推薦為測鋅的方法。
陽極溶出伏安法是利用沉積在電極上鋅溶出後，測其陽極電流強度 與鋅濃度成正比。
酶法操作最方便，易於自動化，價格低廉，特異性高，精密度好。 是非常適合國情的一種檢測方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續 監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定鋅濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的鋅 診斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行鋅濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因 而可以得到切實的推廣應用。
本發明鋅濃度測定方法原理如下
磷酸單酯+水 鹼性磷酸酶/Zn2+ .醇類+磷酸根
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶
這種方法應用需要鋅離子激活的鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase ; EC 3.13.1 )酶(偶)聯甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ; EC 1.2.1.59)醇f足反應 速率比色法。鹼性磷酸酶酶解磷酸單酯反應產生磷酸根，再通過(偶) 聯合甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還 原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上 升的速度，可以測算鋅的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明鋅診斷/測定
試劑盒較為理想
緩衝液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
磷酸單酯 20 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 3 mmol/L
鹼性磷酸酶 20000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
本發明的鋅診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括:酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l
緩衝液、穩定劑、輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸。
試劑2
緩衝液、穩定劑、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態， 在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸。
試劑2
緩衝液、磷酸單酯。
試劑3
緩衝液、穩定劑、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是幹 粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定鋅濃度的方法，其輔酶可
以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的鋅診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
磷酸單酯 20 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 3 mmol/L
鹼性磷酸酶 20000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑； 使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鋅樣品 與試劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鋅的濃 度大小。
實施例二
本實施例的鋅診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液
穩定劑
輔酶
磷酸單酯
甘油醛-3-磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液
穩定劑
鹼性磷酸酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 30000 U/L 18000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始
吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鋅樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，
延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鋅的濃
度大小。
實施例三
本實施例的鋅診斷/測定試劑為三試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 9 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L
磷酸單酯20 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑50 mmol/L
鹼性磷酸酶 50000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 32000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。
測定鋅濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鋅樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘 左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鋅的濃
度大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應 用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯法的鋅的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸單酯+水 鹼性磷酸酶/Zn2+ 醇類+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氧酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鋅的濃度大小測定結果。
2. —種鋅診斷/測定試劑盒，主要成分包括 緩衝液 20-500 mmol/L穩定劑 1-50 mmol/L輔酶 1-6 mmol/L磷酸單酯 1-50 mmol/L甘油醛-3-磷酸 1-6 mmol/L鹼性磷酸酶 1000——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用: 也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鋅診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鋅診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、 輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、 鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述鋅診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、 輔酶、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩衝液、磷酸單酯組成；試 劑3，由緩衝液、穩定劑、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。 輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述鋅診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鋅診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鋅濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、磷酸單酯、甘油醛-3-磷酸、鹼性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鋅的濃度大小。採用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101173931SQ20061009730
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司