新的幹擾素－胸腺肽融合蛋白及其製法和用途的製作方法
2023-05-07 00:58:01 2
專利名稱：新的幹擾素－胸腺肽融合蛋白及其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和藥物領域。更具體地，本發明涉及人α幹擾素2b(HuIFNα2b，以下簡稱IFN)與人胸腺肽(Thymosin，以下簡稱THY)的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在如病毒性感染等疾病治療和機體免疫增強中的應用。
幹擾素首先發現於1957年，即Isaaca和Lindenmann稱之為能夠誘導對同源或異源病毒性感染產生抗性的細胞產物。經過40多年的研究，幹擾素的兩個大類(IFN-α/β或稱為I型IFN和IFN-γ或稱為II型IFN)的基因、蛋白質結構及其受體基因、蛋白質結構均有了較為深入的研究。在此期間發現了許多IFN的生物活性，如誘導抗病毒狀態、抑制細胞生長、刺激細胞生長、激活自然殺傷細胞等等。然而其中抗病毒活性最為公認。IFN-α是由白細胞產生，具有較強的抑制病毒繁殖、抑制腫瘤細胞增殖，以及免疫調節等作用。目前IFN-α已被批准用於病毒性感染等多種疾病的治療。
Capon D.J.等人報導，HuIFNα2b可提高免疫能力，從而起到抗病毒治療效果(Capon D.J.，Shepard，H.M.and Goeddel D.V.，Mol.Cell.Biol.5(4)，768-779，1985)。
胸腺肽(Thymosin)，也稱胸腺素，是Abraham等於1965年首先從胸腺中分離得到的。胸腺肽是一種具有促進T-淋巴細胞分化、成熟和增強細胞免設功能的由28個胺基酸組成的多肽。該活性多肽目前已廣泛應用於治療免疫缺陷、腫瘤、病毒性感染和自身免疫病等等疾病。
因此IFN-α和THY具有相似和相輔相成的生物活性，如兔調節、病毒性感染和腫瘤等疾病的治療等。然而，目前IFN-α和THY製劑都是單獨生產，臨床上IFN-α和THY也都是單獨給藥，這樣導致了藥物成本高。此外，IFN-α和THY的製備(尤其是分離純化)也較繁瑣。
因此，本領域迫切需要開發新的具有IFN-α和THY兩者生物活性的藥物。此外，本領域還迫切需要開發成本低廉和或步驟簡便的生產工藝。
本發明的一個目的就是提供一種新的具有IFN-α和THY兩者生物活性的藥物，它是IFN-α和THY的融合蛋白。
本發明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞。
本發明的另一目的是提供一種成本低廉和或步驟簡便的生產所述IFN-THY融合蛋白的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括人α幹擾素2b的胺基酸序列、人胸腺肽的胺基酸序列、以及位於人α幹擾素2b胺基酸序列和人胸腺肽胺基酸序列之間的1-20個胺基酸的連接肽序列。
較佳地，所述的接頭序列含4-10個胺基酸。更佳地，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO2中所示的胺基酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發明上述的融合蛋白。較佳地，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID NO2中所示的胺基酸序列的融合蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體。較佳地，所述的載體包括重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus)BacITCGMCC No.0504。還提供了含有上述載體的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了一種產生本發明融合蛋白的方法，它包括步驟在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養上述的宿主細胞，或者培養含上述宿主細胞的動物，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
在本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發明的融合蛋白。
本發明人經過廣泛而深入的研究，將IFN基因和THY基因融合在一起，並在家蠶幼蟲中進行高效表達，產生IFN-THY的融合蛋白，這樣既保留了IFN的各種生物活性，又使其帶上了THY的刺激機體增強免疫的活性，使其成為一種新型的病毒性感染治療、抑制病毒複製和增強機體免疫力的藥物。
定義如本文所用，術語「幹擾素和胸腺肽的融合蛋白」、「IFN-THY融合蛋白」等可互換使用，都指由幹擾素胺基酸序列和胸腺肽胺基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。
如本文所用，術語融合蛋白中「幹擾素胺基酸序列」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的幹擾素具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然幹擾素基本上相同的生物活性。優選的幹擾素胺基酸序列包括α幹擾素，更佳地α幹擾素2b，最佳地天然的人α幹擾素2b的胺基酸序列。
如本文所用，術語融合蛋白中「胸腺肽胺基酸序列」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的胸腺肽具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然胸腺肽基本上相同的生物活性。優選的胸腺肽胺基酸序列是人的天然胸腺肽序列。
幹擾素和胸腺肽的序列可以源自人，也可以源自非人的動物。然而，優選的是人的天然序列。
如本文所用，術語「連接肽」指位於幹擾素胺基酸序列和胸腺肽胺基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度通常為1-20個胺基酸，較佳地為3-10個胺基酸，最佳地為4-6個胺基酸。技術人員可安裝本領域常規方法設計連接肽。通常，連接肽不影響或嚴重影響幹擾素胺基酸序列和胸腺肽胺基酸序列形成正確的摺疊和空間構象。
編碼本發明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴增或合成的方法獲得幹擾素和或胸腺肽的編碼DNA序列，然後將其拼接在一起，形成編碼本發明融合蛋白的DNA序列。
在獲得了編碼本發明新融合蛋白的DNA序列之後，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最後，培養轉化後的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的融合蛋白。
如本文所用，術語「載體」包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是家蠶細胞。
在獲得轉化的宿主細胞後，可在適合表達本發明融合蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出融合蛋白。然後再分離出表達的融合蛋白。
然而，更佳地的表達系統是家蠶表達系統。目前已經證明，由於有家蠶淋巴血本身的大量蛋白的保護作用，和一些未知機理的作用，家蠶表達生產的藥物，可以直接經過口服給藥進入血液循環。因此，家蠶表達生產藥物不僅可以免除病人的注射的痛苦和被感染的危險，而且可以免除藥物的分離和純化過程，大大降低藥物的生產成本。
在本發明的一個實施例中，將IFN-THY融合基因克隆入杆狀病毒轉移質粒，並提供了含IFN-THY融合基因的重組昆蟲杆狀病毒。用所述重組昆蟲杆狀病毒感染家蠶，可使家蠶產生本發明的融合蛋白。
本發明的IFN-THY融合蛋白具有IFN活性和THY活性。在一個實施例中，將家蠶淋巴血經5000rpm 5分鐘離心後取上清，直接用於IFN活性測定。結果表明，96小時表達樣品IFN活力為3.72×104IU/ml，110小時表達樣品為3.10×105IU/ml。同時還將淋巴血上清進行了胸腺肽玫瑰花結法活性測定。結果表明，24-110小時表達樣品的玫瑰花結形成率均在10％以上(見圖6)，即表明均有明顯的胸腺肽活性。
在本發明的另一方面，提供了含有外源IFN-THY融合基因的家蠶。在所述家蠶的部分或全部細胞中，含有外源的外源IFN-THY融合基因。
在本發明的另一方面，還提供了一種藥物組合物。本發明的藥物組合物包括有效量的本發明的新型IFN-THY融合蛋白，以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在製備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。製劑還可包括溼潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
組合物可製成單元或多元劑型。各劑型包含為了產生所期望的治療效應而計算出預定量的活性物質，以及合適的藥劑學賦形劑。
該藥物組合物可根據待治療的疾病並以對病人有益的劑量(取決於體重和其他考慮因素)進行施用，這可以由醫務人員確定。此外，本發明的融合蛋白還可與其他治療藥物聯用。
綜上所述，本發明的優點如下(1)以基因工程的方法製備了IFN和THY的融合蛋白，避免了化學交聯法存在的操作繁瑣、交聯效率低、產物不均一、蛋白質容易失活以及成本較高等缺點；(2)在一種載體上同時生產IFN和THY，避免了重複勞動；(3)家蠶表達的蛋白類藥物可以直接口服，避免了蛋白質分離純化的高成本操作，以及為病人解除了注射的痛苦的被感染的威脅；(4)家蠶幼蟲只需用桑葉餵養，成本很低。
家蠶幼蟲表達的IFN-THY融合蛋白，既具有IFN的生物活性，又具有THY的生物活性，是一種如病毒性感染等疾病治療和增強機體免疫的新型藥物。
圖1是IFN基因PCR擴增產物電泳圖譜。
圖2顯示了含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達質pET-IT。
圖3顯示了含IFN-THY融合基因的昆蟲杆狀病毒轉移質粒pBacPAK-IT。
圖4顯示了第二輪噬斑篩選的Southern點雜交結果。
圖5是家蠶表達產物的SDS-PAGE分析圖譜，其中泳道1-6分別是重組病毒感染後不同時間的樣品，泳道7為分子量標準物。
圖6是家蠶表達產物的THY活性的條形示意圖，其中對照為生理鹽水和BmPAK感染的家蠶血淋巴。
圖7是本發明IFNα2b/THY融合蛋白的胺基酸序列及其編碼DNA序列。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1IFN-THY融合基因的合成以及大腸桿菌表達質粒的構建為了使IFN-THY融合蛋白具有正確的空間構象，以GGGGS為連接肽使IFN和THY連接在一起。根據IFN基因序列以及連接肽的核苷酸序列，設計併合成了一對引物IFNPRI1和IFNPRI2，其核苷酸序列分別為IFNPRI15』GCCATATGTG CGATCTGCCT CAAACC 3』(SEQ ID NO3)IFNPRI25』ATGGATCCAC CACCGCCTTC CTTACTTCTT AAACTTTC 3』(SEQ ID NO4)其中，IFNPRI1為IFN成熟蛋白N端的編碼序列；IFNPRI2為IFN C端以及連接肽編碼序的互補序列。
以IFNPRI1和IFNPRI2為引物，含IFN基因的pSK-IFN質粒為模板，PCR擴增帶有連接肽核苷酸序列的IFN基因序列，在其5』端和3』端分別引入NdeI和BamHI酶切位點。PCR條件為94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共35個循環，第一個循環94℃變性5min，最後一個循環72℃延伸10min，結果獲得了約500bp的擴增產物(圖1)。
PCR產物經低熔點瓊脂糖純化後，克隆到pSK(+)的EcoRV位點中，構建質粒pSK-IFNL。經測序分析證明IFN基因和連接肽核苷酸序列完全正確。
用NdeI和BamHI雙酶切，分離pSK-IFNL質粒上的IFN及連接肽核苷酸序列，並與事先經NdeI和BamHI雙酶切的pET-28a(+)相連接，構建形成質粒pET-IFNL。
根據THY的胺基酸序列，並按真核生物偏愛的密碼子設計合成了THY1和THY2兩個片段，其核苷酸序列分別為
THY15』GGCGGATCCG GCTCTGACGC TGCTGTGGAC ACCTCTTCTG AAATCACCACCAAGGACCTG AAGGAAAAGA AGG 3』(SEQ ID NO5)THY25』CCAAGGACCT GAAGGAAAAG AAGGAAGTGG TGGAAGAAGC TGAAAACGGCTGAAGCTT 3』(SEQ ID NO6)其中，THY1為THY N端的編碼序列，引入BamHI酶切位點；THY2為THY C端編碼序列的互補序列，引入XhoI酶切位點。
將THY1和THY2兩個片段1∶1混合，加入dNTP和Klenow酶進行補平，克隆到pSK(+)的EcoRV位點中，構建質粒pSK-THY。經測序分析證明合成的THY基因序列正確。
用BamHI和XhoI雙酶切，分離pSK-THY質粒上的THY基因，並與事先經BamHI和XhoI雙酶切的pET-IFNL質粒相連接，構建含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達質粒pET-IT(圖2)。該質粒在從5』至3』方向依次含有IFN基因，GGGGS連接肽編碼序列，以及THY基因。
IFN-THY融合基因的DNA序列如SEQ ID NO1所示，其中編碼區為第1-594位。所編碼的IFN-THY融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，共198個胺基酸，分子量為22kDa。
實施例2含IFN-THY融合基因的昆蟲杆狀病毒轉移質粒pBacPAK-IT的構建將含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達質粒pET-IT先用NdeI酶切，然後用Klenow酶補平，再用XhoI酶切，用低熔點瓊脂糖分離IFN和THY的融合基因片段，並與事先經BamHI酶切並用Klenow酶補平後再用XhoI酶切的pBacPAK8相連接，構建含IFN-THY融合基因的昆蟲杆狀病毒轉移質粒pBacPAK-IT(圖3)。該質粒在從5』至3』方向依次含有IFN基因，GGGGS連接肽編碼序列，以及THY基因。
實施例3含IFN-THY融合基因的重組昆蟲杆狀病毒的獲得取5微升含IFN-THY融合基因的昆蟲杆狀病毒轉移質粒pBacPAK-IT和6微升經Bsu36I酶切線性化的修飾病毒BmBacPAK6，加入100微升無血清的TC-100培養基混均。取6微升Lipofectin加入100微升無血清的TC-100培養基混均。將兩者混勻，室溫放置15分鐘，加入800微升無血清的TC-100培養基混勻。將事先培養在35mm培養皿中的Bm N細胞用無血清的TC-100培養基洗滌兩次，並逐滴加入轉移質粒和Lipofectin混合物，27℃培養4-5天，收取上清進行第一輪噬斑篩選。取5微升上清感染35mm培養皿中的Bm N細胞，1小時後棄去上清並加入等量混合的TC-100培養基和低熔點瓊脂糖。4-5天後挑取噬斑，感染Bm N細胞3-4天，保存上清，細胞用NaOH裂解用於Southern印跡斑點雜交。取陽性克隆的上清進行第二輪噬斑篩選(見圖4，箭頭所指的噬斑)。取陽性克隆的上清感染Bm N細胞擴增，即可得到大量的含IFN-THY融合基因的重組杆狀病毒。
該重組杆狀病毒被命名為重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclearpolyhedrosis virus)BacIT，並於2000年11月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCC No.0504。
實施例4、IFN-THY融合基因在家蠶五齡幼蟲中的表達取實施例3中擴增的含IFN-THY融合基因的重組杆狀病毒，注射到五齡家蠶幼蟲體內，每頭注射10微升左右。分別取24、48、72、96和110小時表達的家蠶淋巴血，5000rpm 5min離心後取上清，用PBS pH 7.4稀釋10倍後，加入等體積的2×蛋白質上樣緩衝液，取20微升進行SDS-PAGE分析。結果表明，從24小時開始就有IFN-THY融合蛋白表達(見圖5)，IFN-THY融合蛋白的分子量為約22kDa。
實施例5IFN-THY融合蛋白的IFN活性測定採用L929細胞(小鼠成纖維細胞系)病變抑制法測定IFN活性。在96孔板中倍比稀釋待測家蠶淋巴血上清(每孔50微升，設三個重複)，隨後各孔加入50微升L929細胞懸液(4×104細胞)，設細胞和病毒對照，37℃培養24小時，棄去孔中液體，各孔加入100微升濾泡口炎病毒(VSV)懸液(250 TCID50/ml)(TCIDtissue culture infectious dose)，細胞對照孔中加入100微升培養基，培養36小時，當病毒對照孔中L929細胞幾乎全部發生病變時終止培養。棄去孔中液體，每孔加入0.5％的結晶紫液(結晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶於50ml無水乙醇，3ml甲醇，47ml蒸餾水中)200微升，置37℃15min，用自來水洗去殘餘的染料，每孔加入200微升脫色液(50ml乙二醇單甲醛與50ml蒸餾水混均)，用震蕩器震蕩，待染料完全從細胞內脫出，用分光光度計在540nm波長處比色。以下列公式計算IFN效價
結果表明，96小時表達樣品IFN活力為3.72×104IU/ml，110小時表達樣品為3.10×105IU/ml。
實施例6IFN-THY融合蛋白的THY活性測定採用玫瑰花結法測定THY活性。胸腺肽能與T淋巴系統作用，調節和增強機體的免疫功能。通過胸腺肽源激活新鮮的豬胸腺中的脫E胸腺細胞，使它與綿羊紅細胞形成玫瑰花結。取出經過與家蠶幼蟲表達後的含IFN-THY融合蛋白的淋巴血反應的胸腺細胞用油鏡觀察進行計數以視野中央淡藍色較大的細胞為淋巴細胞(即胸腺細胞)，每次數100個胸腺細胞，共數200個，統計其中的E玫瑰花結形成細胞數(結合4個以上綿羊紅細胞的胸腺細胞)，取其平均數，即為樣品或對照的讀數。按下列公式計算THY活力
測定結果如表1所示表1 IFN-THY融合蛋白的THY活性
以上結果表明，從48-110小時表達樣品均有明顯的THY活性。其活性條形示意圖見圖6。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(ii)發明名稱新的幹擾素-胸腺肽融合蛋白及其製法和用途(iii)序列數目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度604bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGTGATCTGC CTCAAACCCA CAGCCTGGGT AGCAGGAGGA CCTTGATGCT CCTGGCACAG60ATGCGTAGAA TCTCTCTTTT CTCTTGCTTG AAGGACAGAC ATGACTTTGG ATTTCCCCAG120GAGGAGTTTG GCAACCAGTT CCAAAAGGCT CAAACCATCC CTGTCCTCCA TGAGATGATC180CAGCAGATCT TCAATCTCTT CAGCACAAAG GACTCATCTG CTGCTTGGGA TGAGACCCTC240CTAGACAAAT TCTACACTGA ACTCTACCAG CAGCTGAATG ACCTGGAAGC CTGTGTGATA300CAGGGGGTGG GGGTGACAGA GACTCCCCTG ATGAAGGAGG ACTCCATTCT GGCTGTGAGG360AAATACTTCC AAAGAATCAC TCTCTATCTG AAAGAGAAGA AATACAGCCC TTGTGCCTGG420GAGGTTGTCA GAGCAGAAAT CATGAGATCT TTTTCTTTGT CAACAAACTT GCAAGAAAGT480TTAAGAAGTA AGGAAGGCGG CGGATCCTCT GACGCTGCTG TGGACACCTC TTCTGAAATC540ACCACCAAGG ACCTGAAGGA AAAGAAGGAA GTGGTGGAAG AAGCTGAAAA CGGCTGAAGC600TTGC 604(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度198個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2CDLPQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRHDFGFPQ EEFGNQFQKA 50QTIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETL LDKFYTELYQ QLNDLEACVI 100QGVGVTETPL MKEDSILAVR KYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS 150FSLSTNLQES LRSKEGGGSS DAAVDTSSEI TTKDLKEKKE VVEEAENG 198(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度26鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCATATGTG CGATCTGCCT CAAACC 26(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度38鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4ATGGATCCAC CACCGCCTTC CTTACTTCTT AAACTTTC 38(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度73鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCGGATCCG GCTCTGACGC TGCTGTGGAC ACCTCTTCTG AAATCACCAC 50CAAGGACCTG AAGGAAAAGA AGG 73(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度58鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCAAGGACCT GAAGGAAAAG AAGGAAGTGG TGGAAGAAGC TGAAAACGGC 50TGAAGCTT 58
權利要求
1.一種融合蛋白，其特徵在於，它包括人α幹擾素2b的胺基酸序列、人胸腺肽的胺基酸序列、以及位於人α幹擾素2b胺基酸序列和人胸腺肽胺基酸序列之間的1-20個胺基酸的連接肽序列。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的接頭序列含4-10個胺基酸。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的融合蛋白包括SEQ IDNO2中所示的胺基酸序列。
4.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的融合蛋白。
5.如權利要求4所述的DNA分子，其特徵在於，它包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求4所述的DNA分子。
7.如權利要求6所述的載體，其特徵在於，它包括重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus)BacIT CGMCC No.0504。
8.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
9.一種產生權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特徵在於，它包括步驟在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求8所述的宿主細胞，或者培養含權利要求8所述宿主細胞的動物，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
10.一種藥物組合物，其特徵在於，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本發明提供了幹擾素與胸腺肽的融合蛋白(IFN－THY融合蛋白),編碼該融合蛋白的DNA序列,含該DNA序列的載體,含該載體的宿主細胞,用基因工程製備該融合蛋白的方法,以及含該融合蛋白的藥物組合物。本發明的IFN－THY融合蛋白既具有IFN的活性,又具有THY的免疫刺激活性,可以用於如病毒性感染等疾病的治療和機體免疫機能增強。
文檔編號C07K14/435GK1375500SQ0110570
公開日2002年10月23日 申請日期2001年3月21日 優先權日2001年3月21日
發明者吳祥甫, 楊冠珍, 何志勇, 吳峻 申請人:中國科學院上海生物化學研究所