脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法
2023-05-07 11:55:21 4
專利名稱：脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法
技術領域：
本技術發明是一種脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，設計生物技術領域。
背景技術：
脫氫表雄酮(DHEA)，是一種C19類固醇激素，主要由腎上腺皮質網狀帶分泌，在循環血液中以DHEA及其儲存硫酸鹽形式(DHEAS)存在(體內後者是前者的100倍左右)，DHEA能轉化為雌激素、雄激素、孕激素、皮質醇和皮質酮等其他激素，因此被譽為多向性「激素緩衝劑」。許多研究表明，DHEA在促進脂肪代謝、抗氧化、提高機體免疫力、增強細胞活性、防治老年性痴呆等方面均有積極的作用。機體衰老後體內DHEA及DHEAS水平顯著下降，導致各種類固醇激素的含量明顯下降，同時伴隨心血管疾病、腫瘤發病率的上升以及免疫功能的下降。在實際應用中，DHEA已作為抗衰老保健藥進入市場，它不僅抗衰老，還對糖尿病、心臟病、乳腺癌、子宮癌的預防和治療有明顯作用。同時該激素是近年來國際奧委會列出的禁用藥物之一，是常規的興奮劑檢測項目。目前對血清和尿液中DHEA的檢測方法主要分為色譜技術和免疫分析技術。色譜分析法包括氣相色譜法(HPLC)、氣質聯用和液質聯用法等，該類技術需要昂貴的儀器設備，而且DHEA和DHEAS在檢測過程中能衍生成同種物質，幹擾測定，所以樣本首先需要通過固相萃取分離法除去DHEAS，這使得操作過程相對繁瑣，技術要求較聞。酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測技術是利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應識別生物液體中的靶分子，並利用酶-底物的顯色反應定量的反應待測樣本中靶分子的含量。由於其特異性強、靈敏度、操作簡便及不需大型儀器等優點，現廣泛用於生物樣本的定量檢測實驗中。實現該測定的重要環節是針對待測分子的高特異性、高親和力抗體的製備。但許多小分子半抗原免疫原性較弱，通過傳統的免疫方法不易產生特異性的抗體，需要將其偶聯到大分子物質上(載體)後獲得免疫原性，然後才能產生高質量的抗體。偶聯方法的選擇，需要根據小分子的結構以及載體的特性來決定，可利用小分子含的羧基、氨基或者羥基與蛋白質分子形成共價鍵，將小分子連接到載體上去。連接後的小分子成為完全抗原，經過鑑定後可以用來免疫動物獲得抗體,並完成後續ELISA試劑盒的製備。DHEA的分子式是C19H2802，分子量為288. 41，不具備免疫原性，為此，必須先設法將半抗原DHEA與載體蛋白偶聯製備成全抗原，才能用於免疫動物。本專利從ELISA試劑盒製備的源頭入手，將DHEA與載體蛋白BSA偶聯，並利用新技術提高偶聯效率，製備穩定的DHEA-BSA,再使用免疫技術製備特異性高親和力強的抗體，為試劑盒的製備提供高品質原材料。
發明內容
本技術利用混合酸酐法，通過多次實驗，調整反應試劑比例，以最適比例得到最佳偶聯結合比的DHEA-BSA，並採用紫外吸收法、質譜分析法、SDS-PAGE及分光光度法分別針對人工抗原的濃度、純度、結構以及歐聯比進行綜合評估，篩選出最好的作為免疫原，製備兔多抗。本發明提供的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法採用脫氫表雄酮和琥珀酸酐作為原料，包括以下步驟步驟一、製備脫氫表雄酮全抗原(DHEA-BSA)，採用混合酸酐法製備DHEA-BSA，取脫氫表雄酮與琥珀酸酐作為原料，將兩者反應、層析、洗脫、收集，合併後留取反應產物得到修飾的半抗原；取適量修飾過的半抗原，加入氯甲基異丁酯和三正丁胺，反應後得A液，取適量BSA溶解在碳酸鹽緩衝液中得B液，將A液加入B液中，經過攪拌、洗脫、收集得到蛋白部分，再進行濃縮、冷凍、乾燥後得到抗原DHEA-BSA ；步驟二、製備脫氫表雄酮包被抗原(DHEA-OVA)，採用混合酸酐法製備DHEA-0VA，取脫氫表雄酮與琥珀酸酐作為原料，將兩者反應、層析、洗脫、收集，合併後留取反應產物得到修飾的半抗原；取修飾過的半抗原，加入氯甲基異丁酯和三正丁胺，反應後得A液，取適量OVA溶解在碳酸鹽緩衝液中得B液，將A液加入B液中，經過攪拌、洗脫、收集得到蛋白部分，再進行濃縮、冷凍、乾燥後得到抗原DHEA-OVA ；步驟三、製備抗脫氫表雄酮(DHEA)抗體，融合形成表達ant1-DHEA的雜交瘤細胞株；經多次有限稀釋後由ELISA檢測篩選P/N值最高的單克隆抗體；將細胞擴大培養後收取表達上清，選用蛋白A柱進行分離、純化，濃縮後得到抗DHEA單克隆抗體；步驟四、製備酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，使用固相載體，包被步驟二所得的DHEA-OVA經過封閉、洗板處理後製成酶標板，加入不同濃度的標準品/待測標本及生物素化的抗DHEA單克隆抗體，通過生物素-親和放大系統，依次加入底物及終止液，完成DHEA的ELISA試劑盒的製備。優選的，上述步驟一中具體修飾的半抗原的步驟為1.1)取重量1:1的25-75mg脫氫表雄酮與25_75mg琥珀酸酐在室溫下反應過夜；1. 2)採用TLC薄層檢測反應產率，矽膠柱層析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脫，按每瓶50ml收集，回收溶劑，TLC跟蹤檢測，合併相同部分，用TLC與脫氫表雄酮對照，留取反應產物即為修飾的半抗原。優選的，上述步驟一中利用修飾過的半抗原製備抗原DHEA-BSA的具體步驟為1. 3)取5mg_20mg修飾過的半抗原，加入10_30ul氯甲基異丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反應2h，得A液；1. 4)將10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸鹽緩衝液中，得B液，將其冷卻至4°C ；1. 5)將A液逐滴加入B液中，攪拌反應6h，然後過S印hadex G-100柱，PBS洗脫，收集蛋白部分，除去未反應的半抗原1. 6)對收集的蛋白部分進行超濾杯濃縮，SDS-PAGE膠檢測，DEHA-BSA電泳條帶滯後於載體蛋白BSA的電泳條帶；1. 7)冷凍乾燥24h，凍乾粉分裝，得抗原DEHA-BSA。優選的，上述步驟二中具體修飾的半抗原的步驟為2.1)取重量1:1的25-75mg脫氫表雄酮與25_75mg琥珀酸酐在室溫下反應過夜；
2. 2)採用TLC薄層檢測反應產率，矽膠柱層析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脫，按每瓶50ml收集，回收溶劑，TLC跟蹤檢測，合併相同部分，用TLC與脫氫表雄酮對照，留取反應產物即為修飾的半抗原。優選的，上述步驟二中利用修飾過的半抗原製備包被抗原DHEA-OVA的具體步驟為2. 3)取5mg-20mg修飾過的半抗原，加入10_30ul氯甲基異丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反應2h，得A液；2. 4)將10-30mg0VA溶解在l_4ml碳酸鹽緩衝液中，得B液，將其冷卻至4°C ；2. 5)將A液逐滴加入B液中，攪拌反應6h，然後過S印hadex G-100柱，PBS洗脫，收集蛋白部分，除去未反應的半抗原2. 6)對收集的蛋白部分進行超濾杯濃縮，SDS-PAGE膠檢測，DEHA-OVA電泳條帶滯後於載體蛋白OVA的電泳條帶；2. 7)冷凍乾燥24h，凍乾粉分裝，得抗原DEHA-OVA。優選的，上述步驟三中製備雜交瘤細胞具體步驟為3.1)選用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每隻10_30ug，皮下多點及四腳掌初次免疫，14d後相同劑量皮下加強免疫，每2周加強I次，加強後每隔7d眼眶採血，分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價，於細胞融合前3d腹腔加強免疫；3. 2)用PEG融合處於對數生長期的骨髓瘤細胞和BALB/C小鼠脾細胞，製備雜交瘤細胞。優選的，上述步驟三中利用雜交瘤細胞進一步製備得到抗DHEA抗體的具體步驟為3. 3)在所述步驟3. 2)得到的雜交瘤細胞2周後用間接ELISA法檢測細胞上清液，選取P/N值最高的採用有限稀釋法進行3-4次克隆3. 4)每次克隆後擴大培養建庫的細胞上清；3. 5)用硫酸銨沉澱法粗提單抗，用親和層析法純化分離得到特異性高的抗DHEA的抗體。優選的，上述步驟四具體包括以下步驟4.1)使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置於紫外光下輻照2小時，使PS板活化；4. 2)在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的DHEA_0VA，4°C過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理後製成包被好的酶標板；4. 3)檢測時，依次加入不同濃度的標準品/待測標本及生物素化的抗DHEA單克隆抗體，形成標準品/待測標本中的DHEA和酶標板上包被的DHEA競爭結合生物素化抗DHEA抗體的局面，再通過生物素-親和素放大信號，以3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成DHEA的ELISA試劑盒的製備。本發明通過高效的偶聯方法的得到穩定性好的DHEA-BSA，並通過免疫動物得到特異性高及親和力強的單克隆抗體，用來製備DHEA的ELISA試劑盒。通過與高效液相色譜(HPLC)法的比較，其操作步驟簡單、可一次檢測多個樣本、且不需貴重儀器、同時在檢測靈敏度、所需時間等方面均優於HPLC法。同時，該試劑盒具有穩定性高和低毒性的優點，相較於HPLC法無需使用正己烷、乙腈、甲醇等有機試劑，減少對實驗者及環境的毒害，在環保方
面更勝一籌。
圖1為本發明試劑盒質量指標檢測濃度-光密度示意圖。
具體實施例方式為了便於本領域普通技術人員理解和實施本發明，下面結合附圖及具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。本專利採用效率高的新型偶聯技術，獲得穩定性好的DHEA-BSA，並利用免疫技術製備高特異性及高親和力的單克隆抗體，將其應用於ELISA試劑盒的製備和生產中。其中將半抗原DHEA與載體蛋白BSA偶聯製備成全抗原是製備高品質DHEA酶聯免疫試劑盒的最為關鍵的因素之一。主要的技術路線如下DHEA酶聯免疫試劑盒的研製方法，其具體步驟為a、DHEA全抗原及包被抗原的製備採用混合酸酐法製備DHEA-BSA.取25_75mg脫氫表雄酮與25_75mg琥珀酸酐(重量1:1)在室溫下反應過夜，TLC薄層檢測反應產率，矽膠柱層析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脫，按50ml每瓶收集，回收溶劑，TLC跟蹤檢測，合併相同部分，用TLC與脫氫表雄酮對照，留取反應產物即為修飾的半抗原。取5mg_20mg修飾過的半抗原，加入10_30ul氯甲基異丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反應2h，得A液。將10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸鹽緩衝液中，得B液，將其冷卻至
40C ο將A液逐滴加入B液中，攪拌反應6h，然後過S印hadex G-100柱，PBS洗脫，收集蛋白部分，除去未反應的半抗原。收集的蛋白部分超濾杯濃縮，SDS-PAGE膠檢測，DEHA-BSA電泳條帶滯後於載體蛋白BSA的電泳條帶。冷凍乾燥24h，凍乾粉分裝，得抗原脫氫表雄酮-BSA。同法製得包被抗原DHEA-OVA。b、抗DHEA抗體的製備選用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每隻10_30ug，皮下多點及四腳掌初次免疫，14d後相同劑量腹腔加強免疫，每2周加強I次，加強後每隔7d眼眶採血，分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價，於細胞融合前3d尾靜脈加強免疫。用PEG融合處於對數生長期的骨髓瘤細胞和BALB/C小鼠腹水脾細胞，製備雜交瘤細胞。2周後用間接ELISA法檢測細胞上清液，選取P/N值最高的採用有限稀釋法進行3-4次克隆。每次克隆後擴大培養建庫的細胞上清。用硫酸銨沉澱法粗提單抗，用親和層析法純化分離得到特異性高的抗DHEA的抗體。採用間接ELISA法進行鑑定，抗體效價為1: 160000-1 320000。c、ELISA試劑盒的研製本試劑盒應用競爭抑制酶聯免疫分析法測定血清或血漿樣本中DHEA的水平。製備過程如下使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置於紫外光下輻照2小時，使PS板活化。在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的DHEA-OVA，4°C過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理後製成包被好的酶標板。檢測時，依次加入不同濃度的標準品/待測標本及生物素化的抗DHEA單克隆抗體，形成標準品/待測標本中的DHEA和酶標板上包被的DHEA競爭結合生物素化抗DHEA抗體的局面，再通過生物素-親和素放大信號，以3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成DHEA的ELISA試劑盒的製備。2、經過對試劑盒一系列的質量指標檢測，包括靈敏度、重複性、特異性、回收率及線性測定，表明該檢測體系成熟，本試劑盒各項指標檢測結果a.標準曲線b.靈敏度=ELISA法檢測血清標本時最低檢測限為55. lpg/ml ；c.回收率用同一血清樣本分別添加不同量的定值標準品，作回收試驗(n = 5)。平均回收率98. 74% (表I)。如圖1所示，為本發明試劑盒質量指標檢測濃度-光密度示意圖。
權利要求
1.一種脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，採用脫氫表雄酮和琥珀酸酐作為原料，其特徵在於包括以下步驟 步驟一、製備脫氫表雄酮人工抗原(DHEA-BSA)，採用混合酸酐法製備DHEA-BSA，取脫氫表雄酮與琥珀酸酐作為原料，將兩者反應、層析、洗脫、收集，合併後留取反應產物得到修飾的半抗原；取適量修飾過的半抗原，加入氯甲基異丁酯和三正丁胺，反應後得A液，取適量BSA溶解在碳酸鹽緩衝液中得B液，將A液加入B液中，經過攪拌、洗脫、收集得到蛋白部分，再進行濃縮、冷凍、乾燥後得到抗原DHEA-BSA ； 步驟二、製備脫氫表雄酮人工包被抗原(DHEA-OVA)，採用混合酸酐法製備DHEA-0VA，取脫氫表雄酮與琥珀酸酐作為原料，將兩者反應、層析、洗脫、收集，合併後留取反應產物得到修飾的半抗原；取修飾過的半抗原，加入氯甲基異丁酯和三正丁胺，反應後得A液，取適量OVA溶解在碳酸鹽緩衝液中得B液，將A液加入B液中，經過攪拌、洗脫、收集得到蛋白部分，再進行濃縮、冷凍、乾燥後得到人工抗原DHEA-OVA ； 步驟三、製備抗脫氫表雄酮(DHEA)單克隆抗體，融合形成表達ant1-DHEA的雜交瘤細胞株；經多次有限稀釋後由ELISA檢測篩選P/N值最高的單克隆抗體；將細胞擴大培養後收取表達上清，選用蛋白A柱進行分離、純化，濃縮後得到抗DHEA單克隆抗體； 步驟四、製備酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，使用固相載體，包被步驟二所得的DHEA-OVA經過封閉、洗板處理後製成酶標板，依次加入不同濃度的標準品/待測標本及生物素化的抗DHEA單克隆抗體，再經生物素-親和素放大系統，依次加入底物及終止液，完成DHEA的ELISA試劑盒的製備。
2.如權利要求1所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟一中具體修飾的半抗原的步驟為1.1)取重量1:1的25-75mg脫氫表雄酮與25_75mg琥珀酸酐在室溫下反應過夜；1.2)採用TLC薄層檢測反應產率，矽膠柱層析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脫，按每瓶50ml收集，回收溶劑，TLC跟蹤檢測，合併相同部分，用TLC與脫氫表雄酮對照，留取反應產物即為修飾的半抗原。
3.如權利要求2所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟一中利用修飾過的半抗原製備抗原DHEA-BSA的具體步驟為1.3)取5mg-20mg修飾過的半抗原，加入10_30ul氯甲基異丁酯和5_20ul三正丁胺，在.4V反應2h，得A液；1.4)將10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸鹽緩衝液中，得B液，將其冷卻至4°C ； .1.5)將A液逐滴加入B液中，攪拌反應6h，然後過S印hadexG-100柱，PBS洗脫，收集蛋白部分，除去未反應的半抗原； .1.6)對收集的蛋白部分進行超濾杯濃縮，SDS-PAGE膠檢測，DEHA-BSA電泳條帶滯後於載體蛋白BSA的電泳條帶； .1.7)冷凍乾燥24h，凍乾粉分裝，得人工抗原DEHA-BSA。
4.如權利要求1所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟二中具體修飾的半抗原的步驟為 .2.1)取重量1:1的25-75mg脫氫表雄酮與25_75mg琥珀酸酐在室溫下反應過夜； .2.2)採用TLC薄層檢測反應產率，矽膠柱層析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脫，按每瓶50ml收集，回收溶劑，TLC跟蹤檢測，合併相同部分，用TLC與脫氫表雄酮對照，留取反應產物即為修飾的半抗原。
5.如權利要求4所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟二中利用修飾過的半抗原製備包被抗原DHEA-OVA的具體步驟為 2.3)取5mg-20mg修飾過的半抗原，加入10_30ul氯甲基異丁酯和5_20ul三正丁胺，在4V反應2h，得A液； 2.4)將10-30mg0VA溶解在l_4ml碳酸鹽緩衝液中，得B液，將其冷卻至4°C ； 2.5)將A液逐滴加入B液中，攪拌反應6h，然後過S印hadex G-100柱，PBS洗脫，收集蛋白部分，除去未反應的半抗原； 2.6)對收集的蛋白部分進行超濾杯濃縮，SDS-PAGE膠檢測，DEHA-OVA電泳條帶滯後於載體蛋白OVA的電泳條帶； 2.7)冷凍乾燥24h，凍乾粉分裝，得人工抗原DEHA-0VA。
6.如權利要求1所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟三中製備雜交瘤細胞具體步驟為 3.1)選用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每隻10_30ug，皮下多點及四腳掌初次免疫，14d後相同劑量皮下加強免疫，每2周加強I次，加強後每隔7d尾部採血，分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價，於細胞融合前3d腹腔加強免疫； 3. 2)用PEG融合處於對數生長期的骨髓瘤細胞和BALB/C小鼠腹水脾細胞，製備雜交瘤細胞。
7.如權利要求6所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟三中利用雜交瘤細胞進一步製備得到抗DHEA抗體的具體步驟為 3.3)在所述步驟3. 2)得到的雜交瘤細胞2周後用間接ELISA法檢測細胞上清液，選取P/N值最高的採用有限稀釋法進行3-4次克隆； 3.4)每次克隆後擴大培養建庫的細胞上清； 3.5)用硫酸銨沉澱法粗提單抗，用親和層析法純化分離得到特異性高的抗DHEA的抗體。
8.如權利要求1所述的脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，其特徵在於所述步驟四具體包括以下步驟 ·4.1)使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置於紫外光下輻照2小時，使PS板活化； ·· 4. 2)在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的DHEA-0VA，4°C過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理後製成包被好的酶標板； ·4.3)檢測時，依次加入不同濃度的標準品/待測標本及生物素化的抗DHEA單克隆抗體，形成標準品/待測標本中的DHEA和酶標板上包被的DHEA競爭結合生物素化抗DHEA抗體的局面，再通過生物素-親和素放大信號，以3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成DHEA的ELISA試劑盒的製備。
全文摘要
本發明公開的了一種脫氫表雄酮酶聯免疫吸附測定試劑盒的研製方法，採用脫氫表雄酮和琥珀酸酐作為原料，利用混合酸酐法，分別製備脫氫表雄酮人工抗原(DHEA-BSA和DHEA-OVA)、抗脫氫表雄酮(DHEA)單克隆抗體，進而製備酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒。通過與高效液相色譜(HPLC)法的比較，其操作步驟簡單、可一次檢測多個樣本、且不需貴重儀器、同時在檢測靈敏度、所需時間等方面均優於HPLC法。同時，相較於HPLC法ELISA方法無需使用正己烷、乙腈、甲醇等有機試劑，可減少對實驗者及環境的毒害，在環保方面更勝一籌。
文檔編號G01N33/74GK102998464SQ201110275129
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者何峰容, 李華淵, 童曉玲, 楊娟, 章秀波, 汪景, 謝正紅 申請人:武漢優爾生科技股份有限公司