高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法
2023-05-07 07:10:41 2
高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法
【專利摘要】木質纖維素原料酶解成本高是實現其生物轉化的主要障礙，極端嗜熱菌有獨特的木質纖維素酶系，對天然木質纖維素原料有強降解作用。本發明以木聚糖、秸稈等為底物誘導極端嗜熱菌產生木質纖維素酶系，提取胞內和胞外酶具有完備的半纖維素酶和纖維素酶系，能直接降解秸稈等原料，用胞內酶和胞外酶按一定比例混合後與商業化的纖維素酶協同酶解，半纖維素和纖維素的酶解率達到80％以上。本發明所提供的酶解方法可直接酶解天然木質纖維素原料，免去生物質預處理步驟，降低綜合生產成本以，避免了預處理過程產生的抑制物對對後續生物轉化的不利影響，清潔環保，沒有糖損失，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物質高效轉化領域，特別涉及一種高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法。
【背景技術】
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[0002]利用木質纖維素原料替代化石資源生產生物能源和化學品，是實現人類社會可持續發展的需要。然而，其生物轉化受到纖維素水解困難的限制，這是因為秸杆的主要成分(纖維素、半纖維素和木質素)緊緊地相擁在一起，形成木質素和碳水化合物複合體，是抗微生物降解的屏障。因此，木質纖維素轉化為可發酵糖，是利用可再生資源代替化石燃料滿足日益增長的能源需求的一個重大挑戰。酶法水解是最常見的纖維素和半纖維素降解成可發酵糖如葡萄糖和木糖的方法。目前，酶解過程的高成本是限制生物燃料和生物化學品工業化生產的主要障礙。尋找高效纖維素酶和半纖維素酶製劑同時開發高效的酶解方式是克服這一障礙的主要手段，已成為全球研宄的熱點之一。
[0003]許多極端嗜熱菌能夠利用各種碳水化合物相關的木質纖維素原料轉化為生物能源。這些極端嗜熱細菌產生的新穎而獨特的酶可能會給生物燃料和化學品的產生帶來新的機會。其中，熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)是迄今發現的最耐熱的一類生物質利用細菌，可以在較高溫度(70-90°C)下生長，迄今，熱解纖維素菌屬已經有 8 個種(C.saccharolyticus, C.bescii, C.0bsidiansis C.hydrothermal is, C.kristjanssonii, C.kronotskyensis, C.lactoaceticus, and C.0wensensis)在歐洲、北美洲、亞洲和澳洲等地先後被發現。Caldicellulosiruptor屬極端嗜熱菌由於它可以產生多樣化的糖苷水解酶水解木質纖維素，被認為具有廣泛的應用前景。生物信息學方法分析發現(Blumer et al., Journal of bacter1logy.2012)，Caldicellulosiruptor 基因組編碼106糖苷水解酶分布在43個糖苷水解酶家族。而且從其基因組中發現了許多纖維素酶和半纖維素酶基因簇。一些新穎高效且熱穩定高的木質纖維素酶已得到異源表達。特別是一些酶不僅有多個結構域，而且擁有多種催化功能，它們的結構和酶解方式不同於其餘兩個普通的纖維素酶系統:一個是產生游離的單個的纖維素酶和半纖維素酶，如真菌和大多數細菌產生的纖維素酶(Martinez, Nature B1technology 2008)，另一個是有多個水解酶自組裝到一個常見的蛋白質支架形成大分子聚合體，稱為纖維小體cellulosome (Bayer, AnnualReview of Microb1logy.2004)例如，C.bescii產生的一個複合纖維素酶CelA，包含一個第9家族糖苷水解酶和一個第48家族糖苷水解酶催化結構域，已發現該酶酶解纖維素的方式非常獨特，除了能以普通的酶解方式從表面切割酶解纖維素外，還能以挖掘深入到纖維內部進行酶解(Brunecky，Science.2013)。目前商業化的纖維素酶和半纖維素酶主要由真菌產生。由於Caldicellulosiruptor屬高溫菌能產生與真菌不同的纖維素酶系統，在酶解木質纖維素時，它們與真菌纖維素酶具有互補性，應用Caldicellulosiruptor屬的菌種高溫纖維素酶與商業化的真菌纖維素酶協同酶解將產生更好的酶解效率，因此具有潛在的商業應用價值。然而，其應用價值遠沒有被開發出來，目前主要是將其中的一些木質纖維素酶基因進行異源表達，並研宄了其酶學特性，沒有對不同底物誘導產生複合纖維素酶系作為整體與商業化纖維素酶協同作用進行研宄。本發明提供一種高效的以Caldicellulosiruptor屬產生的高溫木質纖維素複合酶與商業化維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法，具有工業化應用前景。
【發明內容】
[0004](—)本發明的目的
[0005]目前商業化的纖維素酶成本高，難以支撐生物質產品的大規模生產，尋找新的纖維素酶和酶解方式是解決這一問題的必然途徑。通過文獻調研結合我們研宄團隊的研宄成果，發現Caldicellulosiruptor屬微生物對天然木質纖維素原料有強降解作用，它們產生的木質纖維素酶具有獨特的性能，與目前商業化的纖維素酶很好的互補作用，協同酶解能大幅度提高酶解效率。秸杆等木質纖維素原料酶解製備可發酵糖需要多種酶的協同作用才能完成，其中纖維素的酶解需要纖維素內切酶、外切酶和葡萄糖苷酶協同完成，而半纖維素酶解需要木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶等協同作用才能完成，半纖維素酶和纖維素酶協同作用才能有效地將天然木質纖維素原料降解為可發酵糖，單個酶無法發揮作用。因此，本發明以不同底物誘導產生的木質纖維素複合酶(包括纖維素酶和半纖維素酶)為整體，與商業纖維素酶協同作用，降解天然木質纖維素原料或預處理過的木質纖維素原料，提高酶解效率，降低纖維素酶解成本。
[0006]( 二 )技術方案
[0007]高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法，包括以下步驟:
[0008]I)以0.1-2%的木質纖維素原料如秸杆，玉米芯木聚糖、甘蔗渣木聚糖、微晶纖維素、汽爆稻杆等為碳源，60-90 °C下利用培養20-30h的Caldicellulosiruptor屬極端嗜熱菌(C.saccharolyticus, C.bescii, C.0bsidiansis C.hydrothermal is, C.krist janssonii, C.kronotskyensis, C.lactoaceticus, C.0wensensis 其中的一個或多個)為種子液，厭氧發酵20-72h ;
[0009]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH5.0-7.6的緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH5.0-7.6的緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到0.5-2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0010]3)用步驟2)獲得的胞內和胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法包括以下2種:①用胞內酶、胞外酶單獨或胞內酶與胞外酶按照1:100-100:1 (w/w)的比例混合在60-85 °C下酶解天然或經過預處理的木質纖維素原料24-72h後，再加入商業纖維素酶製劑在50-55°C下酶解48_72h，得到可發酵糖；②用胞內酶、胞外酶單獨或胞內酶與胞外酶按照1:100-100:1的比例混合再與商業纖維素酶製劑混合在50-55°C下酶解天然或經過預處理的木質纖維素原料48-96h後，得到可發酵糖，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等。上述酶解過程中Caldicellulosiruptor屬菌種產生的木質纖維素酶用量為l_15mg/g幹底物，商業纖維素酶用量為5-30FPU/g幹底物。
[0011](三)本發明的優勢和創新性
[0012]木質纖維素的降解需要多種酶的協同酶解，其酶解效率取決於各個酶的『單兵作戰』能力和各個酶之間合適的比例。目前商業化纖維素酶對纖維素的降解能力較強，半纖維素的降解能力弱，木質纖維素原料必須經過預處理去除半纖維素才能達到較好的酶解效果，對天然原料或預處理不徹底的原料，酶解效果差。Caldicellulosiruptor屬菌種產生的木質纖維素酶包含完整的半纖維素酶和纖維素酶體系，對天然木質纖維素原料有強降解作用，但它們生產酶的能力不如真菌，單獨用它們生產的酶製備酶製劑，很難達到商業化的要求，利用它們產生的複合木質纖維素酶與真菌纖維素酶協同酶解，可直接將天然木質纖維素原料高效地降解為可發酵糖，免去酸、鹼、汽爆、離子液體等預處理步驟，沒有糖的損失，也沒有抑制物產生，為後續的發酵創造良好的條件。針對不同預處理方法和預處理程度不同，可調整Caldicellulosiruptor屬木質纖維素酶與商業纖維素酶的比例進行酶解，達到最佳的效果。
[0013]我們的研宄發現Caldicellulosiruptor屬菌種產生的木質纖維素酶，其胞內和胞外酶的分布差異很大，木聚糖酶、纖維素內切酶、外切酶主要分布在胞外，而木糖苷酶、β -葡萄糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶主要分布在胞內，本項目針對不同的原料將胞內酶和胞外酶以一定的比例混合後與商業纖維素酶協同酶解，達到經濟高效的酶解效果。這也是本發明的創新點。
【具體實施方式】
[0014]實施例1C.bescii以玉米芯為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解玉米秸杆
[0015]I)將在80°C下培養24h的C.bescii種子液按3%的接種量接種到以0.1%的粉碎玉米芯為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9g NH4Cl, 0.9g NaCl, 0.75gKH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img 刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80°C下厭氧發酵26h ；
[0016]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0017]3)用步驟2)獲得的胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞外酶(用量為10mg/g幹底物)在pH6.0的醋酸緩衝液中75°C下酶解天然玉米秸杆(酶解液固體量為l%，w/v)48h後，再加入夏盛實業集團有限公司生產的商業纖維素酶製劑(用量為10FPU/g幹底物)在50-55°C下酶解(酶解液固體量為3%，w/v)72h，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為81%，木聚糖的酶解率為83 %，阿拉伯聚糖酶解率為90 %。
[0018]實施例2C.0wensensis以汽爆秸杆為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解小麥秸杆
[0019]I)將在75°C下培養24h的C.0wensensis種子液按3 %的接種量接種到以0.1%的汽爆秸杆為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9g NH4Cl, 0.9g NaCl, 0.75gKH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img 刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80°C下厭氧發酵24h ；
[0020]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0021]3)用步驟2)獲得的胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞外酶(用量為15mg/g幹底物)在pH6.0的醋酸緩衝液中75°C下酶解天然玉米秸杆(酶解液固體量為l%，w/v)48h後，再加入夏盛實業集團有限公司生產的商業纖維素酶製劑(用量為10FPU/g幹底物)在55°C下酶解(酶解液固體含量為1%，w/v)72h，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為84%，木聚糖的酶解率為88 %，阿拉伯聚糖酶解率為94 %。
[0022]實施例3C.saccharolyticus以玉米芯木聚糖為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解汽爆玉米秸杆
[0023]I)將在80°C下培養24h的C.saccharolyticus種子液按2%的接種量接種到以0.2%的玉米芯木聚糖為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9g NH4Cl, 0.9gNaCl, 0.75g KH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80°C下厭氧發酵24h ；
[0024]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0025]3)用步驟2)獲得的胞內和胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞胞內酶與胞外酶按10:1的比例混合，取該混合酶(lmg/g幹底物)與諾維信商業纖維素酶製劑CTeC2(10FPU/g幹底物)混合在pH6.0的梓檬酸緩衝液55°C下酶解汽爆玉米稻杆原料(酶解液固體量為3%，w/v) 72h後，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為92%，木聚糖的酶解率為95%。
[0026]實施例4C.0bsidiansis以玉米芯木聚糖為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解汽爆玉米秸杆
[0027]I)將在85°C下培養24h的C.0bsidiansis種子液按5%的接種量接種到以0.1%的玉米芯木聚糖為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9g NH4Cl, 0.9g NaCl, 0.75gKH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img 刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80°C下厭氧發酵24h ；
[0028]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0029]3)用步驟2)獲得的胞內和胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞胞內酶與胞外酶按1:1的比例混合，取該混合酶(5mg/g幹底物)與諾維信商業纖維素酶製劑CTec2(15FPU/g幹底物)混合在pH5.0的醋酸緩衝液50°C下酶解酸處理過的水稻秸杆原料(酶解液固體量為2%，w/v)60h後，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為90%，木聚糖的酶解率為92%。
[0030]實施例5C.krist janssonii和C.kronotskyensis混合菌以小麥稻杆為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解小麥秸杆
[0031]I)將在 70°C 下培養 24h 的 C.krist janssonii 和 C.kronotskyensis 種子液分別按2%的接種量接種到以0.1 %的小麥稻杆為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9gNH4Cl, 0.9g NaCl, 0.75g KH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80 V下厭氧發酵24h ；
[0032]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用pH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0033]3)用步驟2)獲得的胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞外酶(用量為15mg/g幹底物)在pH5.0的醋酸緩衝液中75°C下酶解天然小麥秸杆(酶解液固體量為3%，w/v)48h後，再加入夏盛實業集團有限公司生產的商業纖維素酶製劑(用量為25FPU/g幹底物)在55°C下酶解72h，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為86%，木聚糖的酶解率為92%，阿拉伯聚糖酶解率為95%。
[0034]實施例6C.0bsidiansis混合菌以玉米芯為碳源產生的木質纖維素酶與商業纖維素酶協同酶解玉米芯
[0035]I)將在80°C下培養44h的C.0bsidiansis種子液按3%的接種量接種到以0.1%的粉碎玉米芯為碳源培養基，培養基其他成分為(每升):0.9g NH4Cl, 0.9g NaCl, 0.75gKH2PO4, 1.5g K2HPO4, 0.4g MgCl2.6H20, 2.5mg FeCl3.6H20, Iml 微量元素，Img 刃天青，2g胰蛋白，Ig酵母膏，0.75g半胱氨酸鹽酸.H20，80°C下厭氧發酵26h ；
[0036]2)發酵結束後在常溫下6，OOOXg條件下離心15min，分離細胞和上清液，細胞經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液溶解蛋白，蛋白溶液吸入透析袋內在PH7.2的Tris-鹽酸緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外木質纖維素酶；
[0037]3)用步驟2)獲得的胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法如下:用胞外酶(用量為10mg/g幹底物)在pH6.0的醋酸緩衝液中75°C下酶解天然玉米芯(酶解液固體量為2%，w/v)48h後，再加入夏盛實業集團有限公司生產的商業纖維素酶製劑(用量為15FPU/g幹底物)在50°C下酶解72h，得到可發酵糖，其中纖維素的酶解率為83 %，木聚糖的酶解率為89 %，阿拉伯聚糖酶解率為90 %。
【權利要求】
1.一種高溫木質纖維素酶協同酶解製備可發酵糖的方法，包括以下步驟: 1)以0.1-2%的木質纖維素原料為碳源，60-90°C下利用極端嗜熱菌發酵20-72h ; 2)發酵結束後離心，分離細胞和上清液，細胞pH5.0-7.6的緩衝液懸浮，經超聲破壁後，離心去除細胞壁，上清液即為胞內木質纖維素酶，發酵上清液用飽和度為70-80%硫酸銨溶液沉澱蛋白，離心去除上清液後，用PH5.0-7.6的緩衝液溶解蛋白，吸入透析袋內在pH5.0-7.6的緩衝液透析過夜，透析完成後用聚乙二醇在透析袋外吸附濃縮蛋白，蛋白濃度達到0.5-2mg/ml，收集蛋白溶液即為胞外酶； 3)用步驟2)獲得的胞內和胞外木質纖維素酶與商業化的纖維素酶協同酶解木質纖維素原料製備可發酵糖，具體酶解方法包括:①用胞內酶、胞外酶單獨或胞內酶與胞外酶按照1:100-100:1的比例混合在60-85°C下酶解天然木質纖維素原料24_72h後，再加入商業纖維素酶製劑在50-55°C下酶解48-72h，得到可發酵糖；②用胞內酶、胞外酶單獨或胞內酶與胞外酶按照1:100-100:1的比例混合再與商業纖維素酶製劑混合在50-55°C下酶解經過預處理的木質纖維素原料48-96h後，得到可發酵糖。
2.按權利要求1所述的方法，所述的極端嗜熱菌為熱解纖維素菌屬Caldicellulosiruptor 菌種。
3.按權利要求1所述的方法，所述的商業化纖維素酶製劑包括所有在市場上能購買到纖維素酶製劑。
4.按權利要求1所述的方法，所述的預處理過的木質纖維素原料是指用酸、鹼、汽爆、離子液體或水熱處理過的木質纖維素原料。
5.按權利要求1所述的方法，所述的可發酵糖包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖。
【文檔編號】C12P19/02GK104450829SQ201410759454
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】韓業君, 彭小偉, 米朔甫 申請人:中國科學院過程工程研究所