一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法

2023-05-07 22:11:21

專利名稱：一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種重樓組織培養方法，特別是涉及一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法。
背景技術：
重樓是名貴中藥材之一，全世界共有M種，我國擁有19種，其中又以西南地區各省的種類和資源尤為豐富，如雲南、四川、貴州等地。重樓主要有效成分是留體皂苷，其苷元主要為異螺留烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元，並含有胺基酸、留酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物。現代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的療效已被眾多的製藥工業用於藥劑的使用，是雲南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分。隨著中醫藥產業的快速發展，重樓藥材的需求正以每年20%的幅度遞增，而其野生資源卻逐年減少，導致重樓價格迅速上漲，嚴重製約了製藥企業的產量和質量。當前，重樓主要靠採挖野生資源，由於長期過度採挖，並缺乏對其生態環境的保護，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現已瀕臨滅絕。當前重樓主要是靠種子和根莖進行繁殖，由於重樓種子存在種胚發育不完全，胚乳堅硬，胚軸後熟等明顯「雙重休眠」特性，因此重樓種子在播種後通常需要經歷兩個冬天才能萌發成苗，是典型的「二年生種子」，而且在自然狀態下重樓種子出苗率很低、生長周期長，從出苗到成材需要8 10年的時間；而使用重樓根莖進行營養繁殖，由於重樓根莖本身就是其藥用有效部位，因此利用根莖切塊生產重樓種苗存在用種量大、生產成本高等問題。利用組織培養技術生產藥用植物具有生長周期短，繁殖率高、能有效降低災害性氣候對植物生長的不利影響等優點，可進行周年培養生產，且培養條件優越，對植物生長極為有利；因此應用組織培養方法進行重樓植物的快速繁殖是解決當前重樓藥材短缺和更好地保護其野生植物資源的有效方法。到目前為止，重樓植物的組織培養研究還未取得令人滿意的結果，僅有少數成果報導。四川師範大學學報(自然科學版)第四卷第1期(2006年1月)刊登了李群等人撰寫的《重樓屬植物愈傷組織的誘導和培養》，文中作者以重樓植物的不同部位作為外植體進行了愈傷組織誘導培養，發現重樓根和葉片不能誘導出愈傷組織，而根莖、子房和幼芽可不同程度地誘導出愈傷組織，但實驗結果顯示根莖形成的愈傷組織易纖維化，不具備增殖能力，另外，他們發現倒苗期的根莖很難誘導產生愈傷組織。

發明內容
本發明的目的在於提供一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法，該方法可實現以倒苗期重樓根莖為外植體對愈傷組織的有效誘導和快速增殖。為達到上述目的，本發明採用的解決方法包括下列步驟(1)外植體的選取選取倒苗期重樓的根莖，用刀將根莖帶芽的前兩個節段切下，用草木灰處理切下段的切口後將切下段移栽於腐質土中，待其有新根長出時，挖出移栽體， 作為外植體備用；(2)外植體的消毒用流水洗淨外植體表面的泥土及汙物，再將洗淨後的外植體放入消洗靈溶液中浸泡10 30min，然後將浸泡後的外植體用流水衝洗2 4h後取出晾乾，將晾乾後的外植體轉入超淨工作檯，先用濃度為0. 0. 2%的升汞消毒6 20min， 然後用無菌水衝洗3 6次，再用已滅菌的濾紙吸乾其上的水分；(3)愈傷組織的誘導培養切去外植體前端的芽體，將修剪後的外植體接入愈傷組織誘導培養基 1/2MS+6-BA0. 5 2mg · L_1+NAA 0 1. Omg · L_1+IAA 0 3mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+瓊脂6. 0 7. Og · L-1中進行培養；(4)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)培養後的愈傷組織轉接入增殖培養基 MS+6-BA 0. 5 2mg · L-1+NAA 0. 1 Img · L_1+2. 4-D 0 2mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 瓊脂6.0 7. Og 中進行培養；上述所有培養基的ρΗ值為5. 6 6. 5、培養溫度18 ^°C、每天光照8 16小時、光照強度為1000 18001X。目前重樓植物的組織培養仍未取得滿意效果，其主要原因是在外植體的選擇和進行有效誘導培養上仍未有明顯突破。本發明針對重樓藥材一般在倒苗期採收的特點，專門採用倒苗期的重樓根莖，將其經過前期預處理後作為組織培養的外植體，通過消毒後將其接入愈傷組織誘導培養基中，可獲得質地優良、生長速度快和能大量增殖的愈傷組織，較好地解決了當前重樓植物在組織培養方面存在的瓶頸問題，可實現重樓短時間、低成本、大批量生產。
具體實施例方式實施例1(1)外植體的選取選取倒苗期重樓的根莖，用鋒利的刀將根莖帶芽的前兩個節段切下，傷口力求小而平滑，用草木灰處理切下段的切口後將切下段移栽於腐質土中，待其有新根長出時，挖出移栽體，作為外植體備用；(2)外植體的消毒用流水洗淨外植體表面的泥土及汙物，再將洗淨後的外植體放入消洗靈溶液中浸泡15min，然後將浸泡後的外植體用流水衝洗池後取出晾乾，將晾乾後的外植體轉入超淨工作檯，先用濃度為0. 的升汞消毒2次，每次消毒6min，然後用無菌水衝洗5次，再用已滅菌的濾紙吸乾其上的水分；(3)愈傷組織的誘導培養切去外植體前部的芽體，將修剪後的外植體接入愈傷組織誘導培養基 1/2MS+6-BA1. Omg · L^+IAA 2mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 瓊脂 6. 5g · L-1 中進行培養，培養60天後，統計其愈傷組織的誘導率為31. 3% ；(4)愈傷組織的增殖培養選取步驟(4)中生長較快的愈傷組織，將其在超淨臺上切割為0. 5cm左右的大小後轉接入增殖培養基MS+6-BA2. Omg · L^+NAA 1. Omg · L^+2. 4-D 0. 5mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · L-1中進行培養，培養60天後，其愈傷組織增殖倍數為2. 15倍；上述所有培養基的ρΗ值為6. 5、培養溫度25°C、每天光照12小時、光照強度為 15001x。
實施例2將實施例1步驟(3)中的愈傷組織誘導培養基改為1/2MS+6-BA1. Omg · Γ1+ΙΑΑ2. Omg · L^+NAA 0. 5mg · L-1+蔗糖30g · L-1+瓊脂6. 5g · L—1，其它步驟同實施例1，誘導培養60 天后，其愈傷組織的誘導率為33.4%。實施例3將實施例1步驟中的愈傷組織增殖培養基改為 MS+6-BA2. Omg · I^+NAAO. 3mg · Γ1+ 蔗糖 30 50g · Γ1+ 瓊脂 6. 0 7. Og · Λ 其它步驟同實施例1，增殖培養60天後，愈傷組織增殖倍數為1.75倍。
權利要求
1. 一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法，其特徵在於包括如下步驟(1)外植體的選取選取倒苗期重樓的根莖，用刀將根莖帶芽的前兩個節段切下，用草木灰處理切下段的切口後，將切下段移栽於腐質土中，待其有新根長出時，挖出移栽體，作為外植體備用；(2)外植體的消毒用流水洗淨外植體表面的泥土及汙物，再將洗淨後的外植體放入消洗靈溶液中浸泡10 30min，然後將浸泡後的外植體用流水衝洗2 4h後取出晾乾，將晾乾後的外植體轉入超淨工作檯，先用濃度為0. 1 % 0. 2 %的升汞消毒6 20min，然後用無菌水衝洗3 6次，再用已滅菌的濾紙吸乾其上的水分；(3)愈傷組織的誘導培養切去外植體前端的芽體，將修剪後的外植體接入愈傷組織誘導培養基 1/2MS+6-BA0. 5 2mg · L_1+NAA 0 1. Omg · L_1+IAA 0 3mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+瓊脂6. 0 7. Og · L-1中進行培養；(4)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)培養後的愈傷組織轉接入增殖培養基MS+6-BA 0. 5 2mg · L_1+NAA 0. 1 Img · L_1+2. 4_D 0 2mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 瓊脂 6· 0 7. Og · Γ1中進行培養；上述所有培養基的PH值為5. 6 6. 5、培養溫度18 ^°C、每天光照8 16小時、光照強度為1000 18001x。
全文摘要
本發明公開了一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法，該方法以經特定預處理後的重樓根莖為外植體，通過消毒後將其接入愈傷組織誘導培養基和增殖培養中進行培養，最終實現了對重樓植物愈傷組織地有效誘導和快速增殖。本發明較好地解決了當前重樓植物在組織培養方面存在的瓶頸問題，為今後深入開展重樓植物的各種生物技術研究奠定了堅實的理論基礎。
文檔編號A01H4/00GK102301957SQ201110211068
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月26日 優先權日2011年7月26日
發明者付偉, 張珏, 張紅玉, 李文光, 楊軍, 王勇, 王躍華, 田夢良, 蔣亭亭, 陳燕 申請人:四川農業大學