一種蠅防禦素突變體及其製備方法和用途

2023-05-07 10:18:46 1

一種蠅防禦素突變體及其製備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，還公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌，以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列編碼的蠅防禦素突變體。本發明通過基因工程的方式製備得到了蠅防禦素突變體，其抑菌活性好，耐熱活性佳，具備抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市場應用前景。
【專利說明】一種蠅防禦素突變體及其製備方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種蠅防禦素突變體及其製備方法和用途。

【背景技術】
[0002] 抗菌膚（Antibacterial Peptides，ABPs)，又稱抗微生物膚（Antimicrobial P印tides，AMPs)，廣義上是指廣泛存在於生物體內具有抵禦外界微生物侵害，清除體內突 變細胞的一類小分子多肽，是生物先天免疫防禦系統的一個重要組成部分，在黏膜免疫系 統中起重要作用，稱之為"第一道防禦體系"或"第一道免疫體系"。抗菌肽廣泛存在於細 菌、植物、無脊椎動物及脊椎動物體內，不僅具有廣譜抗細菌能力，而且對真菌、病毒及癌細 胞也有一定殺抑作用。此外，還具有穩定、水溶性好、抗菌機理獨特、無耐藥性、對高等動物 正常細胞無害等特點，從而顯示了其在醫學和農業上潛在的研究和應用價值。
[0003] 蠅防禦素是來自於家蠅的抗菌肽，其殺菌機制是分子中的二硫鍵與細菌細胞膜的 磷脂有很強的親和作用，即大量分子與膜結合在一起，形成寡聚糖體，並在細菌細胞膜上圍 成一個離子通道，使細胞內大量K+外流和ATP合成受阻，導致細胞呼吸停止、菌體死亡。研 究也發現，防禦素附著在細菌表面後，除了本身對細菌的損傷外，還可以使細菌被吞噬細胞 吞噬消化，起到調理素的作用。
[0004] 直接從家蠅中分離提取的蠅防禦素難以滿足市場需求，採用基因工程的方式製備 重組蠅防禦素可以降低成本，但是採用蠅防禦素的基因直接在大腸桿菌中表達獲得的重組 蠅防禦素抗菌活性不高，耐熱活性差，不具備抗胰蛋白酶的活性，實際應用價值低。


【發明內容】

[0005] 為了解決上述問題，本發明提供了一種蠅防禦素的突變體。
[0006] 本發明提供了一種如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
[0007] 還提供了一種重組載體，它包含SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。優選地，所述的 重組裁體是重組pGEX_4_l質粒。
[0008] 還提供了一種重組菌，它包含前述的重組載體。優選地，所述的重組菌為重組大腸 桿菌。
[0009] 本發明蠅防禦素突變體，它由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列編碼。它的胺基酸 序列如SEQ ID NO :4所示。
[0010] 本發明還提供了一種製備前述蠅防禦素突變體的方法，包含如下步驟：
[0011] (1)取前述的重組菌，接種於含有50ug/mL氨苄青黴素的液體肉湯培養基中， 37°C、220rpm震蕩培養12h，然後用含有50ug/mL的氨苄青黴素的液體肉湯培養基重懸至 OD6tltl為0. 1，於37°C培養至OD6tltl為0.8,加入IPTG至終濃度為ImM，誘導表達3小時，離心， 得菌體；
[0012] (2)取菌體，用GST融合蛋白純化試劑盒分離純化，得到結合了 GST融合蛋白的樹 脂後，加入等體積的濃度為50U/ml的凝血酶溶液，混勻，室溫震蕩10小時，離心，得上清，去 除凝血酶，即得。
[0013] 所述液體肉湯培養基每升包含如下成分：蛋白腖l〇g、酵母浸出物5g、NaCl 10g， 其餘為水。
[0014] 本發明還提供了前述蠅防禦素突變體在製備飼料添加劑或抗菌藥物中的用途。
[0015] 本發明還提供了一種抗菌藥物，它是以前述蠅防禦素突變體為活性成分，加上藥 學上可接受的輔料製備而成的製劑。
[0016] 本發明通過基因工程的方式製備得到了純品蠅防禦素突變體，其抑菌活性好，耐 熱活性佳，具備抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市場應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖I SDS - PAGE分析。1泳道為純化LUC-ori融合蛋白；2泳道為純化的LUC-n融 合蛋白；9泳道為LUC-n菌懸液總蛋白；8泳道為細胞溶解後上清蛋白；7泳道為溶菌酶，DNA 酶，RNA酶酶解後上清；6泳道為酶解後沉澱總蛋白；4, 5泳道為上柱前清液,3為第一次洗 柱清液。
[0018] 圖2 SDS - PAGE分析。泳道1為LUC-ori融合蛋白酶切結果；泳道2, 3為LUC-n 融合蛋白酶切結果，2為5單位凝血酶，3為2. 5單位凝血酶；4泳道為LUC-n融合蛋白未酶 切結果，箭頭所示為蠅防禦素蛋白。
[0019] 圖3 SDS-PAGE分析。1泳道：突變LUC-n蛋白超濾離心後的離心液；2泳道：LUC-n 蛋白經透析袋濃縮後的清液；3泳道：未突變LUC-ori蛋白超濾離心後的離心液；4泳道： LUC-ori蛋白透析袋濃縮後的清液。
[0020] 圖4抑菌實驗結果。1號樣品：LUC-n融合蛋白酶切液；2號樣品：LUC-〇ri融合蛋 白酶切液；3號樣品：GST蛋白對照；4號樣品：凝血酶對照。
[0021] 圖5熱處理後的抑菌結果。藍色點為LUC-n熱處理結果，紅點為LUC-ori熱處理 結果。

【具體實施方式】
[0022] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例。凡基於本發明上述內 容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0023] 實施例1本發明重組蛋白的製備
[0024] 1、重組表達
[0025] (1)蠅防禦素多肽基因的克隆
[0026] 基因序列分析
[0027] 將野生蠅防禦素命名為LUC-ori，從NCBI資料庫中調取已知蠅防禦素序列，對其 進行Blastp分析，得出胺基酸序列。
[0028] 對蠅抗菌肽基因進行改造，將甘氨酸突變稱絲氨酸，命名為LUC-n。
[0029] 核苷酸比對：
[0030] LUC-ori(SEQ ID NO ：1):
[0031] gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc
[0032] ttgttgagag gaaatcgtgg cggttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat
[0033] LUC-n(SEQ ID NO ：2):
[0034] gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc
[0035] ttgttgagag gaaatcgtgg cagttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat
[0036] 合成前述 LUC-ori 和 LUC-n。
[0037] 胺基酸序列比對：
[0038] LUC-ori (SEQ ID NO ：3)：
[0039] ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGGYCNGRAICVCRN
[0040] LUC-n(SEQ ID NO ：4)：
[0041] ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGSYC NGRAICVCRN
[0042] (2)重組菌的構建和篩選
[0043] 重組表達載體的構建：全基因 LUC-n和LUC-ori分別通過EcoRI/Notl位點克隆到 大腸桿菌表達載體pGEX-4-l上，得到重組載體pGEX-LUC-n。
[0044] LUC-n和LUC-ori基因在Invitrogen公司進行合成，同時在基因兩端添加 EcoRI/ NotI位點，並將基因通過TA克隆至pMD18-T載體（購自TaKaRa公司）中，使用Qiagen公司 的質粒提取試劑盒，分別提取含有LUC-n和LUC-ori基因的pMD18-T載體質粒以及pGEX4-l 載體質粒，使用EcoRI/Notl雙酶切，使用膠回收試劑盒（購自TaKaRa公司）分別回收基 因片段以及PGEX載體，使用DNA連接試劑盒（購自TaKaRa公司）進行16°C下連接30分 鍾，採用大腸桿菌熱激法轉化方法，將連接液轉化至DH5 α並塗布於含有50ug/mL的氨苄 青黴素肉湯培養基平板上。次日使用基因引物5' GAATTCGCTACTTGCGATTTATTGA，以及3' 引物GCGGCCGCTTAATTACGACACACGC對陽性克隆進行PCR篩選，PCR條件95°C預變性5min， 95°C 30sec，55°C lmin，72°C lmin，30 個循環，72°C lOmin，得到的陽性克隆送至 Invitrogen 公司測序，挑出分別含有pGEX-LUC-ori重組質粒和pGEX-LUC-n重組質粒的陽性克隆。
[0045] (3)重組表達
[0046] 挑取陽性單克隆於含有50ug/mL的氨苄青黴素的液體肉湯培養基中，37°C、 220rpm震蕩培養12h，次日用新鮮培養基稀釋培養液至OD 6c?為0. 1，繼續於37°C培養至 0D_ :0. 8,然後加入終濃度為ImM的IPTG，誘導3小時。誘導結束後，取樣進行SDS-PAGE電 泳驗證。
[0047] 液體肉湯培養基配方：蛋白腖10g、酵母浸出物5g、NaCl IOg,加水至1L， ρΗ7· 0, 115? 滅菌 20min。
[0048] (4)分離純化：
[0049] a、取菌體，米用 Thermo 公司《Pierce GST spin purification kit》（即 GST 融合 蛋白純化試劑盒），按照試劑盒的操作說明分離純化，得到結合了 GST融合蛋白的樹脂；
[0050] b、將結合了 GST融合蛋白的樹脂與凝血酶混合反應，即按每毫升樹脂加入Iml凝 血酶溶液，凝血酶溶液是含有濃度為50U/ml凝血酶的PBS溶液，顛倒數次，室溫下震蕩10 小時，4°C以500g離心5min，將上清轉移到新管中。
[0051] c、使用通用電氣醫療集團Vivaspin樣品濃縮離心管離心洗滌，選擇分子量截流 範圍為IOkD的離心管，將酶解上清液中4kD大小的防禦素與36kD大小的凝血酶分離，去除 離心液，即得純品蛋白，然後在IkD的透析膜中濃縮，保存。
[0052] 2、測定
[0053] (I)SDS-PAGE
[0054] 取前述分離純化過程中的樣品和分離純化得到的樣品，用SDS-PAGE電泳分析蛋 白條帶。
[0055] (2)抑菌試驗：取酶切液160 μ L加入牛津杯中16-18小時後取出觀察，具體參見 蠅防禦素活性測定方法。
[0056] 1.原理
[0057] 本法基於防禦素殺菌抑菌能力，利用在特定條件下一定濃度的防禦素在含有微生 物的培養基內擴散並形成固定大小的抑菌區域的原理進行測定，同時通過微生物檢定法二 劑量法計算防禦素相當於標準抗菌物質的效價單位。
[0058] 2.參考文獻及標準
[0059] 《中華人民共和國獸藥典》2010版--抗生素微生物鑑定法
[0060] QB 2394-2007食品添加劑乳酸鏈球菌素
[0061] 3.試劑
[0062] 3. 1底層瓊脂I. 5g瓊脂,加水至IOOmL, 115°C，滅菌20min。
[0063] 3.2上層瓊脂：蛋白腖l.Og，酵母浸粉0.5g，NaCl l.Og，加水至lOOmL，瓊脂糖 I. 5g，ρΗ7· 0,115?，滅菌 20min。
[0064] 3· 3 LB固體培養基：蛋白腖I. 0g，酵母浸粉0· 5g，NaCl I. 0g，加水至lOOmL，瓊脂 I. 5g，ρΗ7· 0,115?，滅菌 20min。
[0065] 3. 4 LB液體培養基：蛋白腖l.Og，酵母浸粉0. 5g，NaCl l.Og，加水至lOOmL， 115°C，ρΗ7· 0,滅菌 20min。
[0066] 3· 5 磷酸緩衝液：Κ2ΗΡ042· 0g，ΚΗ2Ρ048· 0g，加蒸餾水定容至 lOOOmL，過濾，115°C， 30min，備用。
[0067] 4.分析步驟
[0068] 4. 1指示菌的活化
[0069] 按照試劑3. 4的配方，配置30mL的培養液，取出一支指示菌，吸取ImL無菌水加 入其中並充分混勻，最後轉接ImL指示菌菌懸液於培養液中，放入搖床，200rpm，37°C，培養 18h。取出培養好的指示菌菌懸液，600nm下用無菌蒸餾水調零，測定其OD值，如果OD值介 於1. 5 - 2. 0,菌懸液的加入量為40微升每IOmL上層培養基，如果OD值在2. 0 - 2. 5之間， 菌懸液加入量為35微升每IOmL上層培養基。
[0070] 4. 2標準品液的製備
[0071] 4. 2. 1硫酸粘桿菌素標準液
[0072] 準確稱取硫酸粘桿菌素標準品（中國獸醫藥品監察所，含量22156U/mg) 0· 0360g， 用試劑3. 5磷酸緩衝液定容至10mL，2000rpm，離心IOmin後再稀釋10倍後作為高劑量濃 度，並將其稀釋1倍，使之配成高低劑量兩個濃度梯度溶液。
[0073] 4.2.2防禦素供試品
[0074] 準確稱取防禦素3. 8000g，並溶於6. 2mL的磷酸緩衝液當中，混勻，2000rpm，離心 10min，留上清液作為高劑量濃度，並將其稀釋1倍，使之配成高低劑量兩個濃度梯度溶液。
[0075] 4. 3平板的製備
[0076] 用無菌20mL移液管移取15mL的平板試劑3. 1底層瓊脂於平板上，將平板放置於 水平的操作臺上至冷卻，備用。
[0077] 加熱融化試劑3. 2上層瓊脂，呆冷卻置50°C時（剛好不燙手的溫度），按步驟4. 1 指定量加入大腸桿菌懸液，搖勻後置於50°C恆溫水浴鍋中，用無菌IOmL移液管每次精確移 取IOmL試劑3. 2上層瓊脂注入含底層瓊脂的平板上，迅速輕放于于水平操作臺上至冷卻， 保證瓊脂膠凝後效價測定培養基平面的平整度。
[0078] 4. 4 上樣
[0079] 用直尺將平板劃分為均勻的四份，在每個製備好的平板中以等距離安置牛津杯4 個。樣品和標準品的高低劑量分別以對角形式加入，加入量為160微升。上樣完成後，放入 培養箱，用事先烘乾（烘箱120°C，2h)的陶瓦蓋代替平板上蓋蓋好平板，37°C，培養6h。實 驗重複5組。
[0080] 4. 5測量及結果計算
[0081] 將平板取出，倒出牛津杯，將平板放置在一個黑色背景的平臺上，用遊標卡尺測量 各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式1計算效價，或使用二劑量法生物效價測定軟體計 算。
[0082]

【權利要求】
1. 一種如SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。
2. -種重組載體，其特徵在於：包含SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的重組載體，其特徵在於：所述的重組載體是重組pGEX-4-l質 粒。
4. 一種重組菌，其特徵在於：它包含權利要求2或者3所述的重組載體。
5. 根據權利要求4所述的重組菌，其特徵在於：所述的重組菌為重組大腸桿菌。
6. -種蠅防禦素突變體，其特徵在於：它由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列編碼。
7. 根據權利要求6所述的蠅防禦素突變體，其特徵在於：它的胺基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
8. -種製備權利要求6或7所述蠅防禦素突變體的方法，其特徵在於：包含如下步驟： (1) 取權利要求4或5所述的重組菌，接種於含有50ug/mL氨苄青黴素的液體肉湯培養 基中，37°C、220rpm震蕩培養12h，用含有50ug/mL的氨苄青黴素的液體肉湯培養基重懸至 0D6Q(I為0. 1，於37°C培養至0D6(I(I為0. 8,然後加入IPTG至終濃度為ImM，誘導表達3小時， 離心，得菌體； (2) 取菌體，用GST融合蛋白純化試劑盒分離純化，得到結合了 GST融合蛋白的樹脂後， 加入等體積的濃度為50U/ml的凝血酶溶液，混勻，室溫震蕩10小時，離心，得上清，去除凝 血酶，即得。
9. 權利要求6或7所述蠅防禦素突變體在製備飼料添加劑或抗菌藥物中的用途。
10. -種抗菌藥物，其特徵在於：它是以權利要求6或7所述蠅防禦素突變體為活性成 分，加上藥學上可接受的輔料製備而成的製劑。
【文檔編號】C12P21/02GK104404049SQ201410712363
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】李鋼, 鄒輝琴, 高靜雷, 溫靜 申請人:四川華德生物工程有限公司