一種細菌檢測方法及裝置的製作方法

2023-05-07 19:27:01

專利名稱：一種細菌檢測方法及裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及待測樣本中細菌的檢測，特別涉及一種細菌檢測方法以及應用該方法 的裝置。
背景技術：
地表水、地下水，甚至雨水中含有多種細菌。尤其是當水體受到人畜糞便、生活汙 水或某些工農業廢水汙染時，水體中的細菌會大量增加。因此，對水的細菌學檢驗，特別是 腸道細菌的檢驗，在衛生學上具有重要的意義。其中總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃 希氏菌已被廣泛用作水體安全評估的重要常規微生物檢測指標，通過它們及其它細菌的檢 測，可以判斷水體衛生學質量，確保人們飲水安全。在現有的水體細菌檢測方法中，普遍採用液體培養或膜過濾後固體平板培養的細 菌擴增模式，在細菌濃度達到較高水平時進行人工計數或者顯色觀察，該類方法往往需要 繁瑣的手工操作，包括樣品稀釋、人工接種、觀察計數和驗證實驗等，導致檢測耗時很長，通 常可達M-72小時甚至更久。因此，上述傳統方法不僅費時、費力，而且在繁瑣的操作過程 中有可能發生二次汙染。此外，對江河、湖庫、泳池、景觀場所的水體利用傳統實驗室手段進行細菌檢測時， 往往需要大體積採樣，並要保證水樣運輸時間常溫下不超過2小時，或者10攝氏度冷藏保 存不超過6小時，這給細菌日常監測帶來了極大不便，更無法滿足人們對水環境安全日益 提高的檢測需求。目前，快速、便捷而又穩定的基於特異指示酶的生化分析法(又稱特異酶底物 法)憑藉其易於觀察識別和實現自動化等特點，已經成為水中細菌檢測方法的主要發展趨 勢，得到人們的極大關注，並且有人採用該方法進行水質細菌在線監測研究，而且已經有用 於水質細菌檢測的在線儀器問世，比如挪威Co 1 ifastAS公司的C01 ifast和法國賽環的 Colilert3000水質大腸菌在線監測儀。與傳統細菌檢測方法相比，基於特異酶底物的細菌 在線檢測方法能夠將檢測時間縮短至4-18小時，其具體時間由初始細菌數量決定，菌量越 大，用時越短。不過，上述水質細菌在線監測儀均從水體直接取樣進行培養檢測，缺乏有效的細 菌全自動富集手段，無法滿足更快的檢測需求。並且檢測結果容易受到水體背景幹擾，無法 實現環境水體的準確定量。因此，發展具有大腸菌全自動過濾裝置的檢測裝置與方法，提高 水體初始菌量，從而最大程度地縮短檢測時間就顯得尤為重要。

發明內容
為了解決現有技術中存在的上述不足，本發明提供了一種使用壽命長、操作簡單、 易於實現自動化的細菌檢測方法及裝置。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種細菌檢測方法，包括以下步驟
a、累積步驟待測樣本在驅動下沿著正方向穿過濾單元，待測樣本中的細菌留在過濾單元的一 側並累積；b、洗脫步驟反衝流體在驅動下沿著反方向穿過過濾單元，將累積的細菌帶離過濾單元；C、檢測步驟檢測從過濾單元上脫離的累積細菌，從而獲得待測樣本中細菌的含量。根據上述檢測方法，還包括步驟d 消毒和衝洗步驟消毒液沿著反方向穿過過濾單元，進入檢測單元，之後排出；清洗液沿著反方向穿過過濾單元，進入檢測單元，之後排出，返回到步驟a。根據上述檢測方法，消毒液在過濾單元、檢測單元內停留，當停留時間不小於消毒 要求的時間後，排出消毒液。根據上述檢測方法，所述待測樣本是待測水樣或液態食品。根據上述檢測方法，通過流路切換，使得分時間地進行如下程序待測樣本沿著正 方向流向過濾單元、反衝流體攜帶著累積的細菌沿著反方向流向檢測單元。根據上述檢測方法，通過流路切換，使得分時間地進行如下程序過濾後的待測樣 本沿著正方向排出、反衝流體沿著反方向流向過濾單元。根據上述檢測方法，所述過濾單元採用膜式過濾器。為了實現上述方法，本發明還提出了這樣一種細菌檢測裝置，包括待測樣本提供 單元、過濾單元、檢測單元；還包括反衝流體提供單元；待測樣本沿著正方向穿過過濾單元，之後排走，待測樣本中的細菌截留在過濾單 元的一側；反衝流體沿著反方向穿過過濾單元，之後過濾單元一側的細菌帶走，並流向檢測 單元。根據上述檢測裝置，還包括第一切換單元，用於間隔地使待測樣本沿著正方向穿 過過濾單元、流出過濾單元的反衝流體攜帶著細菌流向檢測單元。根據上述檢測裝置，還包括第二切換單元，用於間隔地使穿過過濾單元後的待測 樣本排出、反衝流體沿著反方向穿過過濾單元。根據上述檢測裝置，在雙向泵的驅動下，待測樣本和反衝流體間隔地流向過濾單兀。根據上述檢測裝置，所述過濾單元採用膜式過濾器。根據上述檢測裝置，還包括消毒液提供單元和清洗液提供單元，使得消毒液和清 洗液沿著反方向穿過過濾單元，並流向檢測單元。與現有技術相比，本發明具有的有益效果為1、過濾單元可重複使用，降低檢測的維護成本；2、整個檢測裝置密封，具有殺菌消毒步驟，不會發生二次汙染，提高檢測結果的可 靠性；3、細菌的累積與檢測單元相結合，可實現樣品預處理和檢測的全程自動化，提高 檢測效率，縮短檢測時間，尤其適用於大批量樣品的長期連續檢測；該裝置既適用於實驗室檢測，又可與自動化檢測單元結合實現現場在線分析。


參照附圖，本發明的公開內容將變得更易理解。本領域技術人員容易理解的是這 些附圖僅僅用於舉例說明本發明的技術方案，而並非意在對本發明的保護範圍構成限制。 圖中圖1是本發明實施例中細菌檢測裝置的結構示意圖；圖2是本發明實施例中細菌檢測方法的流程示意圖。
具體實施例方式圖1-2和以下說明描述了本發明的可選實施方式以教導本領域技術人員如何實 施和再現本發明。為了教導本發明技術方案，已簡化或省略了一些常規方面。本領域技術 人員應該理解源自這些實施方式的變型或替換將在本發明的範圍內。本領域技術人員應該 理解下述特徵能夠以各種方式組合以形成本發明的多個變型。由此，本發明並不局限於下 述可選實施方式，而僅由權利要求和它們的等同物限定。在本發明中，流體沿著正方向或反方向穿過過濾單元11，其中過濾單元11具有第 一側和第二側。正方向是指流體從第一側穿過過濾單元11，並從第二側排出；反方向是 指流體從第二側穿過過濾單元11，並從第一側排出。實施例如圖1所示，一種細菌的檢測裝置，包括待測樣本提供單元、反衝流體提供單元、 過濾單元11、檢測單元41以及控制單元。所述過濾單元11具有第一側和第二側，待測樣本提供單元通過管道與第一側相 連，反衝流體提供單元通過管道與第二側相連。過濾單元11採用膜式過濾器。第一切換單元31、雙向泵21設置在待測樣本提供單元和過濾單元11之間。所述 檢測單元41通過管道連接第一切換單元31。第二切換單元32設置在反衝流體提供單元和過濾單元11之間。排廢管道與所述 第二切換單元32連接，用於排出過濾後的待測樣本。還包括消毒液提供單元、清洗液提供單元，並與第二切換單元32連接。控制單元連接第一切換單元31、第二切換單元32以及雙向泵21，從而使得待測樣 本沿著正方向穿過過濾單元11並排出，以及反衝流體、消毒液、清洗液沿著反方向穿過過 濾單元11並流向檢測單元。本領域技術人員容易理解的是雙向泵21也可以改為兩個單向泵，分別安裝在過 濾單元的第一側、第二側，而這也將落在本發明的保護範圍內。本實施例還提供了一種待測樣本中細菌的檢測方法，如圖1、2所示，包括以下步 驟a、累積步驟在控制單元的作用下，第一切換單元31切換到過濾模式，第二切換單元32切換到 排廢模式，待測樣本在雙向泵21的驅動下沿著正方向穿過濾單元11，待測樣本中的細菌留 在過濾單元11的一側並累積；b、洗脫步驟
在控制單元的作用下，第一切換單元31切換到檢測模式，第二切換單元32切換到 反衝模式，反衝流體在雙向泵21驅動下沿著反方向穿過過濾單元11，將累積的細菌帶離過 濾單元11，流向檢測單元41 ；C、檢測步驟檢測從過濾單元上脫離的累積細菌，從而獲得待測樣本中細菌的含量。細菌的檢 測方法是本領域的現有技術，例如，先通過培養液培養細菌，再通過培養液的變化來檢測細 菌含量；d、消毒和清洗步驟在控制單元作用下，第一切換單元31切換到檢測模式，第二切換單元32切換到 消毒模式，消毒液在雙向泵21的驅動下沿著反方向穿過過濾單元11，流向檢測單元41，之 後使消毒液儲留在各單元中，達到消毒要求的最短時間後，排空消毒液；第二切換單元32 切換到清洗模式，清洗液在雙向泵21的驅動下沿著反方向穿過過濾單元11，流向檢測單元 41，之後排空，反覆清洗幾次；返回到步驟a，進行下一次檢測。根據上述實施例的有益效果為由於採用了反衝洗的模式，因而有效地提高了過 濾單元的使用壽命，進而提高了檢測裝置的使用壽命。由於採用了過濾模式、反衝洗模式， 還採用了切換單元，因而易於實現操作的自動化。根據本發明的細菌檢測裝置在水樣中大腸桿菌檢測的應用例。在本應用例中，過 濾單元的濾芯採用10層親水性聚碸濾膜，其等效過濾孔徑0.2 μ m，直徑10cm。反衝流體採 用含有酶底物MUG 甲基傘形酮-D葡萄糖苷酸)的培養液，細菌和培養液流入檢測單 元後，將混合液溫度調節至35. 5°C，細菌在培養容器內生長繁殖，若被測水樣中存在大腸杆 菌，則在培養過程中該類細菌將分泌β -D-葡糖醛酸糖苷酶，該酶將特異性地切斷MUG分子 並釋放出MU (4-甲基傘形酮)分子，導致MU分子在培養液內累積；若被測水樣中不存在大 腸桿菌，則在培養過程中不釋放出MU分子；檢測單元在整個培養過程中實時檢測培養液的 螢光信息(激發波長為365nm，發射波長為450nm)，以獲取特徵指示物MU的濃度隨時間的 變化信息；當培養液的螢光強度增大並達到設定的閾值0. OlRF時培養結束，記錄從開始培 養至培養結束所消耗的時間，結合培養消耗時間與細菌濃度之間的關係式可推算出被測水 樣中大腸桿菌的濃度；培養消耗時間與細菌濃度之間的關係式可通過對一系列水樣按前述 方法與平板計數法對比獲得。根據本發明的細菌檢測裝置在液態食品中總大腸菌群檢測的應用例。在本應用例 中，過濾單元的濾芯採用1層親水性聚偏氟乙烯材質的濾芯，其等效過濾孔徑0.45μπι。反 衝流體採用含有酶底物ONPG (Orthonitrophenyl β -Dgalactopyranoside)的培養液，將 混合液溫度調節至35. 5°C，細菌在培養容器內生長繁殖，若被測水樣中存在總大腸桿菌群， 則在培養過程中該類細菌將分泌β-D半乳糖苷酶(β-D galactosidase)，該酶將特異性 地切斷ONPG分子並釋放出ONP(OrhonitrophenyI)分子，導致ONP分子在培養液內累積； 若液態食品中不存在總大腸菌群，則在培養過程中不釋放出ONP分子；通過檢測培養液在 420nm波長處的吸光度或者透光率信息，從而獲取特徵指示物ONP分子的濃度信息；若最終 在12h內培養液吸光度大於等於0. 05Unit，則表明液態食品中存在總大腸菌群；若吸光度 小於0. 05Unit，則表明液態食品中不存在總大腸菌群。
根據本發明的細菌檢測裝置在水樣中金黃色葡萄球菌檢測的應用例。在本應用例 中，過濾單元的濾芯採用15層親水性聚四氟乙烯材質的濾芯，其等效過濾孔徑0.2μπι。反 衝流體採用含有Boc-Ie和u-Gly-Arp-p的培養液，將混合液溫度調節至37°C，細菌在培養 容器內生長繁殖，若被測水樣中存在凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，則在培養過程中該類 細菌將分泌凝固酶，該酶將特異性地催化Boc-Ie和u-Gly-Arp-p反應，產生有色的對硝基 苯胺(nitroa-niline，PNA)，導致PNA分子在培養液內累積；若被測水樣中不存在凝固酶陽 性的金黃色葡萄球菌，則在培養過程中不釋放出PNA分子；通過檢測培養液在405nm波長處 的吸光度或者透光率信息，從而獲取特徵指示物PNA分子的濃度信息；若最終培養液吸光 度大於等於0. lUnit，則表明被測水樣中存在凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌；若吸光度小 於0. lUnit，則表明被測水樣中不存在凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌。本發明的檢測裝置也可以用在其它細菌的檢測中，如耐熱大腸菌群、大腸桿菌 0157、酵母和黴菌等，而這也將落在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種細菌檢測方法，包括以下步驟a、累積步驟待測樣本在驅動下沿著正方向穿過濾單元，待測樣本中的細菌留在過濾單元的一側並 累積；b、洗脫步驟反衝流體在驅動下沿著反方向穿過過濾單元，將累積的細菌帶離過濾單元； C、檢測步驟檢測單元檢測從過濾單元上脫離的累積細菌，從而獲得待測樣本中細菌的含量。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於還包括步驟d消毒和衝洗步驟 消毒液沿著反方向穿過過濾單元，進入檢測單元，之後排出；清洗液沿著反方向穿過過濾單元，進入檢測單元，之後排出，返回到步驟a。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於消毒液在過濾單元、檢測單元內停 留，當停留時間不小於消毒要求的時間後，排出消毒液。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所述待測樣本是待測水樣或液態食PΡΠ O
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於通過流路切換，使得分時間地進行如 下程序待測樣本沿著正方向流向過濾單元、反衝流體攜帶著累積的細菌沿著反方向流向 檢測單元。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於通過流路切換，使得分時間地進行如 下程序過濾後的待測樣本沿著正方向排出、反衝流體沿著反方向流向過濾單元。
7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所述過濾單元採用膜式過濾器。
8.—種細菌檢測裝置，包括待測樣本提供單元、過濾單元、檢測單元；其特徵在於還 包括反衝流體提供單元；待測樣本沿著正方向穿過過濾單元，之後排走，待測樣本中的細菌截留在過濾單元的 一側；反衝流體沿著反方向穿過過濾單元，之後過濾單元一側的細菌帶走，並流向檢測單兀。
9.根據權利要求8所述的檢測裝置，其特徵在於還包括第一切換單元，用於間隔地使 待測樣本沿著正方向穿過過濾單元、流出過濾單元的反衝流體攜帶著細菌流向檢測單元。
10.根據權利要求8所述的檢測裝置，其特徵在於還包括第二切換單元，用於間隔地 使穿過過濾單元後的待測樣本排出、反衝流體沿著反方向穿過過濾單元。
11.根據權利要求8所述的檢測裝置，其特徵在於在雙向泵的驅動下，待測樣本和反 衝流體間隔地流向過濾單元。
12.根據權利要求8所述的檢測裝置，其特徵在於所述過濾單元採用膜式過濾器。
13.根據權利要求8所述的檢測裝置，其特徵在於還包括消毒液提供單元和清洗液提 供單元，使得消毒液和清洗液沿著反方向穿過過濾單元，並流向檢測單元。
全文摘要
本發明提供了一種細菌檢測方法，包括以下步驟a、累積步驟待測樣本在驅動下沿著正方向穿過濾單元，待測樣本中的細菌留在過濾單元的一側並累積；b、洗脫步驟反衝流體在驅動下沿著反方向穿過過濾單元，將累積的細菌帶離過濾單元；c、檢測步驟檢測從過濾單元上脫離的累積細菌，從而獲得待測樣本中細菌的含量。還提供了一種實現上述方法的檢測裝置。本發明具有使用壽命長、成本低、操作簡便等優點。
文檔編號C12Q1/06GK102140491SQ20101062239
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者項光宏 申請人:聚光科技(杭州)股份有限公司