用於冠狀動脈粥樣硬化斑塊的反應劑及其用途的製作方法

2023-05-07 20:04:26 3

專利名稱：：用於冠狀動脈粥樣硬化斑塊的反應劑及其用途的製作方法用於冠狀動脈粥樣硬化斑塊的反應劑及其用途本發明涉及試劑及用於製備其的方法。具體而言，本發明包含針對冠狀動脈斑塊中存在的抗原的抗體或其片段。本發明進一步涉及編碼這些抗體的核苷酸序列及抗體或其片段的胺基酸序列用於免疫測定法的用途。進一步地，本發明包含涉及所述抗體或其片段的或其配體的用途的診斷和治療應用。
背景技術：
：急性冠脈症候群(還簡稱為ACS)是冠狀動脈中斑塊破裂的表徵。硬化斑塊的破裂或侵蝕，以及隨後的血栓形成和動脈閉塞可導致心肌梗死和不穩定型心絞痛(JAL"Newinsightsintoatheroscleroticplaquerupture"D.M.Braganza和Μ.R.Bennett,Postgrad.Med.J.2001；77；94-98，作為一般參考)。動脈粥樣硬化事件以充滿脂質、單核細胞衍生的泡沫細胞以及相結合的T細胞的皮下積累開始，這些形成非狹窄型脂肪條紋。隨著發展，病灶形成膽固醇酯的非細胞核心，周圍是含有平滑肌細胞(VMSC)和炎性細胞(巨噬細胞和T淋巴細胞二者)的內皮化纖維帽。新血管也呈現於晚期的病灶中並且羥磷灰石鈣沉積物也可在晚期病灶中出現(JAL"Coronarydisease:Atherogenesis:currentunderstandingofthecausesofatheroma」PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252，作為一般參考)。斑塊的細胞外脂質核心由游離膽固醇、膽固醇結晶以及衍生自浸潤了動脈壁的脂質或衍生自死亡的泡沫細胞的膽固醇酯組成。脂質核心可通過引起對斑塊肩部區域的壓力而影響斑塊；另外，脂質核心包含前血栓氧化脂質並且進一步充滿衍生自巨噬細胞的組織因子，所述巨噬細胞中的脂質核心物質在接觸循環血時具有高度的血栓形成性(見，例如，「MechanismofPlaqueVulnerabilityandRupture，，PredimanK.Shah，JournaloftheAmericanCollegeofCardiology2003；41(Suppl1)；15—22)。斑塊的穩定性還取決於斑塊的脈管平滑肌細胞(SMC)的含量，因為其能夠合成結構上重要的I型和III型膠原。相反，巨噬細胞和其他炎性細胞可釋放降解膠原和細胞外基質的基質金屬蛋白酶(MMP)，因此潛在地弱化斑塊(見「Newinsightsintoatheroscleroticplaquerupture"D.Μ·Braganza禾口Μ·R.Bennett,Postgrad.Med.J.2001；77；94-98)。纖維帽的結構組分包括衍生自SMC的基質組分如膠原、彈性蛋白和蛋白聚糖。所述的纖維帽保護斑塊的深層組分不與循環血接觸，並已經觀察到其在破裂的附近變薄。已經顯示破裂的斑塊具有相對於完整斑塊的數種組織形態學特徵。因此，當這些特徵存在時，認為其表示了對斑塊破裂的易損性。人們認為與斑塊形成相關的可能原因之一是由對內皮層反覆損傷引起的，這些損傷由以下四「大」危險因子引起吸菸、高血壓、糖尿病和高血脂症(高水平的LDL和低水平的HDL)。此外，損傷後伴隨的內皮功能紊亂在斑塊起始中起到關鍵作用，因為脂質可以更容易地從血流通過進入內膜。易損的斑塊可自發(即，無需前文提到的任何誘因的發生)或在具體事件(如極端的身體活動，嚴重的感情創傷和不同性質壓力或急性感染)之後發生破裂。斑塊破裂經常導致血栓症，具有臨床表徵為ACS。對斑塊破裂的血栓應答很可能受斑塊上暴露出的成分的促血栓性的調節；通常地，斑塊破裂發展於這樣病灶中，其具有壞死核心以及受到炎性細胞嚴重浸潤的薄的覆蓋的纖維帽。支架血栓由於血小板和壞死核心之間的物理接觸而進一步發展(見，例如，"Pathologicassessmentofthevulnerablehumancoronaryplaque'T7.D.Kolodgie^AHeart2004；90;1385-1391)。纖維帽的破裂或侵蝕使高度血栓形成性的膠原基質和脂質核心與循環系統相接觸，不可避免地導致血小板積累和活化。這一點反過來導致纖維蛋白沉積以及血栓形成，其可導致脈管閉塞，後者在如沉默期(silentepisodes)的情況下不可避免(見，例如，"Coronarydisease:Atherogenesis:currentunderstandingofthecausesofatheroma，，PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252)。直到最近，人們都認為動脈粥樣硬化是退行性且發展緩慢的疾病，通過其對血流的機械效應引起症狀，而現在理解的是其為可顯著修飾的動態炎性過程。最近對造成動脈粥樣硬化發展的細胞和分子事件的研究將注意力聚焦在決定疾病轉歸(outcome)的斑塊組分之間的動態相互作用(見，"Coronarydisease=Atherogenesiscurrentunderstandingofthecausesofatheroma，，PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252作為一般參考)。對於冠脈症候群和要評估的數種病原體之間的關係的數據之間有著顯著差異。在一項前瞻性研究中(見，例如"Impactofviralandbacterialinfectiousburdenonlongtermprognosisinpatientswithcoronaryarterydisease」RupprechtH.J.etal.,Circulation2001，Jul3；104(1):25_31)，描述了在一組1018個患者中的中風和8種不同病原體(1-2型單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus1-2)、EB__(Epstein-Barr)、UMM'MM(Cytomegalovirus)、M1^Bfifilff菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)、幽門螺方寵桿菌(Helicobacterpylori)和肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae))之間的關係；發現死亡率的增加，與6-8種病原體的血清陽性7%和12.6%有關。DePalma禾口其小組("PatientswithAcuteCoronarySyndromeShowOligoclonalT-CellRecruitmentWithinUnstablePlaque'DePalma等人Circulation2006,113:640-646)對提取自血液樣品及直接提取自急性冠脈症候群的冠脈斑塊的T細胞庫(Tcellsrepertoire)進行了研究。抗體結構存在有五種類型的抗體(也稱為免疫球蛋白)IgG、IgA、IgD、IgM和IgE。IgG的結構(在圖1中說明)包含兩條分子量約23kDa的輕鏈和兩條分子量約53-70kDa的重鏈。這四條鏈通過二硫鍵以「Y」構象互相連接。重鏈分類為Υ、η、α、δ和ε，以及一些其中的亞類，而輕鏈則分類為κ或λ。每條重鏈包含恆定區和可變區，後者處於免疫球蛋白分子的N-末端，長度大約為100個胺基酸。具體而言，免疫球蛋白(Ig)的重鏈和輕鏈中最可變的部分為第三互補決定區(⑶R3)——由V-D-J基因片段之間的連接形成的短胺基酸序列。⑶R3發現於抗原受體蛋白質(例如，免疫球蛋白和T細胞受體)與抗原形成互補的可變結構域。CDR3部分的可變性使得產生的抗體數量升高並決定哪些抗體特異性針對哪些抗原；所述可變性由V，D和J微基因在成熟B細胞生成中在骨髓中發生的重排決定。在第一次重排發生後，當成熟B細胞遇到抗原時，進一步的超突變事件使得抗體對所述特異性抗原的親和力增加。發明_既述本發明涉及重組抗體，其包含胺基酸SEQIDNO:2和4或其任何片段，作為用於鑑定動脈粥樣硬化斑塊中涉及或存在的抗原的反應劑。所述抗體優選地為IgG抗體。本發明進一步的目標是用於生產所述抗體的方法，所述方法包含在宿主細胞中製備分離的編碼SEQIDNO:2和4或其片段的多核苷酸序列。優選地，所述分離的編碼SEQIDNO2和4或其片段的多核苷酸序列為多核苷酸分子SEQIDNO:1和3或其片段。進一步的實施方式包含表達載體，其包含合適的宿主細胞中的一條或多條分離的SEQIDN01和3的多核苷酸分子，以及其互補或同源序列，這些在一起成為表達系統。本發明進一步的目標是一種測定法，其包括一條或多條對應著SEQIDN0:2和4的胺基酸序列或其任何片段及其同源序列的用途。在本發明的一個進一步的實施方式中，提供了包含本發明的抗體或其任何片段的組合物以及與其相連的用於治療或診斷目的的治療或診斷部分。本發明的進一步的目標是用於篩選和/或鑑定分子或抗原的方法，所述分子或抗原甚至是包含於複合基質如細胞或活檢樣本之內的、具有對本發明的抗體或其任何片段的結合親和力。附圖簡述圖1為IgG抗體分子及其Fab片段的結構示意圖。圖2表示用於生產抗體的重組形式。圖3表示人免疫球蛋白基因座的功能基因片段的數量。圖4為根據本發明(左，來自冠脈斑塊樣本的mRNA)以及根據現有技術(右，mRNA來自血液標本)的抗體或其片段的製備示意圖。圖5顯示了通過在細胞裂解物Ofep-2)、頸動脈裂解物、人工抗原上的生物篩查進行免疫親和力選擇的結果。圖6顯示了根據本發明的Fab68的ELISA結果。發明詳述^X在本發明中，除非另外有所提供，術語「分離的多核苷酸」或「分離的核苷酸」指的是多核苷酸分子，其中分別地，多核苷酸的和核苷酸的及多核苷酸和核苷酸以相同的意義交替地進行使用，其基本上不含通常在其天然發生環境中存在的或與其接觸的任何其他細胞物質或組分，如其他核苷酸或多核苷酸序列的片段、蛋白質或其他細胞組分。除非另外有所提供，「互補的序列」指的是在嚴格條件下與目標序列雜交的序列，產生分別在腺嘌呤和胸腺嘧啶殘基之間形成的兩條氫鍵或在胞嘧啶和鳥嘌呤殘基之間形成的三條氫鍵，以及其具有簡併性密碼子置換或沉默置換(即，一個或兩個或三個連續核苷酸的置換由於遺傳密碼的簡併性產生所編碼相同的胺基酸)的其保守類似物。在本發明意義內的分離的多核苷酸包含例如，基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、質粒、載體、分離的DNA、探針以及引物。除非另外有指出，本發明的分離的多核苷酸除了上文描述的具體情況之外，還包含其互補序列。「cDNA」指的是連續地編碼一段胺基酸序列的互補的DNA序列單鏈或雙鏈的，還指任何其同源序列以及其任何片段，即，其序列不含內含子且可通過逆轉錄技術從分離的mRNA合成。在本發明的意義內的「同源序列」指的是部分地或幾乎與目標序列同一的任何序列；因此，在那些單元為核苷酸或胺基酸時，兩條或多條序列的「同源性」或「同一性」來自對組成所述核苷酸/胺基酸序列的總單元中佔據相同位置的相同單元數目的實際測量。例如，90%的同源性指的是當兩條序列比對最大配對時，組成序列的每100個單元中有90個是同一的。在本發明內，同源序列具有至少85%，優選地90%，更優選地95%，甚至更優選地至少97%或99.5%的同一性。胺基酸的「保守性置換」預期為一種胺基酸被具有相同特性的另一種胺基酸所置換，使得這種置換對肽的總體特徵性屬性或功能沒有影響。這些保守性置換的實例包括如下屬於相同的組的一種胺基酸對另一種胺基酸的置換(i)具有帶電基團的胺基酸，包含穀氨酸和天冬氨酸，賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(ii)具有正電基團的胺基酸，包含賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(iii)具有負電基團的胺基酸，包含穀氨酸和天冬氨酸；(iv)具有芳香基團的胺基酸，包含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(ν)具有氮環基團的胺基酸，包含組氨酸和色氨酸；(vi)具有大的脂肪族非極性基團的胺基酸，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(vii)具有輕度極性基團的胺基酸，包括甲硫氨酸和半胱氨酸；(viii)具有小殘基基團的胺基酸，包括絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、甘氨酸、丙氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺和脯氨酸(ix)具有脂肪族基團的胺基酸，包含纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸；(χ)具有小的水性基團的胺基酸，包含絲氨酸和蘇氨酸。在下文的公開中，「⑶R3」為包含在重鏈和輕鏈任何區域之內的短序列，並且指的是通過編碼抗體的V-D-J基因(在重鏈中)或V-J基因(在輕鏈中)片段之間的連接形成的互補決定區。⑶R3發現於與抗原互補的可變結構域。在SEQIDN0:2和4之內，CDR3區域分別由以下片段表示CVTLGRWSSWQGGALSW和CQQYHNWPPLTF(SEQIDN09和SEQIDN010)。「單克隆」指的是編碼抗體的CDR3區域的序列，其能夠特異性結合抗原/表位。顯示相同⑶R3的序列被視為由相同的克隆產生。「克隆變體」意指任何在一個或多個核苷酸或胺基酸上有差異的序列，在與種系相比具有相同突變的V區域、同一的VDJ或VJ基因用途以及相同的D和J長度存在的情況下。「取代突變」意指引起編碼另一種胺基酸的核苷酸突變。「沉默突變」意指由於DNA簡併性而不引起所編碼的胺基酸發生改變的核苷酸突變。「表達載體」意指用於傳輸遺傳信息的核苷酸分子。「分離的表達系統」意指用於胺基酸分子表達的系統，並且會包括包含了編碼一種或多種本發明的胺基酸分子的核苷酸序列的一種或多種表達載體，以及轉染入所述一種或多種載體的適合的宿主細胞。關於本發明的「宿主細胞」意指包含一種或多種本發明的表達載體的細胞，且其能夠例如通過將其表達在它的表面而產生對應的編碼的一種或多種胺基酸序列或其任何片段。根據本發明的「抗體」和「抗體片段」旨在包括IgG、IgA、IgD、IgM或IgE類型的完全抗體(也稱為免疫球蛋白)以及其任何片段，如蛋白水解和/或重組片段——如Fab片段(在用木瓜蛋白酶消化Ig時產生)、F(ab』)2(在用胃蛋白酶消化免疫球蛋白時產生)、Fab』、Fv、單鏈抗體(scFv)以及抗體的單鏈，例如，單鏈的重鏈或輕鏈。本發明之內的「配體」意指任何結合本發明的抗體的識別功能區域或其任何片段的試劑。根據本發明的「寡肽」為包含少於50個胺基酸殘基的胺基酸序列。在以下的描述中除非另外有所提供，「種系」序列意指編碼抗體/免疫球蛋白的序列或其任何不含突變的片段，因此，同源性的百分比為與抗原接觸後任何類型的重鏈部分經歷的突變事件的表示；更具體地，所述突變涉及抗體/免疫球蛋白的CDR3部分或其任何片段。"RS突變」比率指的是發生於抗體/免疫球蛋白編碼序列中FR或⑶R3部分的取代(R)和沉默⑶突變之間的比率。⑶R3的所述比率高於FR序列的比率，因為⑶R3經歷較高數量的突變事件以適應抗原的結構。相反，FR通常是更保守的序列。僅「ρ值」表示突變事件的顯著性。具體而言，重排V片段的體細胞超突變以及抗原選擇具有更高親和力的突變體的過程使親和力成熟得以進行，以產生對抗原具有提高的結合特性的抗體。此過程導致了CDR區域中取代突變(R)的積累，其直接參與抗原的結合。相反，沉默突變(在FR區域中積累，其通常為更保守的序列，以維持抗體的構象。在沒有抗原選擇的情況下，隨機的突變過程在抗體的重鏈和輕鏈的序列中產生R和S突變的隨機分布。然而在選擇過程中，CDR3中RS突變比率通常高於FR序列的比率。因此，ρ值與抗原選擇過程的概率相關，其通過意外發生突變的過量(如CDR)或稀缺(如FR)的多重正態分布模型而計算。低的ρ值表示相比於對應種系序列，重鏈和輕鏈變異概率高，這是由於抗原驅動的抗體親和力成熟。顯著的P值預期為低於5%。根據本發明的第一個方面，提供了用於製備抗體的方法，所述抗體包含在重鏈可變區對應於SEQIDNO2並在輕鏈可變區域對應於SEQIDNO4的胺基酸序列，以及其同源序列，以及通過多核苷酸分子表達獲得的具有保守性置換的任何序列或其片段。優選地，所述多核苷酸序列包含SEQIDNO:1和3以及與其互補和同源的序列。本發明的多核苷酸序列編碼抗體的胺基酸序列或其任何片段，其結合於可能發現於冠脈斑塊中的抗原或其任何片段。優選地，在本發明之內，上文的實施方式中分離的多核苷酸為根據本領域熟知步驟通過逆轉錄獲自mRNA的cDNA分子。如所指出的，這些定義預期包含類似序列，以便包括其中在胺基酸序列的情況下至少一個或多個胺基酸被衍生物(如對應的D-異構體或，例如，對應的硫酸化、糖基化或甲基化的胺基酸)所置換的那些序列；或構成序列的總胺基酸中的一個或多個或多至10%可由其衍生物置換——例如，半胱氨酸可由同型半胱氨酸置換。還包括具有保守置換的序列。根據本發明，還包括的是編碼根據本發明第一個實施方式的抗體或其任何片段的多核苷酸序列，在使用ImMunoGeneTics(通過網址http://imgt.cines.fr可得)中可得的資料庫時，其相比於種系具有至少80%，優選地至少90%，更優選地至少95%以及甚至更優選地97%的同源性。另外，對於本發明的第一個目標，超突變的胺基酸序列也包含在內。因此，還包括編碼胺基酸序列(其具有的上文提到的⑶R3部分的ρ值低於5%，優選地低於2%，更優選地低於1%，甚至更優選地低於1%。)的多核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列。如前文確定的，根據本發明，包括cDNA分子的合成，這是在分離自患者活性冠脈斑塊的合適樣品的mRNA上進行。為了本發明的目的，所述活性冠脈斑塊的合適樣品包括在梗死事件後立即取得的冠脈斑塊樣品，即，所謂「新鮮樣品」或，備選地，可取得樣品並在液氮條件下保藏一段合適的時間，以不妨害或改變其組織學特性並用於進一步分析。為了本發明的目的，選擇患有急性冠脈症候群(ACS)的患者，其經歷了在入院48小時之內發生的典型性胸痛或ECG變化，這些提示了心肌損傷。為了排除可能的混淆因子，有近期感染性疾病、免疫學障礙、免疫抑制治療或腫瘤疾病的患者已經排除。從上文的合適的樣品中(即，從冠脈斑塊和外周血)中分離mRNA這是根據熟知方法進行的。見例如Molecularcloning.Sambrook禾口Russell.ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NewYork.ThirdEdition2001作為參考。根據第二個實施方式，本發明的表達載體選自例如質粒、粘粒、YAC、病毒顆粒或噬菌體，並包含一種或多種根據本發明第一個實施方式的多核苷酸序列；在一個優選的方面，表達載體為質粒，其包含一種或多種根據本發明第一個實施方式的多核苷酸序列。在本發明一個最優選的實施方式中，表達載體(即，質粒)包含多核苷酸SEQIDNO1和3。然而，根據遺傳密碼的簡併性和在其中實現重組表達的各個生物體中偏好密碼子的用途，任何編碼SEQIDN02和4的多核苷酸序列被視為包含在本發明範圍之內。表達載體通常還包括複製起點，可操作性連接(即，以在引入細胞時核酸序列表達得以進行的方式連接其上)的位於編碼序列上遊的啟動子，以及核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺嘌呤位點和轉錄序列。本領域技術人員將能夠構建適當的表達載體，並因此根據所選擇的宿主細胞構建任何適當的表達載體；例如，通過選擇可以由宿主生物體識別的啟動子而構建。在一個甚至更優選的實施方式中，本發明的表達載體以Burioni等人(HumanAntibodies2001；10(3-4):149-54)描述的載體為代表。根據本發明的分離的表達系統可包含單一的表達載體，其包含一種或兩種本發明多核苷酸序列。備選地，上文的表達系統可包含兩種或多種表達載體，其中每種都包含本發明多核苷酸分子的任何一種。例如，表達載體可包含編碼抗體的輕鏈或其片段的本發明的多核苷酸分子，第二種表達載體可包括編碼抗體的重鏈或其片段的本發明的多核苷酸分子。在本發明的一個實施方式中，表達系統包含單一的表達載體，其包括一種或多種包含SEQIDNO:1-3且編碼胺基酸序列SEQIDNO:2_4的多核苷酸分子或具有相同抗原特異性的其任何片段以及其任何同源序列。在本發明一個優選的實施方式中，表達系統包含一種表達載體，其包含編碼輕鏈(即，SEQIDNO3)的多核苷酸序列和第二種編碼重鏈(即，SEQIDNO1)的多核苷酸序列。備選地，表達系統可包含合適的框架用於⑶R3胺基酸序列SEQIDNO:9或SEQIDNO10的表達，其具有與完全抗體相同的特異性。根據此實施方式，任何編碼SEQIDN09和10的核酸序列都包含在本發明之內，儘管優選的序列為發現於SEQIDN01和3之內的那些序列。製備本發明表達系統之內的表達載體包括根據本領域熟知的方法將恰當的核酸分子插入一種或多種載體，所述載體通常包含一條或多條信號序列、複製起點、一種或多種標誌基因或序列、增強子元件、增強子，以及轉錄終止序列。作為所述步驟的一般參考，見例如Phagedisplay,ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork。例如，編碼本發明重鏈的序列與Flag或六組氨酸尾巴一起轉入表達載體，用於更容易地檢測或純化。根據本發明第四個實施方式的宿主細胞可以為例如原核細胞或真核細胞。合適的原核細胞包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，且可包括例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸埃希氏菌(E.coli))，腸桿菌屬(EntercAacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，變形桿菌屬(Proteus)，沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，以及志賀氏菌屬(Shigella)，還有芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.Iicheniformis)，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，以及鏈黴菌屬(Str印tomyces)。例如，可以使用的公開可得的菌株為例如，大腸桿菌K12株MM294(ATCC31，446)；大腸桿菌X1776(ATCC31，537)；大腸桿菌株W3110(ATCC27,325)以及K5772(ATCC53，635)或大腸桿菌XLl-Blue，其代表著優選的大腸桿菌株。除了原核細胞，真核微生物如絲狀真菌或酵母是合適的宿主細胞。通常使用的是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，也已知為普通麵包酵母(commonbaker，syeast)；其他酵母為例如，糖酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母(Pichiapastoris)，或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母(K.Iactis)、脆弱克魯維酵母(K.fragilis)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)、維克拉姆克魯維酵母(K.wickeramii)、K.waltii、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)以及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)如裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，耳口子囊菌酵母屬(yarrowia),漢遜酵母屬(Hansenula),瑞氏木黴屬(Trichodermareesia),粗糙鏈孢黴(Neurosporacrassa)，許旺酵母屬(ktiwanniomyces)如西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)，鏈抱黴屬(Neurospora)，青黴屬(Penicillium)，彎頸黴屬(Tolypociadium)，麴黴屬(Aspergillus)如構巢麴黴(A.nidulans)，假絲酵母屬(Candida)，球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Iihodotorula)。另外，用於製備表達系統的合適的真核細胞可衍生自多細胞生物體，如來自無脊椎動物細胞或植物細胞。植物細胞包括例如根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和菸草(Nicotianatabacum)。另外，可使用昆蟲細胞，其包括例如果蠅(Drosophila)S2以及斜紋夜蛾(Spodoptera)Sf9。相反地，哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細胞。更具體的實例包括SV40轉化的猴腎CVI系(C0S-7，ATCCCRL1651)；人胚腎系、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR、小鼠支持細胞(Sertolicell)、人肺細胞(W138,ATCCCCL75)；人肝細胞(HepG2，HB8065)；以及小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51)。對恰當宿主細胞的選擇被視為在本領域技術人員的知識之內，S卩，原核細胞可用於製備抗體片段如Fab，而對於完全抗體如IgG的製備，可採用真核細胞如酵母。在根據本發明的抗體定義中包括任何適合於表達輕和/或重鏈可變鏈或其特異性CDR(例如Fab片段、F(ab，)2、Fab，、Fv和單鏈抗體(scFv))的腳手架蛋白。用於細胞轉染和轉化以製備包含上文表達系統的上文公開的宿主細胞的方法取決於所使用的宿主細胞並在本領域技術人員的一般知識之內。例如，用鈣或電穿孔處理通常用於原核細胞，而用根癌農桿菌轉染用於特定植物細胞的轉化。對於哺乳動物細胞，可使用磷酸鈣沉澱，如Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)所公開的。然而，用於將多核苷酸序列引入細胞的其他方法例如核顯微注射、電穿孔、細菌與完整細胞的融合、或多聚陽離子也可使用。另外，宿主細胞也可移植入動物以產生轉基因的非人動物，用於製備人源化抗體或其片段。優選的非人動物包括，例如，小鼠、大鼠、倉鼠。根據本發明的一個實施方式，生產重組抗體及其片段是根據本領域已知的方法進行的，包括本發明的分離的多核苷酸序列的用途。具體而言，所述方法包括如下步驟a)在任何一種上文公開的合適的宿主細胞中，製備包含一種或多種編碼胺基酸SEQIDNO2和4且優選地具有SEQIDNO:1和3的cDNA分子的表達系統；b)在合適的生長條件下培養宿主細胞；c)回收和/或純化所生產的具有胺基酸SEQIDNO:2和4或其任何片段的抗體或其任何片段。在上文描述的方法中，片段優選地為具有SEQIDNO:9CVTLGRWSSWQGGALSW和SEQIDNO:10CQQYHNWPPLTF的⑶R3片段，其可在任何一種上文公開的宿主細胞中的合適腳手架蛋白中表達。合適的腳手架蛋白通常衍生自人抗體，其中，在可變區由本發明的⑶R3區域取代先前存在的CDR3。微抗體(minibody)或kFv框架也用於CDR3的表達。包含表達系統的宿主細胞在合適的生長條件下生長，然後回收和/或純化如此生產的抗體或其任何片段用於進一步用途。為了評估統計學發生的突變或其它不同於參與冠脈斑塊B細胞成熟的機制對所獲得的結果的影響，還在一小部分具有保守區域的基因上進行克隆和測序。因此，作為內部參考物，選擇β-球蛋白基因；具體而言，使用了標準β-球蛋白L48931。因此，本發明的一個進一步的目標是本發明的宿主細胞並根據上文公開的方法產生的分離的重組抗體和其片段，包括IgG型的免疫球蛋白(簡稱為Ig)，而「其片段」優選地包括IgG的Fab片段。根據本發明，還包括編碼抗體或其任何片段的胺基酸序列，其可根據上文公開的方法產生，並且當使用ImMunoGeneTics(通過網址http://imgt.cines.fr可得)中可得的資料庫時，相比於種系具有至少80%、優選地至少90%、更優選地至少95%甚至更優選地至少97%的同源性。此外，還包括胺基酸序列，其具有的⑶R3部分的ρ值低於5%、優選地低於2%、更優選地低於1%，甚至更優選地低於1%。。本發明的一個進一步的具體實施方式表示為一種測定法，優選地是一種免疫測定法，其包含根據本發明的抗體或其任何片段的用途。免疫測定法是基於抗原/抗體複合物的形成的測試，可以是競爭性的或非競爭性的。競爭性免疫測定法包括測試未知樣品，其含有與另一種抗原競爭結合於抗體(優選地為標記的抗體)的具體抗原；因此，應答情況與未知樣品中抗原濃度成反比。相反地，非競爭性免疫測定法——也稱為「三明治測定法」——包括使用如本發明公開的固定化抗體，其被抗原結合而形成標記抗體靶向的複合物；因此所述方法的結果直接與抗原濃度成比例。廣泛使用的免疫測定法包括，例如，RIA(放射免疫測定法)、Western印跡、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、免疫染色、免疫沉澱、免疫電泳、免疫螢光、發光免疫測定(LIA)、免疫組織化學，這些在實驗室實踐中常規使用。根據本發明的一個優選的免疫測定法是ELISA測試。ELISA是一種已經成熟建立的生化技術，其使得能夠在給定樣品中檢測並進一步定量生物分子，如抗體或其片段、抗原、蛋白質、激素和其他有機分子；優選地，根據本發明，上文提到的ELISA測試用於使用包含SEQIDNO2和4或備選地包含SEQIDNO9和10的抗體或其片段檢測特異性抗原。ELISA測試，具體而言，可包括使用兩種抗體，其中一種固定在ELISA板上，選擇性針對目標分子——抗原。此抗體優選地為根據本發明的一種抗體。加入可能含有目標分子，甚至是在複合物基質如細胞或組織裂解物之內包含目標分子的混合物，使其孵育一段合適且足夠的時間，然後進行第一次洗滌以移除未結合物質。進一步加入偶聯於酶的二抗，其特異性針對目標分子與一抗之間形成的複合物。接著進行ELISA板的第二步洗滌步驟並加入顯色底物。所得的顏色變化可通過光譜光度測量技術評估並通過比色標準曲線與所形成的複合物的量直接相關，因此與樣品中目標分子濃度相關。要通過上文的本發明的免疫測定法測試的樣品為，例如，在梗死事件發生後立即分離自患者的不穩定型冠脈斑塊的樣品，即，如前文所述的所謂「新鮮」樣品，或在取得後已經在液氮下保藏的樣品；備選地，樣品可由全血、血清、培養的細胞(即，細胞系或其裂解物)構成。有用的細胞係為例如，H印2(ATCC號CCL-23)、U87(ATCC號HTB14)、MRC5(ATCC號CCL-171)，這些細胞或受到病原體(S卩，病毒如CMV)感染或未受感染，或者受暴露出合成肽的分子文庫或暴露出病原物抗原的文庫。細胞系用於抗體篩選的用途已經在例如^ckU.等人AnnNYAcadSci.2009Sep；1173:166-73中描述。還可根據上文的實施方式進行免疫組織化學測定法來研究本發明中鑑定和公開的配體在斑塊內部存在情況。如上文所述的，本發明的免疫測定法可設計用於競爭性地鑑定涉及與冠脈疾病相相關的動脈粥樣硬化斑塊的發展的抗原。根據本發明的免疫測定法代表了用於在動脈粥樣硬化斑塊中鑑定抗原的極其重要的工具，其代表了在篩選具有發展急性冠脈症候群(ACQ或其他冠脈疾病的風險的人群中有價值的診斷或預後工具。根據本發明的一個進一步的實施方式，公開了一種治療組合物，其包含本發明的抗體或其任何片段，以及與其共價相連的治療部分。所述治療組合物選擇性地將治療試劑靶向冠狀動脈粥樣硬化斑塊位點。所述靶向的組合物的熟知優勢包括，減少要施用的活性要素的量的可能性，這樣減少了其潛在的副作用等等。為了所述的目的，治療部分可包括，作為非限制性實例，放射性核素、藥物、前體藥物、激素、激素拮抗劑、受體可溶性受體、受體拮抗劑、酶或由另一種試劑激活的原酶、細胞因子、抗微生物試劑或毒素。本發明一個進一步的實施方式涉及診斷組合物，其包含連接於診斷部分的本發明的抗體或其任何片段，用於觀察冠脈斑塊位點。根據本發明的診斷組合物包含根據本發明的抗體或其任何片段，其共價連接於至少一種能夠選擇性靶向冠脈斑塊位點進行定位的診斷部分。因此，有可能精確地定位冠脈斑塊發展的位點及甚至更好地理解管壁上發生的病灶程度。此外，其可為手術移除斑塊之前的非常有用的工具。診斷部分使得能夠通過醫學領域使用的可視化技術進行檢測，例如，MRI(磁共振成像)、CT(計算機斷層成像)、超聲、描述生態學、X-光以及其他在本領域技術人員知識之內的診斷技術。診斷部分會根據所選擇的診斷技術而選擇。根據本發明的免疫測定法的一個實施方式，本發明已經使得能夠鑑定配體，所述配體定義為結合於靶標抗體或其任何片段的任何表面或內部序列或構象結構域或任何其他部分的試劑，且可包含除了能夠結合目的靶標之外沒有明顯生物學功能的試劑。在一個優選的實施方式中，本發明的配體為寡肽，優選地包含4-12個胺基酸，更優選地為包含4-10個胺基酸的肽，甚至更優選地為包含6-8個胺基酸的肽，在SEQIDNO5_8(人工抗原)之內或對應著具有所述序列的肽。備選地，所述肽可用於免疫測定法以競爭性地鑑定涉及與冠脈疾病相相關的動脈粥樣硬化斑塊發展的抗原。給出以下實施例以更好地理解本發明而不對其產生任何限制。實驗部分實施例1樣品收集從患有急性冠脈症候群並經歷了冠狀動脈斑塊旋切術的患者的動脈粥樣硬化斑塊中獲得足夠量的組織(通常大約1-2毫克)，並儲存於液氮中。實施例2:mRNA提取將根據實施例1取得的斑塊均質化並根據傳統方法學提取總mRNA，根據製造商提供的說明書使用mRNA提取的商業化試劑盒(foieasykit,Qiagen,Germany)進行。實施例3:mRNA逆轉錄得到患者知情同意後，根據製造商說明書使用mRNA逆轉錄的商業化試劑盒SuperscriptIIIRT(Sigma-Aldrich,StLouis，Missouri)，對如實施例2中獲得的冠脈斑塊樣品進行mRNA的逆轉錄。根據標準步驟以寡(dT)為引物從總mRNA進行cDNA的合成。實施例4:cDNA序列擴增將1μ1獲自實施例3的cDNA用於多聚酶鏈式反應。將逆轉錄引物設計為分別與編碼重鏈和輕鏈恆定區的序列片段退火。正向引物為「家族特異性的」，並且設計為對應於第一框架區中重鏈和輕鏈基因的5』末端；見Phagedisplay,ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork.ThirdEdition2001,作為參考。對於重鏈，使用的是特異性針對IgGl和IgG2同種型的引物，而對於輕鏈則使用了特異性針對K同種型的引物。用以下的溫控形式進行擴增輪94°C以15秒，52°C以1分鐘及72°C以90秒。反應進行35個循環。每個反應中包括了陰性對照(不含DNA的相同混合物)以及陽性對照(插入已知序列)。通過電泳在含有溴化乙啶的2%的瓊脂糖膠中對PCR產物進行分析。反應產生了對應輕鏈的Ξ650bp條帶，以及對應重鏈的700bp條帶。根據製造商的說明書使用DNA提取的商業化試劑盒(QIAquickgelextractionkit；Qiagen,Germany)從膠中提取擴增子(即，PCR過程的產物)。最後，根據標準方法回收PCR產物。實施例5分子克隆及組合抗體Fab片段噬菌體展示微型庫將根據前一實施例擴增自人冠脈斑塊的構成Fab的重鏈和輕鏈的PCR產物(可變區和CHl結構域)克隆入噬菌體載體(PRB32)，這使得重鏈和輕鏈對組合產生並將由含在病毒顆粒內的DNA編排的Fab片段暴露(噬菌體展示)至外部噬菌體表面。這是通過將重鏈片段與噬菌體M13膜蛋白融合獲得的。這樣能夠產生組合的抗體Fab片段噬菌體展示微型庫。實施例6細胞裂解物製備在用HCMV(Μ0Ι0，1)感染5天後，獲得感染的和非感染的MRC5及H印_2細胞裂解物。H印-2(ATCCCCL-23)細胞在補充有Antibiotic/AntimycoticSolution(Invitrogen,Antibiotic/AntimycoticSolution,liquid15240—062)禾口10%FBS的E-Mem(Invitrogen0820234DJ)中生長。細胞規律地每5天以110分盤。將五百萬個細胞在PBS中洗滌並通過使用RIPA緩衝液(50mMTrisHCLpH8+150mMNaCl+1%NP-40+0.5%NAdeossicolate+0.1%SDS)進行裂解。糕仿丨丨7:^拋料勿、λ工·卜搬纏碰行免疫親和力詵擇在生物篩查前一夜，於4°C以50μL/孔的溶於包被緩衝液中(0.IM碳酸氫鹽ρΗ=8.6)的抗原(IOOng/孔)溶液包被ELISA板0/N。用3%的PBS/BSA將用去離子H2O洗滌過的孔完全封閉，將其密封並在溼潤的容器中於37°C孵育1小時。將50μL的噬菌體懸液加入各孔(總共大約IO11PFU)並在板密封后於37°C孵育至少2小時。從各孔移除噬菌體(並保存用於滴定)，用0.05%的PBS/Tween洗滌10次。在充分洗滌後，通過用50μ1的洗脫緩衝液(0.IMHC1，甘氨酸調整至pH=2.2，BSAlmg/ml)並向洗脫液中加入3μ1的2ΜTris鹼，洗滌各孔而洗脫結合於抗原的噬菌體。洗脫後，用洗脫的噬菌體感染2ml新鮮的XL-Iblue。在37°C孵育15min後，加入IOml的37°C預熱的Superbroth(SB)(20μg/ml氨苄青黴素和10μg/ml四環素)。在37°C於搖床上孵育1小時後，將IOOml含有100μg/mlAmp和10μg/mlTet的SB加入每份IOml培養物中，並在37°C於搖床上孵育1小時後。使用輔助噬菌體VCSM13(總共IO12PFU)感染培養物並在37°C於搖床上孵育2小時。在加入卡那黴素(μg/ml)後，將培養物在30°C於搖床上孵育0/N。第二天，在4°C以6000RPM(SorvallSS34)，15分鐘離心下細胞，並將PEG8000(Sigma-Aldrich)加入上清至終體積20ml。使噬菌體在冰上沉澱30分鐘，然後在4°C以11，000RPM(SorvallSS34)離心20min。然後在2ml的PBS/BSA中重懸噬菌體，並儲存於4°C用於隨後的生物篩查輪。在每次洗脫和每輪選擇後，通過將以1μ1和0.1μ1的噬菌體感染的細菌群體塗布於LB平板(總量的10_4和10_5稀釋)上來滴定洗脫的噬菌體。通過在每輪選擇後滴定洗脫的噬菌體，能夠估計富集步驟的效力。將此步驟重複四次使得能夠對所選擇群體的進行富集。結果顯示於圖5。實施例8=Hep-2即人工抗原上的生物篩杳步驟後對所選擇的克隆的分析在所有生物篩查步驟中，本發明的Fab被選擇，並且其在第四輪後回收的噬菌體群體中佔主導。實施例9測序對根據前面實施例獲得的克隆進行測序用於定量和定性分析。9.1)重鏈和輕鏈樣品加工挑選獲自冠脈斑塊樣品(根據實施例4獲得)的重鏈和輕鏈克隆的樣品，以使用BigDye化學測序並使用ABIPRISM3100測序儀進行分析。使用在ImMunoGeneTics(通過網址http://imgt.cines.fr可得)可得的資料庫將所獲得的序列各自與種系片段比對，以分別鑑定重鏈和輕鏈的V、D、J及V和J基因的復發情況、其與種系的同源性水平以及體細胞突變的程度。將CDR3的序列同一性用於鑑定克隆；如上文提到的，具有相同CDR3序列被視為衍生自相同的克隆。來自根據上文實施例4獲得冠脈斑塊樣品的多核苷酸序列，對於重鏈對應於SEQIDNO:1且編碼對應於SEQIDNO:2的胺基酸序列。來自根據上文實施例4獲得冠脈斑塊樣品的多核苷酸序列，對於輕鏈對應於SEQIDNO3且編碼對應於SEQIDNO4的胺基酸序列。9.2)β-球蛋白序列內部參考物對五個克隆的分析顯示所獲得的球蛋白序列與資料庫中存在的序列相同，這樣表明了此過程沒有引入突變事件。9.3)來自冠脈斑塊樣品的輕鏈來自根據實施例4的冠脈斑塊樣品的克隆測序的結果顯示於下文表I。對於每個克隆，V、D和J基因欄分別報告了被認為是編碼了重鏈的V、D和J可變部分的序列類型。同源性百分比指的是克隆自冠脈斑塊樣品的序列和如上文公開的對應種系序列之間的同源性的百分比。表I權利要求1.用於鑑定冠狀動脈粥樣硬化斑塊中的抗原的重組抗體，其包含胺基酸SEQIDNO2和4，或其任何片段。2.根據權利要求1的重組抗體，其中所述胺基酸序列片段為SEQIDNO:9或SEQIDNO:10。3.用於製備根據權利要求1-2中任一項的重組抗體的方法，其包含步驟a)製備用於宿主細胞的表達系統，其包含編碼SEQIDNO:2和4或其任何片段，優選地多核苷酸SEQIDNO:1和3或其任何片段的兩條多核苷酸分子；b)在合適的生長條件下培養所述宿主細胞；c)回收及純化包含SEQIDN02和4，或其任何片段的抗體。4.權利要求3的方法，其進一步包含步驟d)，其中確定了對選自以下的樣品的結合情況分離的動脈粥樣硬化斑塊、細胞系、細胞系裂解物或生物學樣品。5.權利要求4的方法，其中所述細胞系選自H印2(ATCC號CCL-23)、U87(ATCC號HTB14)、MRC5(ATCC號CCL-171)，其受或不受病原體感染。6.根據權利要求3-5中任何一項的方法，其中步驟c)中，所述的片段分別是SEQIDNO9或10。7.根據權利要求3-6中任何一項的方法，其中宿主細胞選自原核、酵母和真核細胞。8.根據權利要求7的方法，其中原核細胞選自腸桿菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、鏈黴菌屬、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌。9.根據權利要求6的方法，其中酵母細胞選自糖酵母屬，畢赤酵母，克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母、脆弱克魯維酵母、保加利亞克魯維酵母、維克拉姆克魯維酵母、K.waltii、果蠅克魯維酵母、耐熱克魯維酵母、以及馬克斯克魯維酵母，裂殖酵母屬如裂殖酵母，耶子囊菌酵母屬，漢遜酵母屬，瑞氏木黴，粗糙鏈孢黴，許旺酵母屬如西方許旺酵母，鏈孢黴屬，青黴屬，彎頸黴屬，麴黴屬如構巢麴黴，假絲酵母屬，球擬酵母屬和紅酵母屬。10.根據權利要求7的方法，其中真核細胞選自中國倉鼠卵巢(CHO)、SV40轉化的猴腎CVI系(C0S-7，ATCCCRL1651)、人胚腎系、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR、小鼠支持細胞、人肺細胞(W138，ATCCCCL75)；人肝細胞OfepG2，HB8065)；以及小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；植物分離的重組宿主細胞如根癌農桿菌和菸草；昆蟲重組的分離細胞如果蠅S2和斜紋夜蛾Sf9。11.根據權利要求1-2中任何一項的抗體在免疫測定法中用於檢測冠狀動脈粥樣硬化斑塊中相關抗原的用途。12.根據權利要求11的用途，其中所述的免疫測定法選自RIA(放射免疫測定法)、Western印跡、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、免疫染色、免疫沉澱、免疫電泳、免疫螢光、發光免疫測定法(LIA)、免疫組織化學。13.根據權利要求11-12中任何一項的用途，用於在分離自患者的樣品中診斷急性冠脈症候群(ACQ或篩查患有急性冠脈症候群(ACQ風險的群體。14.用於鑑定結合於根據權利要求1-2中任何一項的重組抗體或其任何片段的配體的方法，包括以下步驟a)將所述抗體或其任何片段結合至固相；b)通過一次或多次洗滌步驟移除未結合的物質；c)將候選的配體與步驟a)中製備的固相接觸，並使所述候選配體和固相孵育一段合適的時間；d)通過一次或多次洗滌步驟移除未結合的物質；e)加入特異性針對步驟a)的抗體與結合於其上的候選配體的複合體的二抗；及f)鑑定與步驟a)的抗體結合的配體。·14.權利要求14的方法，其中候選配體包含在生物學樣品之內。15.根據權利要求15的方法，其離體或在體外進行，其中所述樣品選自全血、血清、冠脈斑塊活檢組織、全細胞或其裂解物。16.根據權利要求14的方法，其中候選配體包含於分子庫之內。17.權利要求15的離體或體外方法，用於診斷患者中的急性冠脈症候群(ACS)或篩查患有急性冠脈症候群(ACQ風險的群體。全文摘要本發明公開了能夠結合於分離的冠脈斑塊樣品的抗體或其片段，以及使用含有編碼所述抗體或其片段的DNA序列的宿主細胞生產其的方法。還描述了用於篩選所述分離的樣品的配體的方法，並且也提供了含有所述抗體的組合物。文檔編號C07K16/18GK102317317SQ201080007471公開日2012年1月11日申請日期2010年3月17日優先權日2009年3月19日發明者M·科勒蒙提,R·布廖尼申請人:伯拉考成像股份公司