提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法
2023-05-07 18:03:31 1
專利名稱：提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、杆狀病毒基因表達系統，尤其是涉及一種利用提高 家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法。
背景技術：
家蠶杆狀病毒基因表達系統是目前高效的真核表達系統之一。其工作原理
是利用家蠶杆狀病毒BmNPV —種晚期高效表達的基因一多角體基因，能夠被 外源基因取代而不影響病毒的複製，從而將外源基因插入到多角體基因啟動子 的後面進行表達。在野生型病毒中，多角體蛋白的表達水平可以達到感染細胞 的總蛋白的30—50%。雖然，利用該系統已經進行了上千種外源基因的表達， 但與病毒本身的多角體基因的表達水平相比，外源目的蛋白質的表達水平遠遠 沒有達到像多角體蛋白質的水平。
發明內容
本發明的目的在於提供一種利用提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表 達水平的方法。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案其步驟如下
1) 以家蠶杆狀病毒BmNPV基因組為模板，通過PCR技術克隆多角體啟動 子和多角體基因PolyhedrinN-端從起始密碼子ATG開始的編碼50個胺基酸，即 150個核苷酸的基因序列，然後通過體外連接的方法，在其C端與報告基因一綠 色螢光蛋白基因EGFP進行連接，成為一個融合基因；隨後將該融合基因克隆 入杆狀病毒供體質粒pFas氾acHTa，構建完成一個重組的杆狀病毒供體載體；
2) 然後利用已經構建的適用於家蠶的杆狀病毒Bac-to-Bac表達系統，其工 作原理為重組杆狀病毒通過細菌轉座子的基因定位轉移作用，在大腸桿菌內 實現基因的轉移重組，獲得重組病毒。
3) 重組病毒系統由供體質粒、含有家蠶杆狀病毒BmBacmid基因組的感受 態細菌DH10BmBac構成，其產生重組病毒的原理是首先將外源目的基因克 隆入供體質粒，然後將供體質粒轉化入DH10BmBac感受態細胞中，通過細菌 轉座子的定點轉位作用，將啟動子和目的基因一併轉入家蠶杆狀病毒基因組而 產生重組病毒DNA，最後轉染家蠶培養細胞而獲得含有目的基因重組病毒。
本發明具有的有益效果是利用重組病毒作為載體，感染家蠶培養細胞，在細胞內進行蛋白質的表達，
感染96小時後分析蛋白質表達情況。結果表明，通過與多角體基因N-端序列的 融合，外源基因的表達水平得到了提高，增加的幅度為2—3倍。與外源基因單 獨表達相比，顯著提高了外源基因的表達水平，從而大大提高了家蠶杆狀病毒 表達系統的工作效率。
圖1是用於Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統的供體質粒圖譜。
圖2是構建的表達EGFP的重組病毒感染家蠶培養細胞和家蠶幼蟲的情況。
(a)感染BmN培養細胞。左邊為未感染的正常細胞，右邊為感染後96 h的
感染情況；(b)感染家蠶幼蟲。左邊為對照，右邊為接種96 h後出現症狀的病蠶。 圖3是融合表達EGFP的重組病毒感染家蠶培養細胞後的蛋白質分析。 採用12%SDS-PAGE。圖標為M，表示蛋白質標準分子量，CK，表示對
照，即沒有融合表達、僅表達EGFP基因，1，表示採用本申請專利技術、用
融合表達的蛋白質情況。箭頭表示EGFP蛋白，由於融合了部分多角體基因序
列，分子量有所增加。
具體實施例方式
以家蠶杆狀病毒BmNPV基因組為模板，通過PCR技術克隆多角體啟動子 和多角體基因Polyhedrin N-端從起始密碼子ATG開始的編碼50個胺基酸，即 150個核苷酸的基因序列，然後通過體外連接的方法，在其C端與報告基因一綠 色螢光蛋白基因EGFP進行連接，成為一個融合基因。隨後將該融合基因克隆 入杆狀病毒供體質粒pFastBacHTa,構建完成一個重組的杆狀病毒供體載體。然 後利用我們己經構建的適用於家蠶的杆狀病毒Bac-to-Bac表達系統(已獲授權 專利，專利號200310108781.8)，其工作原理為重組杆狀病毒可以通過細菌 轉座子的基因定位轉移作用，在大腸桿菌內實現基因的轉移重組，快速獲得重 組病毒。該系統由供體質粒、含有家蠶杆狀病毒BmBacmid基因組的感受態細 菌DH10BmBac構成，其產生重組病毒的原理是首先將外源目的基因克隆入 供體質粒，然後將供體質粒轉化入DH10BmBac感受態細胞中，通過細菌轉座 子的定點轉位作用，將啟動子和目的基因一併轉入家蠶杆狀病毒基因組而產生 重組病毒DNA，最後轉染家蠶培養細胞而獲得含有目的基因重組病毒(參見論 文:吳小鋒，曹翠平，魯興萌。2006，利用細菌轉座子構建適用於家蠶的Bac-to-Bac 快速基因表達系統。蠶業科學，32 (2): 183-188)。然後利用重組病毒作為載體， 感染家蠶培養細胞，在細胞內進行蛋白質的表達，感染96小時後分析蛋白質表具體實施例
1、 研究材料杆狀病毒供體質粒pFastBacHTa (圖1)購自美國Invitrogen 公司。含有綠色螢光蛋白基因EGFP的質粒pBI-EGFP購自美國BD公司。各種 限制性內切酶、連接酶等分子生物學操作試劑購自日本Takara公司。家蠶培養 細胞BmN細胞由本研究室繼代保存，細胞培養基TC-100為Gibico公司產品， 胎牛血清(FBS)購於杭州四季青生物工程材料有限公司。細胞用添加10%胎牛 血清的培養基、27'C恆溫培養。
2、 工作流程
以家蠶杆狀病毒BmNPV基因組為模板，通過PCR技術克隆多角體啟動子 和多角體基因Polyhedrin N-端從起始密碼子ATG開始的編碼50個胺基酸，即 150個核苷酸的SEQ ID NO.l所示的基因序列，引物設計為前導引物為 ATTTGTACGTAATTAACGATAC (SnaBI限制性內切酶位點)，後續引物為 GATCTTCTAGGATCCTACATG (BamHI限制性內切酶位點)。將此PCR克隆 的片段用首尾分別為SnaBI和Bamffl的限制性內切酶消化，純化後克隆入也用 同樣酶切的供體質粒pFastBacHTa中，這樣構建的重組質粒命名為pFastBacHTa —PH50。採用PCR技術，以pBI-EGFP為模板克隆綠色螢光蛋白基因EGFP如 SEQIDN0.2所示，引物設計為前導引物AATGGATCCATGGTGAGCAAG (BamHI內切酶位點)，後續引物CACTAAAGCTTTTACTTGTACAG (HindIII 內切酶位點)，隨後將此PCR產物用Bamffl和HindIII酶切，克隆入用同樣酶切 的pFastBacHTa — PH50中，這樣構建的重組質粒命名為pFastBacHTa — PH50/EGFP。這樣就將多角體蛋白基因N-端的150個核苷酸的基因序列與綠色 螢光蛋白基因EGFP進行了融合。成為一個融合基因。然後將該質粒轉化入含 有家蠶杆狀病毒BmBacmid基因組的感受態細菌DH10BmBac細胞內，在含有 抗生素的培養板上培養過夜，翌日通過藍白斑篩選獲得陽性菌斑，隨後從陽性 菌斑從抽提質粒DNA，該質粒DNA即為重組病毒的基因組，將此DNA轉染入 家蠶培養細胞BmN， 120小時後分離培養基上清液，獲得重組病毒。然後利用 重組病毒作為載體，感染家蠶培養細胞，在細胞內進行蛋白質的表達，感染96 小時後分析蛋白質表達情況。感染的情況見圖2，左邊為感染前(對照)的細胞 和家蠶幼蟲，右邊為重組病毒感染的細胞和家蠶幼蟲。
3、 結果由圖3可知，通過與多角體基因N-端序列的融合，外源基因的 表達水平得到了提高，增加的幅度為2—3倍。與外源基因單獨表達相比，顯著 提高外源基因的表達水平，從而大大提高了家蠶杆狀病毒表達系統的工作效率。
5基因序列表 浙江大學
〈120〉提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
1
<211〉 150
<212〉 腿
<213〉家蠶杆狀病毒
<400〉 1
atgccg犯ttattcatacacCCCC￡LCC3tCgggcgtactt60
tgggctgtcttatcaaaaacgccaagcgca3gaeigc3cctagtcgaacat120
gaacaagagg agaagcaatg ggatcttcta150
2
<211〉 720
〈212〉 腿
<213〉綠色螢光蛋白基因
〈400〉 2
atggtgagcagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60
ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcg鄉gcgagggcgatgccacctac120
ggc朋gctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180
ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240
cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccg犯ggctacgtccaggagcgcaccatcttc300
ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360
gtg犯ccgceitcgagctgaagggcatcgacttca鄉aggacggcaacatCCtggggC6LC420
aagctggagtacaactacaaC3gcca^c38icgtctatatcatggccgacaagcagaaga^c480
ggcat頃ggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggscggcagcgtgcagctcgcc540
gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgccCg8LC犯CC3C600
tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660
ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacg站ctgtacaagtaa720
權利要求
1、一種提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法，其特徵在於該方法的步驟如下1)以家蠶杆狀病毒BmNPV基因組為模板，通過PCR技術克隆多角體啟動子和多角體基因Polyhedrin N-端從起始密碼子ATG開始的編碼50個胺基酸，即150個核苷酸的基因序列，然後通過體外連接的方法，在其C端與報告基因-綠色螢光蛋白基因EGFP進行連接，成為一個融合基因；隨後將該融合基因克隆入杆狀病毒供體質粒pFastBacHTa，構建完成一個重組的杆狀病毒供體載體；2)然後利用已經構建的適用於家蠶的杆狀病毒Bac-to-Bac表達系統，其工作原理為重組杆狀病毒通過細菌轉座子的基因定位轉移作用，在大腸桿菌內實現基因的轉移重組，獲得重組病毒。3)重組病毒系統由供體質粒、含有家蠶杆狀病毒BmBacmid基因組的感受態細菌DH10BmBac構成，其產生重組病毒的原理是首先將外源目的基因克隆入供體質粒，然後將供體質粒轉化入DH10BmBac感受態細胞中，通過細菌轉座子的定點轉位作用，將啟動子和目的基因一併轉入家蠶杆狀病毒基因組而產生重組病毒DNA，最後轉染家蠶培養細胞而獲得含有目的基因重組病毒。
全文摘要
本發明公開了一種提高家蠶杆狀病毒表達系統外源蛋白質表達水平的方法。利用家蠶杆狀病毒BmNPV多角體基因N-段部分基因序列，將其與外源目的基因進行融合，構建產生新的重組基因工程病毒，然後在家蠶培養細胞內進行重組蛋白質的表達，發現能夠大幅度提高外源蛋白質的表達水平。利用重組病毒作為載體，感染家蠶培養細胞，在細胞內進行蛋白質的表達，感染96小時後分析蛋白質表達情況。結果表明，通過與多角體基因N-端序列的融合，外源基因的表達水平得到了提高，增加的幅度為2-3倍。與外源基因單獨表達相比，顯著提高了外源基因的表達水平，從而大大提高了家蠶杆狀病毒表達系統的工作效率。
文檔編號C12N15/866GK101629187SQ20091010213
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月17日 優先權日2009年8月17日
發明者吳小鋒, 相興偉, 琳 陳 申請人:浙江大學