利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法

2023-05-07 17:44:46 1

利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，該方法是：將鈣鹽、磷酸鹽溶解後，在卵黃高磷蛋白或其多肽催化下，在中性條件下進行反應，收集反應生成的沉澱，即得仿生材料羥基磷灰石。本發明利用卵黃高磷蛋白及其多肽的生物活性，極大地促進了羥基磷灰石合成中的晶相轉變過程，將晶相轉化時間由約16小時縮短為5?15分鐘，轉化速度提高了48?216倍，本發明製得的卵黃高磷蛋白多肽純度高，催化活性強。
【專利說明】利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物活性材料製備領域，具體涉及卵黃高磷蛋白及其多肽在催化合成 仿生材料羥基磷灰石中的應用，以及一種利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥 基磷灰石的方法。

【背景技術】
[0002] 卵黃高磷蛋白（phosvitin)是雞蛋蛋黃中的磷蛋白，含磷量10%，為目前自然界 中磷酸化程度最高的蛋白質（Anton2007)。卵黃高磷蛋白與人體中的磷酸化蛋白質（如骨 橋蛋白、牙本質基質蛋白）具有很多相似性，而人體中的這些磷酸化蛋白質具有調控生物 礦化的功能（George and Veis2008，Tay and Pashley2009)，基於其結構上的相似性，推測 卵黃高磷蛋白及其多肽也可能具有相似的功能。因此，利用卵黃高磷蛋白或其多肽在體外 模擬環境下，製備仿生礦化材料具有一定的理論基礎。
[0003] 目前人工仿生礦化材料主要以羥基磷灰石為原料。羥基磷灰石（HAP)是人體骨骼 和牙齒的主要無機成分，人工合成的羥基磷灰石材料具有優良的生物相容性，目前已經廣 泛應用於骨骼修復、體內植入藥物緩釋、牙齒保健等醫療健康領域。羥基磷灰石製備方法主 要為水溶液反應法、高溫煅燒合成法和水熱合成法。其中水溶液反應法操作簡單、條件溫 和、成本較低，越來越受到重視，但其反應獲得的磷酸氫鈣沉澱需要經過晶相轉化過程才能 得到羥基磷灰石，該過程時間較長，例如在《一種由鹼渣合成羥基磷灰石的方法》中，"攪拌 反應時間為1?2小時，陳化時間為12?24小時"，較長的合成時間限制了該方法的應用。
[0004] 水溶液反應法製備羥基磷灰石的反應過程：
[0005] ① Ca2++HP042_+2H20 = CaHPO4 ? 2H20 (生成磷酸氫鈣晶體）
[0006] ② 6CaHP04 ? 2H20+4Ca2+ = Caltl (OH) 2 (PO4) 6+10H20+8H+ (晶相轉化）
[0007] 如何在保持水溶液反應法操作簡單、反應條件溫和等優點的同時，縮短晶相轉化 時間，提高羥基磷灰石合成效率，是目前其合成工藝亟待解決的重要問題之一。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在於提供一種利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基 磷灰石的方法，以縮短晶相轉化時間，提高合成效率。
[0009] 上述目的是通過以下技術方案實現的：
[0010] 一種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，該方法 是：將鈣鹽、磷酸鹽溶解後，在卵黃高磷蛋白或其多肽的催化下，在中性條件下進行反應，收 集反應生成的沉澱，即得仿生材料羥基磷灰石。
[0011] 優選的，所述卵黃高磷蛋白或其多肽的用量為：根據溶液中鈣離子的含量，每3? 12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白或其多肽。
[0012] 優選的，所述鈣鹽為氯化鈣，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉。
[0013] 優選的，所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為3?7 : 1?5。
[0014] 優選的，所述卵黃高磷蛋白多肽是按以下方法製備的，該方法包括以下步驟：
[0015] (1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶於0.01?0? lmol/L的NaOH溶液中， 攪拌0. 5?1小時，調節溶液pH至2. 2?2. 8,按每50?IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋 白酶，酶解3?5小時，然後再調節溶液pH至7. 5?8. 2,再按每20?80g卵黃高磷蛋白加 入Ig胰蛋白酶，酶解5?8小時，酶解液離心後，取上清液；
[0016] (2)多肽分離純化：採用陰離子交換色譜，填料平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液，上 清液進樣後，採用氯化鈉濃度為〇. 2?0. 5mol/L的Tris-HCl緩衝液進行洗脫，收集洗脫 液，經脫鹽處理後，即得。
[0017] 本發明的有益效果是：
[0018] 1)卵黃高磷蛋白及其多肽含有大量的連續磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基，因此可以 吸附溶液中的鈣離子，使之發生局部聚集並形成蛋白/多肽-Ca聚集物，成為晶體生長的成 核位點，從而加速了礦化及晶相轉變的啟動；此外，蛋白/多肽還參與了晶體的構成，從而 改變了晶體的排列形式，降低了晶體生長的界面能，進一步加速了晶相的轉變。本發明利用 卵黃高磷蛋白及其多肽的生物活性，極大地促進了羥基磷灰石合成中的晶相轉變過程，將 晶相轉化時間由約16小時縮短為5?15分鐘，轉化速度提高了 48?216倍。
[0019] 2)本發明製得的卵黃高磷蛋白多肽純度高，催化活性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為對照、酪蛋白磷酸肽、卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽反應生成的羥基磷 灰石樣品的紅外光譜圖。
[0021] 圖2為實施例1-3獲得的羥基磷灰石的X射線衍射圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明進行詳細地說明。
[0023] 實施例1
[0024] -種利用卵黃高磷蛋白催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法：
[0025] 將氯化鈣、磷酸二氫鉀溶解後，在卵黃高磷蛋白催化下，在中性溶液中進行反應， 氯化鈣與磷酸二氫鉀的摩爾比為3 : 1，每3mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白。反應過程中 持續滴加〇. lmol/L的NaOH溶液保持體系的pH為6. 8-7. 2,反應15分鐘後，收集沉澱，即得 到羥基磷灰石礦化材料。
[0026] 實施例2
[0027] 1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶於0.01m〇l/L的NaOH溶液中，攪拌1小 時，調節溶液pH至2. 2,按每50g卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶，酶解3小時，然後再調節 溶液pH至7. 5,再按每20g卵黃高磷蛋白加入Ig胰蛋白酶，酶解5小時，酶解液離心後，上 清液即為卵黃高磷蛋白多肽混合物。
[0028] 2)多肽分離純化：採用Toyopearl DEAE-650M陰離子交換色譜，填料平衡緩衝液 為pH7. 2的Tris-HCl緩衝液，上清液上樣後，依次使用氯化鈉濃度為0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、 0. 5和0. 6mol/L的Tris-HCl緩衝液進行分步梯度洗脫，收集氯化鈉濃度為0. 2mol/L的洗 脫液，按常規的超濾法進行脫鹽處理，超濾膜截留分子量為lOOODa，即得到具備生物活性的 卵黃高磷蛋白多肽。
[0029] 3)催化合成：將氯化鈣、磷酸二氫鉀溶解後，在卵黃高磷蛋白多肽催化下，在中性 條件下進行反應，氯化鈣與磷酸二氫鉀的摩爾比為3 : 1，每3mol鈣離子加入Ig卵黃高磷 蛋白多肽。反應過程中持續滴加 NaOH溶液保持體系的pH為中性，反應5分鐘後，收集沉澱， 即得到羥基磷灰石礦化材料。
[0030] 實施例3
[0031] (1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶於O.lmol/L的NaOH溶液中，攪拌0.5 小時，調節溶液pH至2. 8,按每IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶，酶解5小時，然後再調 節溶液pH至8. 2,再按每80g卵黃高磷蛋白加入Ig胰蛋白酶，酶解8小時，酶解液離心後， 上清液即為卵黃高磷蛋白多肽混合物。
[0032] (2)多肽分離純化：採用Q S印harose FF陰離子交換色譜，填料平衡緩衝液為 pH8. 0的Tris-HCl緩衝液，上清液上樣後，使用氯化鈉濃度為0. 5mol/L的Tris-HCl緩衝液 進行洗脫，收集洗脫液，經脫鹽處理後，即得到具備生物活性的卵黃高磷蛋白多肽。
[0033] (3)催化合成：將氯化鈣、磷酸二氫鈉在卵黃高磷蛋白多肽催化下，在中性條件下 進行反應，氯化鈣與磷酸二氫鈉的摩爾比為7 : 5,每12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白多 肽。反應過程中持續滴加 NaOH溶液保持體系的pH為中性，反應10分鐘後，收集沉澱，即得 到羥基磷灰石礦化材料。
[0034] 實施例4效果對比試驗
[0035] 水溶液反應法製備羥基磷灰石的反應過程大致分為兩步，第一步為溶液中的鈣離 子與磷酸根離子結合，在PH值中性環境中，形成磷酸二氫鈣晶體沉澱；然後磷酸氫鈣晶體 再逐漸轉變為羥基磷灰石晶體。由於磷酸氫鈣與羥基磷灰石組成及結構不同，具有不同的 光譜學性質，因此我們可以監測晶相轉化的過程，並對其進行鑑定。
[0036] 1、分組與取樣
[0037] 為了比較卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽以及酪蛋白磷酸肽對晶相轉化的促進 能力，在相同條件下分別添加上述3種物質進行合成反應，每隔一定時間取沉澱進行紅外 (FT-IR)分析；以蒸餾水代替上述3種蛋白/多肽溶液作為對照。
[0038] 具體操作如下：分別配製0. 2mg/mL的卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽、酪蛋白 磷酸肽溶液，按照5mol/L氯化鈣/Ig蛋白或多肽的比例加入氯化鈣溶液，按照鈣離子與磷 酸根離子摩爾比為5 : 3的比例加入磷酸二氫鈉溶液，混合後調節溶液pH至7.0,啟動反 應，反應過程中持續滴加0. lmol/L的NaOH保持體系的pH為6. 8-7. 2,反應啟動後每隔一定 時間收集部分沉澱，進行後續分析。
[0039] 取樣時間：起始0.5小時內每5分鐘取樣一次，0.5小時至2小時內每0.5小時取 樣一次，2小時後每2小時取樣一次。
[0040] 2、紅外光譜分析
[0041] 將所獲得的樣品進行乾燥，然後與KBr粉末混合均勻，研磨後壓片，應用 FTIR(Thermo Nicolet Nexus470)進行紅外光譜掃描，波數範圍為4000-400CHT1，掃描次數 為32,解析度為4cm- 1。
[0042] 3、實驗結果
[0043] 磷酸氫鈣（DCPD)的紅外特徵峰分別為：79001^98501^106001^1135(^ 1處的 峰對應於DCPD中PO廣的伸縮振動；53001^575(^1和660CHT 1處的峰對應於DCPD中PO廣的 彎曲振動；872CHT1和1220CHT1處的峰分別對應於DCPD中HPO廣的P-O伸縮振動和O-H面內 彎曲振動；1650CHT 1處的強峰以及3544011^34900^1和3284〇1^、3168〇1^處的雙肩峰均對 應於DCPD中水分子振動峰；羥基磷灰石（HAP)的紅外特徵峰分別為：56001^602(^ 1處的 峰對應於HAP中PO廣的彎曲振動,96001^103501^1105(^1處的峰對應於HAP中PO廣的 伸縮振動，1640011^34350^ 1處的峰對應於HAP中水分子振動。因此，可以根據樣品的紅外 光譜圖監測晶相轉化過程。
[0044] 結果顯示，隨著反應時間的推進，樣品的紅外光譜發生變化，磷酸氫鈣（DCPD)的 特徵峰逐漸減弱，而羥基磷灰石（HAP)的特徵峰逐漸增強，最終僅表現為HAP的特徵峰，表 明晶相轉化過程完成（圖1)。
[0045] 對照組獲得的樣品在約16小時時基本完成轉變（圖1A);酪蛋白磷酸肽的添加促 進了晶相轉化的進行，轉化時間縮短為約12小時（圖1B);添加卵黃高磷蛋白時，晶相轉化 速度極快，反應啟動15分鐘後，樣品的紅外圖譜即表現為羥基磷灰石的典型光譜，表明其 已完成轉化（圖1C);而卵黃高磷蛋白多肽的促進作用更強，整個轉化過程在5分鐘時即可 完成（圖1D)。
[0046] 綜合上述結果，傳統水溶液反應工藝（對照組）合成羥基磷灰石的過程中，晶相完 全轉化需要約16小時左右，酪蛋白磷酸肽具有一定的促進晶相轉化的作用，可將轉化時間 縮短至約12小時，而卵黃高磷蛋白及其多肽可以極大地促進晶相轉化過程，完成轉化僅需 15分鐘和5分鐘。
[0047] 實施例5樣品的鑑定
[0048] I、X射線衍射分析鑑定
[0049] 將實施例1-3所獲得的樣品進行乾燥後壓片，在Bruker D8Advance X射線衍射儀 上進行衍射分析。測試條件為：Bragg-Brentano衍射幾何，LynxEye陣列探測器，Ni濾波 片，&11(〇(入=0.1540611111)，管壓401^，管流401^，步進掃描模式，步長為0.02°，掃描速 度為10° /min，掃描角度5° -85°。
[0050] 2、實驗結果
[0051] 實施例1-3所得樣品的XRD結果如圖2所示，3個樣品的圖譜特徵與羥基磷灰石的 典型圖譜完全一致，表明上述樣品確為羥基磷灰石晶體。
【權利要求】
1. 卵黃高磷蛋白或其多肽在催化合成仿生材料羥基磷灰石中的應用。
2. -種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，其特徵在 於：將鈣鹽、磷酸鹽溶解後，在卵黃高磷蛋白或其多肽的催化下，在中性條件下進行反應，收 集反應生成的沉澱，即得仿生材料羥基磷灰石。
3. 根據權利要求2所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特徵在於：所述卵黃高磷蛋白或其多肽的用量為：根據溶液中鈣離子的含量，每 3?12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白或其多肽。
4. 根據權利要求2或3所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰 石的方法，其特徵在於：所述鈣鹽為氯化鈣，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉。
5. 根據權利要求4所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特徵在於：所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為3?7 : 1?5。
6. 根據權利要求2所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特徵在於：所述卵黃高磷蛋白多肽是按以下方法製備的，該方法包括以下步驟： (1) 卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶於0.01?〇. lmol/L的NaOH溶液中，攪拌 0. 5?1小時，調節溶液pH至2. 2?2. 8,按每50?IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶， 酶解3?5小時，然後再調節溶液pH至7. 5?8. 2,再按每20?80g卵黃高磷蛋白加入Ig 胰蛋白酶，酶解5?8小時，酶解液離心後，取上清液； (2) 多肽分離純化：採用陰離子交換色譜，填料平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液，上清液 進樣後，採用氯化鈉濃度為〇. 2?0. 5mol/L的Tris-HCl緩衝液進行洗脫，收集洗脫液，經 脫鹽處理後，即得。
【文檔編號】C01B25/32GK104211037SQ201410386142
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】馬美湖, 張曉維, 耿放, 黃茜 申請人:華中農業大學