一種體外高效擴增NK細胞的方法及其應用與流程

2023-05-07 09:39:46

本發明涉及細胞培養和免疫治療領域，特別涉及一種體外高效擴增NK細胞的方法及其應用。

背景技術：

自然殺傷細胞由造血幹細胞分化發育而來，屬於人體免疫細胞的一種，是具有細胞溶解作用、能夠分泌免疫調節因子的效應淋巴細胞，醫學上稱之為「人體抗腫瘤和抗感染的第一道防線」。與T淋巴細胞和B淋巴細胞不同，NK細胞無須預先接觸抗原即可殺傷靶細胞(包括細菌、病毒感染的宿主細胞和腫瘤細胞)，且其殺傷效應無MHC限制性，這種特性使得NK細胞在抗腫瘤反應和免疫監視病變細胞、癌變細胞過程中發揮著巨大的作用。大量臨床實驗數據表明，NK細胞治療在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌症治療中，起到了非常積極的治療效果。

然而，如何在體外獲得大量高純度高質量的NK細胞一直限制著NK細胞免疫治療在臨床上的廣泛應用。在健康人的外周血中，NK細胞大約佔外周血淋巴細胞的5％-10％。傳統地，通過磁珠去除外周血淋巴細胞中的T淋巴細胞，再用高劑量的細胞因子如高劑量的白介素2或飼養層細胞刺激NK細胞的方法所獲得的NK細胞表現出低擴增倍數、細胞因子依賴性、細胞衰老等問題。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種能獲得大量高純度高質量的NK細胞的方法，即利用人工抗原遞呈細胞（artifical Antigen Presenting Cell, aAPC）和細胞因子聯合刺激外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC），獲得大量高純度高質量NK細胞的方法。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種體外高效擴增NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟：

Step1.通過傳統的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將人工抗原遞呈細胞經輻照處理後，液氮凍存；

Step3.將PBMC與輻照處理後的人工抗原遞呈細胞按質量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養基的T75的細胞培養瓶內共培養，每2-3天更換新鮮培養基；

Step4.每隔7天，計算T75的細胞培養瓶內的總細胞數目，添加等細胞數目的輻照處理後的人工抗原遞呈細胞再次刺激，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞。

通過採用上述技術方案，Ficoll-Paque密度梯度離心法利用顆粒之間存在沉降係數差，在一定的離心力下，在對應梯度取得純度較高的PBMC；利用輻照後的人工抗原蛋白具有不同於普通抗原蛋白新性能；按比例添加後，人工抗原遞呈細胞與低劑量的白介素2協同作用，相較於僅使用高劑量的白介素2，能夠進一步刺激PBMC，使NK細胞在體外得到擴增，得到高純度高質量的NK細胞，通過該種方法，可進行相對大規模的NK細胞的製備，使NK細胞的臨床應用成為可能，每隔7天對細胞進行人工抗原遞呈細胞再次刺激，使PBMC分化NK細胞的過程能夠得到源源不斷地刺激，使NK細胞具有較大的擴增量，經上述方法製得的擴增後的NK細胞，具有高純度、高質量的特點，延長了NK細胞的壽命，使擴增後的NK細胞相較於未擴增前具有更好的活性功能。

作為優選，所述人工抗原遞呈細胞為K562-mb.IL21＋CD137L細胞株，其包括穩定表達細胞膜結合型的白介素21和CD137配體的K562細胞株。

通過採用上述技術方案，K562-mb.IL21+CD137L細胞株能夠在細胞膜表面穩定表達白介素21和CD137配體，同時，細胞膜結合型的白介素21的穩定效果更好，以此作為PBMC擴增的飼養細胞，能夠直接擴增NK細胞，獲得高純度且擴增量大的NK細胞，CD137配體通過與表達在NK細胞、T細胞或其他免疫細胞表面上的公刺激分子CD137結合，起到促進NK細胞、T細胞或其他免疫細胞的活化的作用。

作為優選，所述細胞膜結合型的白介素21為白介素21與跨膜蛋白或鉸鏈蛋白相連而成的融合蛋白，其結構由GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4和CD4相連而形成。

通過採用上述技術方案， GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，提供出膜信號給白介素21，引導白介素21出細胞膜；IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使白介素21在細胞膜外流動性不會過差，提升白介素21的靈活性；CD4TM為CD4的跨膜段，負責將白介素21固定在細胞膜上，使白介素21不會呈游離態脫離細胞膜表面，完整的胺基酸序列或具備其功能的胺基酸序列片段的GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4、CD4和CD137配體的胺基酸表達更加穩定。

作為優選，所述輻照處理的輻照強度為80~150Grays。

通過採用上述技術方案，處於80~150Grays輻照強度內進行輻照的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株具有其突變對NK擴增的效果較好，輻照強度過大，細胞株的突變過多，所擴增製得的NK細胞的純度較低，輻照強度過大，細胞株無法突變，無法起到提升NK細胞擴增的效果。

作為優選，所述白介素2的劑量為40~70IU/mL。

通過採用上述技術方案，白介素2計量過小或過大會導致培養基濃度過低或過高，細胞擴增和分化過程對培養基濃度要求十分苛刻，濃度過高會導致細胞失水，濃度過低細胞膜則容易漲破，均不利於細胞的擴增和分化。

作為優選，所述細胞膜結合型的白介素21和CD137配體通過T2A連接。

通過採用上述技術方案，細胞膜結合型的白介素21和CD137配體進通過T2A連接，當mb.IL21+CD137L細胞株的基因在細胞內翻譯時會在T2A區域斷裂成2個獨立的片段。

作為優選，所述K562-mb.IL21＋CD137L細胞株的細胞系內整合有慢病毒載體，所述慢病毒載體上裝載有可轉錄成上述胺基酸序列的基因序列。

通過採用上述技術方案，慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，可提供所有的轉錄並包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白，為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液後，可以直接用於宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。

作為優選，所述細胞膜結合型的白介素21和CD137配體都表達在K562細胞株的細胞系的細胞膜上。

通過採用上述技術方案，細胞膜結合型的白介素21和CD137配體在K562細胞株的細胞膜上表達，提高了NK細胞的擴增效率，使擴增後的NK細胞具有高純度的特點。

作為優選，所述擴增後的NK細胞的平均擴增的倍數為105~107，NK細胞的端粒長度要比擴增之前的NK細胞的端粒長度長8~15倍。

通過採用上述技術方案，經擴增後的NK細胞的端粒長度較擴增之前加長，通過端粒長度可以推斷NK細胞的活力與壽命，擴增後的NK細胞具有較之擴增前更長的壽命和更好的活力，其抗癌、抗衰老的效果也能得到提升。

本發明的第二個目的是提供一種體外高效擴增NK細胞的方法的應用，擴增後的NK細胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面的效果都十分好。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種體外高效擴增NK細胞的方法的應用，所述擴增後的NK細胞在抗衰老中應用具體表現為清除體內衰老細胞、病變細胞的一種或多種；所述擴增後的NK細胞在抗衰老中應用在抗病毒中的應用具體表現為治療皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨細胞病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒的一種或多種；所述擴增後的NK細胞在抗腫瘤中的應用具體表現為治療慢性髓系淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、前列腺癌、肺癌、結直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤中的一種或多種。

通過採用上述技術方案，擴增後的NK細胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面有著多種用處，且其殺傷效應無MHC限制性，這種特性使得NK細胞在抗腫瘤反應和免疫監視病變細胞、癌變細胞過程中發揮著巨大的作用。

綜上所述，本發明具有以下有益效果：

1、該種NK細胞的擴增方法以輻照mb.IL21+CD137L細胞株作為飼養細胞，添加低劑量白介素2的RPMI 1640作為培養基，以此擴增NK細胞，相較於現有技術，NK細胞擴增後的純度和細胞量都有著較大的提升；

2、經過輻照後的mb.IL21+CD137L細胞株還具有增強NK細胞端粒的效果，使擴增後的NK細胞回復活性，並增長了NK細胞的壽命，減緩了NK細胞的衰老過程；

3、該種擴增後的NK細胞除了對腫瘤細胞以及病毒細胞有著突出的清除率之外，在抗衰老方面同樣有著極佳的效果。

附圖說明

圖1是全基因合成的mb.IL21＋CD137L的基因序列示意圖；

圖2是mb.IL21+CD137L細胞株在K562細胞上表達的流式細胞圖；

圖3是擴增前後NK細胞純度的流式細胞圖，主要示出了擴增21天後，擴增細胞中CD3和CD56的表達；

圖4是NK細胞擴增倍數圖，主要示出了NK細胞在K562-mb.IL21+CD137L細胞株和低劑量白介素2共同刺激下細胞數目的變化；

圖5是擴增後NK細胞表面受體流式細胞圖；

圖6是NK細胞殺死腫瘤細胞系的殺傷圖；

圖7是擴增後NK細胞端粒長度的變化。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明作進一步詳細說明。

密度梯度離心法分離PBMC

Step1.抽取40歲中年志願者的外周血5mL置於無菌離心管中，加入0.5mL的檸檬酸鈉混勻；

Step2.加入5mL1640細胞培養液再次混勻，稀釋；

Step3.取5mL淋巴細胞分離液置於離心管中，用滴管將Step1中稀釋的血液沿管壁緩慢加入分離液上，並使血液與分離液保持兩相分離；

Step4.將離心管1800rpm/min離心25min；

Step5.用毛細吸管沿管壁插入單個核細胞層，洗出單個核細胞置於另一無菌離心管內；

Step6.加入5倍體積的1640細胞培養液，1500rpm/min，離心10分鐘，取沉澱；

Step7.重複Step6兩次後，用1640細胞培養液重懸細胞，製成細胞懸液備用。

＋CD137L細胞株的構建

參見圖1，以K562細胞株作為載體，選取包含GM-CSF signal peptide完整胺基酸序列的GM-CSF signal peptide、包含IgG4完整胺基酸序列的IgG4、包含CD4完整胺基酸序列的CD4與包含白介素21完整胺基酸序列的白介素21（IL-21）相連形成融合蛋白，該融合蛋白為細胞膜結合型的白介素21。選取包含CD137配體(CD137L)完整胺基酸序列的CD137配體，通過T2A連接細胞膜結合型的白介素21和CD137配體，合成mb.IL21＋CD137L的基因。

GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，引導白介素21出細胞膜； IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使其在細胞膜外具有一定靈活性；CD4中包含有跨膜段CD4TM，負責將白介素21固定在細胞膜上；T2A連接白介素21和CD137配體，當mb.IL21＋CD137L的基因在細胞內翻譯時，T2A會斷裂使mb.IL21＋CD137L形成2個獨立的片段；CD137配體能夠與表達在NK細胞、T細胞或其他免疫細胞表面上的公刺激分子CD137結合，促進NK細胞、T細胞或其他免疫細胞的活化。

全基因合成mb.IL21＋CD137L的基因之後，將基因裝載到慢病毒載體，包裝慢病毒，感染K562細胞，培養4天後，通過Puro、Neo、GFP等標記基因，流式細胞儀檢測mb.IL21和CD137配體在K562細胞細胞膜表面表達情況，參見圖2，篩選具有穩定表達mb.IL21蛋白和CD137配體蛋白的穩定細胞株，液氮保存篩選的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株。

細胞的擴增方法

Step1.通過傳統的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將K562-mb.IL21＋CD137L細胞株經100Grays輻照處理後，液氮凍存；

Step3. 在T75的細胞培養瓶內製備50IU/mL白介素2的RPMI 1640培養基；

Step4.將PBMC與輻照處理後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株按質量比為1:2的比例在添加到T75的細胞培養瓶內共培養，每2-3天更換新鮮培養基；

Step5.每隔7天，計算T75的細胞培養瓶內的總細胞數目，添加等細胞數目的輻照處理後的人工抗原遞呈細胞再次刺激，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞。

擴增後的NK細胞的純度檢測

參見圖3，在輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞用流式細胞儀對擴增細胞進行檢測，從圖3可知，擴增前的CD3-CD56+NK細胞比例僅佔2.09%，擴增後，CD3-CD56+NK細胞的比例約佔97%。

擴增後的NK細胞的數量檢測

參見圖4，在輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞用以自動細胞計數儀進行檢測，從圖4可知，CD3-CD56+NK細胞平均擴增的倍數為15000倍。

擴增後的NK細胞的表型檢測

參見圖5，在輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞用流式細胞儀對NK細胞表面受體中激活型受體和抑制性受體的表達情況進行檢測，從圖5可知，幾乎所有的擴增後的NK細胞都表達激活型受體，包括有NKG2D, DNAM-1, NKp46 和 NKp30。

擴增後的NK細胞對腫瘤細胞的裂解作用

參見圖6，在輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞通過鈣黃綠素釋放試驗檢測NK細胞殺死K562(人慢性髓系白血病細胞系)，A549(人非小細胞肺癌細胞系)，MCF-7（人乳腺癌細胞系），HCT116（人結直腸癌細胞系）能力，由圖可知，擴增後的NK細胞在效：靶比為10:1時，對K562、A549的細胞溶解率均達到了85%以上，對MCF-7、HCT116的細胞溶解率也達到了70%以上，由此可知，擴增後的NK細胞對上述腫瘤細胞有較強的清除效果。

擴增後的NK細胞端粒長度檢測

參見圖7，在輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續培養21天，得到擴增後的NK細胞檢測NK細胞端粒長度的變化，檢測如圖7中的實驗組所示，結果表明本發明擴增後的NK細胞的端粒長度要比擴增之前的NK細胞的端粒長度長10倍；

按照現有技術，將只使用200IU/ml白介素2的培養基作為對照組，在不添加輻照後的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株的情況下，連續培養21天，得到擴增的NK細胞端粒長度如圖7中對照組所示，要比擴增之前的NK細胞的端粒長度短15倍。

通過上述擴增方法得到的擴增後的NK細胞，具有高純度的特點，CD3-CD56+NK細胞的比例可以達到97%以上，且具有擴增效率高，21天左右的擴增的CD3-CD56+NK細胞平均擴增的倍數能夠達到15000倍以上，且擴增後的NK細胞的端粒長度比擴增之前的NK細胞的端粒長度長10倍，從端粒長度可以推斷，擴增後的NK細胞具有較之擴增前活性更強，對衰老細胞、病毒細胞、腫瘤細胞有著較佳的清除率。

本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。